Summary
正確に高分解能質量分析計を接続した液体クロマトグラフィーによる定圧ラベリング、広範な分別、バイオインフォマティクス ツールの組み合わせで品質管理手順と蛋白質を量的にプロトコルを提案します。
Abstract
多くの例外的な進歩は、質量分析法 (MS) で行われている-基づくプロテオミクス、液体クロマトグラフィー (LC) における特定の技術進歩とタンデム質量分析法 (MS/LCMS) と定圧ラベル多重能力に結合します。広範な LC/クロマトグラフィー-タンデム質量プラットフォームと正確に全体のプロテオームを量的に後 MS 計算干渉補正 10 プレックス タンデム質量タグ (TMT) ラベルを組み合わせた深いプロテオミクス プロファイリング プロトコルを紹介します。このプロトコルには、次の主要な手順が含まれています: 蛋白質の抽出と消化、TMT がラベル付け、2 次元 (2 D) LC、高分解能の質量分析法および計算のデータ処理。品質管理手順、トラブルシューティングおよび実験の変化を評価するため含まれています。哺乳類の試料中の 10,000 以上のタンパク質は、このプロトコルで自信を持って測定することができます。このプロトコルは、軽微な変更と翻訳後修飾の定量にも適用できます。この多重化、堅牢なメソッドは、さまざまな複雑なサンプル、培養細胞、動物組織、ひと臨床検体などのプロテオーム解析のための強力なツールを提供します。
Introduction
次世代シーケンシング技術の進歩は、生物学的システムおよび人間の病気を研究するための新しい風景につながっています。これは、ゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、メタボローム、具体的になって他の分子システムの測定の数が多いを許可しています。質量分析法 (MS) 分析化学における最も敏感な方法の 1 つで、プロテオミクスの応用は人間のゲノムの配列の後急速に拡大しています。過去数年間プロテオミクス分野で MS ベースの定量的分析を定圧ラベリングと計測に加え、豊富な液体クロマトグラフィーと結合機能を多重化などを含む主要な技術の進歩が得られています。進歩より速くより正確な測定のために必要な以下の試料を可能にします。定量的プロテオミクス蛋白質と非常に複雑な生体試料1,2,3,4の翻訳後修飾の数万人をプロファイリングのアプローチが主流となっています。,5,6。
相対パスと絶対定量 (すなわちiTRAQ) とタンデム質量タグ (TMT) MS の定圧タグなど多重の定圧ラベル表示方法が大きくサンプル スループット向上し、単一で分析できるサンプルの数を増加1,6,7、8を試してみてください。ラベル無料定量など安定同位体標識細胞培養 (すなわちSILAC)、アミノ酸、プロテオミクス、これらのテクニックの可能性と共に他の MS に基づく定量方法もかなり9 フィールドが、10,11。たとえば、TMT メソッドは 1 実験で 10 プレックス試薬を使用して一緒に分析されるべき 10 の蛋白質のサンプルを許可します。これらの構造的に同じ TMT タグ同じ全体の質量が重い同位体がフラグメンテーション相対定量が可能となる、各タグの中にユニークなレポーター イオンで生じる炭素または窒素原子の分布の比較間 10 のサンプルします。TMT 戦略は日常的に生物学的経路、病気の進行、細胞プロセス12,13,14の研究に適用されます。
相当な技術的な改善は、液体クロマトグラフィー (LC)-MS/MS システム、LC 分離と定量精度を損なうことがなく、タンパク質の同定を最大化するために、MS パラメーターの両面を強化します。結果の最大数20を達成するために散弾銃プロテオミクス手法のこのタイプの最初の次元に 2 番目の次元の高い直交性と分離法によるペプチドの分離が欠かせません。高 pH 逆相液体クロマトグラフィー (市販清涼飲料水) は、従来の強陽イオン交換クロマトグラフィー20よりもパフォーマンスが向上を提供します。全体プロテオーム解析15 を実行するときに表現された蛋白質の大部分を識別できるようになります分析ダイナミック レンジとタンパク質報道が改善されるように、pH が高い市販清涼飲料水を低 pH 市販清涼飲料水の 2 番目の次元と組み合わせれば、、16,17,18。その他の技術の進歩は C18 微粒子 (1.9 μ m) を含めるし、長い列 (~ 1 m)19を拡張します。さらに、他の顕著な改善には、急速なスキャン速度、感度の向上と解像度20、MS データ マイニング21の高度なバイオインフォマティクス パイプラインと質量分析計の新しいバージョンが含まれます。
ここでは、実験を通して品質管理機構に焦点を当てながら感度とスループットを向上させるための変更を最も最近の方法論を取り入れた詳細なプロトコルについて述べる。プロトコルには、蛋白質の抽出と消化、TMT 10 プレックス ラベリング、基本的な pH と酸性 pH 市販清涼飲料水分別、高分解能 MS 検出、および MS データ加工 (図 1) が含まれます。また、トラブルシューティングおよび実験の変化を評価するためのいくつかの品質管理手順を実施します。この詳細なプロトコルは、研究者を助ける新しいフィールドに日常的に識別し、正確にたくさんの lysate からの蛋白質を量的に使用または組織。
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Protocol
警告: 使用前にすべての関連する安全性データ シート (すなわち MSDS) を参照してください。このプロトコルを実行するときにすべての適切な安全対策を使用してください
。注: TMT 10 プレックス定圧ラベル試薬セットが 10 個のサンプルのプロテオーム定量このプロトコルで使用されます
。1 細胞/組織の準備
注: 元の生物学的状態に蛋白質を保つために低温で、最小限の時間でサンプルを収集することが重要です。
。- 氷の 10 mL で 2 回 10 cm のプレートに付着細胞 (例えば、HEK 293 細胞) を洗って冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)。こすり、1 mL の PBS のセル (2 〜 10 の 6 セル x) を収集します。1.5 mL のチューブに移し、溶解まで 4 ° c. のストア細胞ペレット-80 ° c で 5 分間 600 × g で遠心分離後 PBS を削除します
。 注: パイロット実験はしばしば蛋白質収量を確認する実行されます。タンパク質の約 1 mg 10 x 10 6 哺乳類セルからまたは 15 cm プレートから 80% 合流で抽出できます 。
- はまた、洗浄後プレートに直接溶解バッファーを追加してプレートを付着性のセルを溶解させます。1.5 mL チューブに溶解液を収集し、2.5 の手順でプロトコルの説明を使用します 。
- 収集懸濁細胞 15 mL チューブ、2 回の洗浄で氷冷 PBS の 10 mL と 1.5 mL チューブに転送し、PBS を削除する 600 × g で遠心分離します。換散バッファー成分の必要な濃度を維持するために完全に洗浄手順から PBS を削除します。溶解まで-80 ° c 細胞ペレットを格納します 。
- は、収集し、すぐに組織の重量を量る。-80 で郭清およびストア後すぐに液体窒素で組織を維持 ° C
注: 組織の蛋白質収量は組織重量の約 5% から 10% - 同種組織サイズと 10 個のサンプルのための解剖学的領域を使用して、試料の不均質を減らします。サンプル 1 mL のタンパク定量法と下流のデータ分析に影響を与える非常に豊富な血液タンパク質を避けるために氷冷 PBS で 2 回の洗浄によって血液汚染を削除します 。
2。蛋白質の抽出、品質管理西部のしみが付くこと、ソリューションで消化、ペプチドの脱塩
注: TMT ラベル サンプルのプール前に減らすために不可欠のステップ中に同じ方法のサンプル 10 の各処理バリエーション
。- を換散バッファー (50 mM HEPES [pH 8.5]、8 M 尿素、デオキシ コール酸ナトリウム 0.5%) 実験の日
。 メモ: サンプル溶解中に部分的なタンパク質変性タンパク質消化効率に影響します 。
- 追加換散バッファー バッファー サンプル ボリュームの比率が 10:1 とガラスビーズ (0.5 mm 径) の最終巻の ~ 20% 細胞ペレットまたは組織 (例えば バッファーとサンプルの間の 10:1 の容積比) に 5 の最終的な蛋白質の集中を達成するために10 mg/ml。使用するセル数または各サンプルの組織重量を考慮したすべての 10 のサンプルの同じ濃度を維持します 。
- 固体尿素をサンプルに追加することにより 8 m 尿素濃度を維持します。8 M の濃度を達成するためにサンプルを追加する固体の尿素の量を計算するときに細胞ペレットや組織のボリュームを検討してください
。 注: いない新鮮な尿素バッファーは人工の化学修飾 (すなわち、蛋白質 carbamylation) を導入し、ペプチド数に悪影響をできます。尿素は、かなりの量を占めている (尿素 100 mg は、ソリューションで 〜 73 μ L を占める). - 不溶性タンパク質 23 消化できるようにライセートで不溶性の破片を維持します 。
- 溶解ミキサー速度 8 で 4 ° C で 30 s、5 s と繰り返しの残りの部分のためのサンプル 5 回またはサンプルが均質になるまで。サンプルは 30 のボルテックスも分離することができます 30 室温 (RT) で s s 〜 10 サイクルの氷の上の期間を冷却します。必要に応じて、サンプルの種類に応じて、溶解条件を調整します 。
- 遠心分離せずライセート井戸を混合し、2 の小さい因数 (~ 15 μ L 各) を作る。西部のしみの分析を実行することによって肯定的なコントロールの検証を実行するのに測定蛋白質濃度 1 因数と 1 の約数を使用します。プロテオミクス解析のため残りの大規模な因数を維持します 。
- 標準として測定蛋白質濃度標準タンパク質定量分析することによって、Coomassie ステンド短いナトリウム ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル (10%) 22 とウシ血清アルブミン (BSA)。BSA の標準を使用して、濃度既知精度の高度で。最高レベルの精度を達成するために標準の BSA のアミノ酸分析を実行します
。 メモ: その他の正確な基準があります。タンパク質の濃度は、細胞の数や組織の重みによって推定できます。分析、蛋白質 (10 μ g/サンプル) の少しとして 100 μ g で実行できます (100 μ g/サンプル) 蛋白 1 mg が推奨されています 。
- 追加 100% アセトニ トリル (ACN) 1: 100 (w/w) 高 2 h 1 常温条件の変化の下で蛋白質を消化するための酵素-基質比で 10 %acn と LysC プロテアーゼの最終的な集中を達成するために。最終濃度 1 mM にタンパク質のジスルフィド結合を減らすし、1 h. 7.2 M 尿素の最終的な集中で実行 LysC 消化間インキュベートするジチオトレイトール (DTT) を追加します 。
- と 3 h の RT でトリプシンでさらにダイジェスト サンプルが 50 mm HEPES (Ph8.5) 2 M 尿素を希釈またはタンパク質比率 1:50 (w/w) のトリプシンで一晩します。使用約 2 μ g 蛋白質の 100 μ g と約 10 ng/μ L のトリプシン濃度のトリプシン
。 注: 非能率的なトリプシンの消化力につながる要因は pH の問題や非アクティブなトリプシン酵素基質への不適切な比率を使用します 。
- 室温 2 時間ペプチドをさらに削減し 1 mM DTT を追加
- 追加ヨードアセトアミド (IAA) 10 mM を達成するために。RT でシステインを含むペプチドをアルキレートに暗闇の中で 30 分間インキュベートします 。
- 30 mM を実現し、室温 30 分間インキュベート DTT を追加することで未反応の IAA を消す
- では、各サンプルの小さい因数を調べることによってトリプシンの消化力の効率を確認してください。メーカーによるとデッド スペースに埋め込まれたクロマトグラフィー メディア 10 μ L ピペット チップを用いた脱塩 ' s プロトコル。各サンプルを分析 - MS さん LC-MS/LC/MS によるパラメーターは、ステップ 5、10 分の 23 をグラデーションには例外のように同じです 。
- は、検索パラメーターとして 4 逃された亀裂を使用して MS raw データ (手順 6 で詳細を参照してください) のデータベース検索を実行します
。 注: 数は劈開を逃した場合は > 10%、それは不完全なトリプシンの消化力を示すかもしれない。これは下流の結果を悪影響します。これは重要な品質管理 (QC) ステップです 。
- 不在の胸の谷間がある場合、サンプルを再びダイジェスト > トリプシンの追加の 10 μ L をサンプルに追加することによって 10% します 。
- は、トリフルオロ酢酸 (TFA) 1% 濃度を達成するために追加することによって、試料を酸性化します。PH のストリップを使用して pH を測定します。PH を賭けることを確認してください。2 と 3 だと思います。以上 TFA のドロップが賢明 (1 μ L) に応じて正しい pH が達成されるまでを追加します 。
- RT で 20,000 × g で遠心する 10 分の収集上清 。
- は、100 μ g の試料を用いた場合、0.25 mL のメタノール樹脂逆相 C18 を含む 60 に 0.5 μ g 容量スピン列を洗います。0.25 ml の 60% の 0.03 に 30 μ g 容量スピン列を洗う ACN/0.1% TFA 10 μ g のサンプルを使用して場合。スピン列 30 500 × g で遠心分離機 s.
- 30 500 × g で遠心分離によって 0.5 ml の 0.1 %tfa の削除] 列を平衡 s.
- の列のサンプルを読み込むし、100 x g 3 分またはすべてのサンプルの列を経過するまででの遠心分離によってサンプルを列にバインドします 。
- 0.5 mL 0.1% の追加列と 30 で 500 × g で遠心分離機に TFA s.
- 60% の追加 125 μ L 各列に ACN/0.1% TFA 3 分すべてのソリューションは、列を通過したことを確認のため 100 × g で遠心分離溶出と 。
- は、真空濃縮で溶離液を乾燥させます。サンプルがチューブに完全に乾燥しても液状のままを確認します。さらに詳しい分析まで-80 ° c ストア 。
3。ペプチドの TMT ラベリング
注: すべてのサンプルが TMT 試薬によって完全に分類されることを確認することが重要です。いくつかの要因 (例えば、TMT 試薬使用量、pH 値、およびタンパク質定量の精度) は TMT 分類の効率は、すべての下流の結果を変更が否定的に影響を与える
。 50 mM HEPES 緩衝液 (pH 8.5) の 50 μ L 内- 西川各ペプチドの脱塩サンプルです。PH を確認し、7 と 8 の間であることを確認します
。 注: サンプル酸性ラベリングの効率に影響を及ぼす脱塩ステップの後完全に乾いていない場合があります 。
- 手順 3.3 で説明した後続 TMT ラベリング効率テストの各ラベルのないサンプルの ~ 1 μ を維持します 。
- 無水 ACN で TMT 試薬を溶解し、製造元に従うことによってペプチド試料をラベル ' の指示。1 のための RT で試薬を孵化させなさい
- 埋め込みクロマトグラフィー メディア、メーカーによると 10 μ L ピペット チップを用いた各 TMT ラベルとラベルのないサンプルの脱塩 ~ 1 μ g QC TMT ラベリング効率テストを実行 ' s プロトコル。LC MS/さんによる TMT ラベルとラベルのない試料を分析
注: クロマトグラフィー-タンデム質量パラメーター セクション 5、10 分のグラデーションでは、例外のように同じでは - は、完全なラベリング効率 ( 図 2) を確保するラベルのサンプルではラベルのないペプチドが検出されないということを確認する raw データを調べます。6 に 10 別ペプチド ラベリングの効率を確認するこれを行うにします 。
- 5% のヒドロキシルアミンの 4 μ L を追加することによって反応を抑制し 15 分間インキュベート
- は、各 TMT ラベル サンプルの小さい、等しいボリューム (2 μ L) 因数をミックスします。10 μ L ピペット チップを用いた埋め込みクロマトグラフィー メディアによる塩分を除きます。手順 3.4 で説明した LC-MS/MS による試料を分析します。ジャンプのソフトウェア プログラム (ペプチッドおよび蛋白質のリストにタンデム MS の raw ファイルを変換するオープン ソースのデータベース検索アルゴリズム) を使用してすべての TMT タグ強度 10 のすべてのサンプルの相対濃度比を決定するペプチドを識別します
。 注: この QC プレミックス比率テストは最後のプールの前に等しい混合の正しい比率を決定に役立つ、ピペッティング エラーが発生することができます濃度が変化する、タンパク質定量ステップ精度が高くない常に。それはまた確実に最終的なミックスに使用される 10 個のサンプルのそれぞれの量すべての等しい比は、3.5 の手順で説明されているように最高の方法です 。
- 10 のすべてのサンプルの間で 1:1 の比率を達成するために必要な回数だけ繰り返します 。
- は、プレミックス率テストの結果によると 10 個のサンプルを均等にミックスします。他の 9 サンプルの容積を調節する基準として最低濃度のサンプルを使用します 。
- 脱塩によるプールされた TMT ラベル サンプルの焼入の反応の副生成物を削除します 。
- 洗浄 1 mL 固相抽出カートリッジ 100 μ g の試料を用いた場合、50 mg 各列メタノール 1 mL/0.25 mL と吸着剤を含みます。0.5-60 μ g 容量 C18 スピン列 60 %1 mL/0.25 mL とを洗う ACN/0.1% TFA 10 μ g のサンプルを使用して場合。30 で 500 x g で列を遠心分離機 s.
- 30 500 × g で遠心分離によって 0.5 ml の 0.1 %tfa の削除] 列を平衡 s.
- の列のサンプルを読み込むし、3 分または列を通過したすべてのサンプルまで 100 x g で遠心分離によってバインドします 。
- 0.5 mL 0.1% の追加列と 30 で 500 × g で遠心分離機に TFA s.
- 60% の追加 125 μ L 各列に ACN/0.1% TFA 100 x g で 3 分間ソリューションのすべての列を通過が確実に遠心分離溶出と 。
- は、真空濃縮で溶離液を乾燥させます。サンプルがチューブに完全に乾燥しても液状のままを確認します。さらに詳しい分析まで-80 ° c ストア 。
4。広範な高解像度、基本的な pH LC Prefractionation
- セット 2 接続されている C18 カラム ブリッジ エチレン ハイブリッド粒子 (4.6 mm x 25 cm、50 cm を合計; 3.5 μ m 粒子径) し、1 マイクロリットル流れ高性能 LC ポンプを使用分別します
。 注: 2 列の使用はペプチド負荷を増大させ、クロマトグラフィーを必ずしも改善されません。含むサンプルの ≤ ペプチドの 200 μ g は、1 列で十分です 。
- (ギ酸アンモニウム 10 mM、pH 8.0) メタノール、水やバッファー A 各 300 μ の後の追加 100 μ L ループを洗うです 。
- 均等に混合イソプロパノール、メタノール、ACN、および水の 100 μ L をカラムを洗浄し 95% のバッファー 2 h. のためにコラムを平衡させ
- は、バッファー サンプルの pH が 8.0 〜 A. 確認の 65 μ L で淡水のプールされた TMT 標識ペプチド サンプルを可溶化します。場合はまだ酸性 pH 8.0 に調整に水酸化アンモニウムを使用します 。 次のグラデーションを使ってバッファー B
- Fractionate サンプル (プラス 90% のバッファー ACN): 15 分の 15% から 20%、20% から 35%、100 分間と 30 分の 35% 〜 50% 設定画を収集する分数コレクター読み込み時間を含むすべての 2 分。フロー レートを 0.4 mL/分に設定します。代表的なクロマト グラムを参照 29 と 図 1 を参照してください 。
- 80 分数の合計を収集し、40 分数 (すべて他の分数) の完全な乾燥、真空濃縮乾燥します 。
- クロマトグラフィー-タンデム質量分析のための 40 の乾燥サンプルを使用します 。
- - MS LC/MS による超深海プロテオームのカバレッジを達成するためにすべての 80 画分を分析します 。
5。LC ・ MS/MS 準備とパラメーター
注: TMT に基づく定量ペプチド イオンは定圧、MS1 スキャンで 1 質量として表示されます。しかし、彼らは、量的に表わされるレポーター イオン (10 ユニークなレポーター イオン) の強度に応じて MS/MS スキャンでペプチド イオンが高エネルギー衝突解離 (HCD) で断片化された後。TMT レポーター イオン比の TMT ラベル イオン 24 の共同溶出抑制される可能性があります。イオン分離ウィンドウ 25 気相浄化 26、MultiNotch MS3 法 27、または多次元 LC と長いグラデーション (4-8 h) 広範な分別を縮小 28 代替アプローチ
。- パック 75 μ m の内径 (ID) 空に 30 ~ 40 cm (~1.3 μ L ベッド ボリューム) に C18 樹脂 1.9 μ m 列 。
- 熱背圧を抑制し、超高圧の圧力をかけている上に蝶ポートフォリオ ヒーター 65 ° c 列液体クロマトグラフィー (高精度) システム。コイルの 2 ~ 3 倍列全体のベッドの長さは加熱して蝶ヒーター内の列。ヒータ内部温度センサーをテープに触らないヒーターの内側に列をテープします
。 注: 蝶ポートフォリオ ヒーターはマウントし、楽器の XYZ ステージにプレキシ ガラスのオーダーメイド部分にテープで固定します 。
- 準備 (3% ジメチル ジメチルスルホキシドと 0.2% ギ酸) をバッファーし、B をバッファー (バッファー プラス 67 %acn) 95% のバッファー B. で徹底的に列を洗うとその後、完全に平衡 (少なくとも 3 列ボリューム) 95% のバッファー A の列。~0.25 μ L/分の流量や背圧 280 320 にバーが使用
- は、100 を実行して、MS LC/MS システムの品質を調べるラット脳ペプチド (または我々 の選択の標準) TMT ラベル サンプルを分析する前に 2 回の ng。頻繁に高品質データの収集を確認して次のパラメーターをチェック: MS 信号強度 (e8 および e9 基本ピーク強度の) 間の調査の MS/MS スペクトル (y および b イオンの良い表現)、ピーク幅 (12-22 s)、全体的な保持時間、品質LC システムの圧力 (圧力上昇 > 50 バーに汚れた列詰まっているエミッタを示します) と実行する変動 (同一のピークであるべき < 30 実行の間 s).
メモ: 10 プレックス TMT 試薬 (6.32 mDa 差) の近く定圧レポーター イオンを解決するには、MS/MS 解像度は 400 m/z で 30,000 以上に設定する必要があります。HCD は、イオン トラップ楽器における衝突誘起解離 (CID) に適用される 1 番目のルールは、通常使用 TMT10 プレックス レポーター イオン断片化します 。
- クリーンと定期的に MS 楽器を調整し、システムのパフォーマンスを向上させるために新鮮な LC のバッファーを使用します 。
- 5% 塩基性 pH 分離から乾燥ペプチドを再構成 TFA 。
- ロード中流れる 5% のバッファー A. 列に ~0.2 μ g
- 想定し, 浸出液バッファー B 150 分で 15 ~ 45%。開始点として次のグラデーションを使用して、: 時間 0、バッファー B 5%;時間 2、バッファー B 15%;時間は 135、バッファー B 45%、時間 145、バッファー B 70%;時刻の 150、バッファー B 95%。クロマト グラム ピークの基本を確認した後初期と後期の基本的な pH 市販清涼飲料水分数の少しグラデーションを調整します 。
- イオン トラップの質量分析計 (400-1600 m/z; 60,000 解像度; 1 x 10 6 自動利得制御 (AGC) ターゲット; 50 ms 最大イオン時間と重心モード) で調査スキャンのデータ依存型モードで質量分析計で動作します。20 MS/MS 高解像度スキャン (60,000 の解像度、1 x 10 5 AGC ターゲット、~ 100 ms 最大イオン時間、35 正規化 HCD 衝突エネルギー、0.4 m/z 分離ウィンドウ、および 20 s 動的除外) を実行します
。 注: 電子移動解離 (ETD) お勧めしません TMT10 プレックス試薬の ETD の胸の谷間サイト HCD と異なるためレポーター イオン重複の結果。HCD は、トリプシン ペプチドは通常 +2 荷電状態を生成し、ETD は、高い電荷状態より効率的なので、また、ETD は効果的ない 。
6。MS データ解析
注: ジャンプのソフトウェア プログラムとデータ解析について述べる。他の商業的利用や無料プログラムただし、データ分析を実行できます
。- タグ ベースのハイブリッドと質量からプロセスの raw ファイル検索エンジン ジャンプ 21、パターン ベース データベース検索と感度と特異度を向上させるタグ ベース de novo シーケンスを組み合わせたです 。
- MzXML に変換する raw データ フォーマットし、偽の発見率 (FDR) を計算するターゲットおとり UniProt 人間データベース (または他の適切な種特異的データベース) に対して MS2 スペクトルを検索します 。
- 前駆体とフラグメント イオンの 10 ppm の質量許容差を使用して、検索を実行します。2 最大逃した劈開、ペプチド、あたり 3 最大改造サイト 、b、およびペプチドをスコアに y イオン の割り当てと完全にトリプシンを制限する他の検索パラメーターを設定します。Lys 残基と N テルミニに TMT タグを静的な変更を設定 (+229.162 Da) とシステイン残基の carbamidomethylation (+57.021 Da)。Met の酸化を含むように動的な変更を設定 (+15.994 Da)、サンプル処理から生じる一般的なペプチドのアーティファクトである 。
- 次のようにデータのフィルター条件: 7 アミノ酸ペプチドの最小長さ、m/z 精度 (例えば、5 ppm)、および照合スコア (J スコアおよび deltaCn)。ペプチドの長さ、trypticity によるとペプチドをグループ化し、充電状態 。
- は、1% 以下の蛋白質に FDR を減らすためにスコアを照合することによってフィルタ リングの追加レベルを使用します。単一スペクトル数によって識別される蛋白質が高い照合スコアを必要とします 。
- ペプチド蛋白質家族の複数のメンバーで共有は 1 グループに一致する蛋白質のメンバーをクラスターにします
。 注: 節約の原則に従って、グループは割り当てられたペプチッドの最高数をもつタンパク質とユニークなペプチド 1 に一致する他の蛋白質によって表されます 。
- ジャンプ ソフトウェア スイートに組み込まれたプログラムを使用して、すべての一致したペプチド スペクトル マッチ (Psm) 間でレポーター イオン カウントの集計によって蛋白質を量的 。
- PSM を受け入れ各抽出し、ラベリング試薬およびグローバルの PSM 定量データから算出した読み込みバイアスの同位体比の分布によると TMT レポーター イオン強度を修正します。定量時に低強度とユーザー定義のしきい値の高い騒音レベル PSMs をフィルター選択します 。
- は、各レポーター イオンとすべて 10 レポーター イオンの平均値の間の相対的な信号を計算します。識別された蛋白質の Psm の相対的な信号を合計します。絶対信号に対応するタンパク質のトップ 3 Psm の平均レポーター イオン強度を掛けることによってこれらの相対的な信号を変換します 。
- では、後の MS の計算論的アプローチを使用して、干渉を修正します。Y 1 のイオン強度はレポーター イオン強度に比例すると仮定するときれいなスキャンからの線形の関係を計算して騒々しいスキャン 23 で汚染された y1ion の強度から干渉レベルを派生します
。 注: TMT トリプシン ペプチド、K TMT と R 残基は y 1 イオンの 2 種類 (376.27574 Da と 175.11895 Da、それぞれ) MS2 スキャンで。1 y 1 イオンが検出され、特定のペプチドと一貫性のある、のみ場合、MS2 はきれいなスキャン ( 図 3 a) とみなされます。両方の y1ions が検出された場合、MS2 と騒々しいスキャン見られる 。
- は、タンパク質定量値をスプレッドシート ソフトウェア プログラムの詳細な分析にエクスポートします。ペアワイズ比較や分散分析が発現される蛋白質を識別するために使用します 。
7。MS データ検証
注: MS データの品質を評価する少なくとも 1 検証法を時間のかかる生物学的実験を行う前に実行必要があります
。- ペプチッド シーケンスと TMT レポーター イオン定量検証する興味の蛋白質の MS/MS スペクトルを手動で確認します 。
- MS の結果を確認する既知のタンパク質の定量データを使用します 。
- 抗体を用いたアプローチ (例えば 排水を確認蛋白質の変化rn のしみと免疫組織化学的解析).
- 化学的関心のペプチドを合成、ネイティブ ペプチドの同定を確認するために社内基準を使用します
。 注: MS/MS パターン、クロマトグラフィー-タンデム質量中の保持時間する必要があります同じです 。
- ターゲットの MS による蛋白質の変化を確認します 。
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Representative Results
Pre-MS 分別、MS 設定、および post-MS 補正23を含む 3 つの主要なプロトコル手順で比圧縮の効果を体系的に分析する前述の異種間ペプチド ミックスを使いました。Pre-MS 分別は評価され、酸性 pH 市販清涼飲料水と基本的な pH 市販清涼飲料水の組み合わせを使用して、最適化されました。Post-MS 解析、種特異的ペプチドのみが考えられていた。LC/クロマトグラフィー-タンデム質量、MS2 分離ウィンドウ、解像度液晶オンライン、オンラインの酸性 pH、市販清涼飲料水の読み込み量やオフラインの pH が高い市販清涼飲料水の解像度などのパラメーターの数を調べるためこの干渉モデルを使用 (参照の図 3を参照してください。29)。
オフライン LC 時の解像度を変更するには、我々 は 320 分数に定圧標識ペプチドを分離、分離力を調節する一緒に選択した分数が結合されます。オフラインの液晶解像度は、干渉レベルを監視しながらフラクション サブセット (1、5、10、20、40、80 および 320) の数を使用してテストされました。干渉のレベル分かった共同ペプチドを溶出の問題を軽減、完全に削除することができませんでした 16.4% から 2.8% に徐々 に減少、ややオフライン LC の分離におけるその豊富な分別を示す、干渉。
次に、MS2 分離ウィンドウの干渉に及ぼす影響を評価しました。我々 は干渉が以前研究29,30との合意、分離ウィンドウのサイズにほぼ比例した実験的に決定。たとえば、ウィンドウ サイズ (0.4 1.6 に Da) の 4 倍の違いは、〜 推論レベル (14.4% から 3.7%) の 4 倍の違い。また MS 分析用カラムの最適な負荷量を決定し、さらに干渉を否定するこの情報を使用します。我々 は適切な量のサンプルを読み込むことで 9.4% から 3.3% への干渉を減少しました。あまりにも多くのサンプルを読み込みして、ピーク31を広げることにつながる可能性があります、したがって、低蛋白質定量精度干渉レベルを上げます。最後に、我々 は長い列 (~ 45 cm) を使用してに (1、2、および 4 h) グラデーションの長さを変更してオンライン市販清涼飲料水の解像度を最適化しました。4 h グラデーション (0.4%) まで干渉をほぼ排除も追加計器時間がわかりました。最適化されたパラメーターを明らかにした狭い分離ウィンドウ (0.4 Da) ~ 100 列、および中間レベルの分別 (2 h、3.3 日 x 40 〜) に読み込まれるサンプルの ng。我々 はまた、post-MS 補正のコンピュータ ベースの戦略を使用して、我々 は改善定量精度が得 (図 3 b) タンパク質比を決定する際を示した。
私たちと示唆されたの使用に最適化された液体クロマトグラフィー-質量パラメーター post-MS 補正徹底したプロテオーム プロファイルを提供し、事実上タンパク定量に定圧ラベリング手法によって生成されるよく干渉を排除します。
図 1: TMT-LC/LC-MS/さんによる全体プロテオーム プロファイリング分析法10 生物学的サンプルが分離、消化と 10 異なる TMT タグ、オフラインの基本的な pH 逆相液体クロマトグラフィー (LC) と同様に、プールに分別された 80 分数にラベル付け。すべて他の分数はさらに酸性市販清涼飲料水で区切られ、高分解能質量分析計を使用してオンライン分析します。MS/MS raw ファイルは処理され、タンパク質やペプチドの同定のため Uniprot データベースに対して検索します。タンパク質はあった TMT タグの相対強度に量的に表わされます。最後に、識別と量的に表わされる蛋白質は統合データ解析のために提出されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: TMT 効率試験をラベリングします。TMT ラベル両方サンプル ラベルが付いていない対応する - MS LC/MS による TMT 効率のラベリングを調べるに分けて行った。完全 TMT のラベルでは、ラベルのないペプチド (A) ピークはすっかり TMT 標識ペプチド標識サンプルでのみ存在していたに対し、ラベルのサンプルでは、(B) で欠席します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: MS データの収集後干渉除去のための計算手法です。(A) すべての MS2 スキャンがきれい (左側のパネル) と騒々しいスキャン (右側のパネル) に分けられました。騒々しいスキャンは、K と R (ターゲット ペプチドやペプチドを汚染から他から 1) の y1イオンの両方を展示します。(B)大腸菌ペプチドが個別に 3 異なる TMT 試薬ラベルの付いた、1:3 でプール: 10 の比率。約 20 以上のラットのペプチドは、背景として追加されました。3 グループのエシェリヒア属大腸菌のペプチドの合計相対強度では、y1イオン ベースの訂正は TMT ベースの quantitation のためより正確なを明らかにしました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
我々 は、いくつかの出版物12,13,14,32 で正常に実装されている 10-プレックス定圧ラベリング戦略が付いている蛋白質の定量のための高スループット プロトコルを記述します。.このプロトコルでは 1 の実験では最大 10 の異なる生物蛋白質のサンプルを分析できます。日常的に識別でき信頼性の高さが優に 10,000 蛋白質量的に表わします。定圧ラベリングは蛋白質を量的に効果的な技術が、定量的な不正確さにつながることができる比圧縮によって制限されます。LC/LC の最適化や y1イオン ベース post-MS 補正との組み合わせで MS/MS 設定など、様々 な戦略を使用して、プロトコル効果的にほとんどの干渉効果を削除し、したがってかなりの精度を向上させるタンパク定量法。
タンパク質濃度の方法の数でプログラム機能のジャンプ スイート。ベンダー提供の証明書で報告された値と若干異なります購入した試薬のすべてのバッチの同位体の不純物を測定しました。測定同位体の不純物は、ジャンプ ソフトウェアでレポーター イオンの強度を修正するために使用されます。蛋白質は通常様々 なの絶対強度イオン化効率など、複数の要因によって影響を受けていると多くの Psm によって量的に表わされます。要因の影響が不明なため質量スペクトルは TMT アッセイにおけるレポーター イオンの相対的な存在量のみを明らかにします。レポーター イオンの相対的な存在量は、すべて 10 記者の平均強度によって各レポーター イオンの強度で割って計算されます。最高の代表蛋白質の「絶対信号」を提供するために我々 は蛋白質から最高の絶対的な強度と 3 Psm の相対的な強度の平均と平均絶対を推定する最強の絶対強度の計算蛋白質の信号。再スケーリングとして手順を定義します。Y1補正は普遍的に適用する任意の TMT の試金;ただし、いくつかのケースで我々 修正できなかったためペプチド y1イオンを含む MS/MS スペクトルを持つ。しかし、我々 は、リジンとアルギニンの両方から y1 イオンがあるスペクトルの ~ 90% を発見します。共同識別されたペプチドとして同じの C 末端残基を持つペプチドを溶出による干渉を補うために推定干渉レベルだった本質的に倍増、補正用に用いる。この仮定は、我々 は K と R を含むペプチド y1の同じ強度レベルを, 多数の TMT 実験を集めている実証的証拠に基づいていた。
MS3 multinotch アプローチなど、このプロトコルで記述したもの以外の多くの方法で干渉を減らせます。すべてのこれらの方法は有効な彼らの個々 の長所を持っています。最終的には、使用方法など、要因の数によって異なりますが、望ましい結果 (すなわち、数サンプル量、機器の可用性 (すなわち機器の種類とサンプルを分析するために必要な時間) に限定されません。特定タンパク質) と必要な量子化精度。
最も正確な結果を得るには、プロトコル全体の品質管理手順に耳を傾ける重要です。(例えば、アミノ酸分析を受けている BSA)、サンプルの定量の正確な基準を使用してが含まれます TMT 試薬のラベリングの効率をテスト、トリプシンの消化力の効率を決定する、プレミックス比率テストを実行します。すべて 10 個のサンプルの等しい混合とソフトウェアを使用して任意の読み込みバイアスを修正するをようにします。式の違い個々 のサンプルを展示する知られていた蛋白質または複数のタンパク質が予想される場合、これらの変更が存在しているし、検出することができることを確認最初のセル換散の後西部のしみの分析を行うことが重要です。これにより、サンプルがテストする生物学を表すし、全体の TMT プロトコルを実行する前に時間、資金、および労力を節約できます。特定のサンプルは特定の蛋白を表現する場合、また西部のしみの分析を使用して、プロトコルで続行する前に溶解後彼らの不在を確認することが重要です。プレミックス比検定は 10 試料間で変更するほとんどの蛋白質が予想される場合に使用されます。訂正いたします否定的影響はまた、知られている汚染タンパク質、ケラチンなどを削除しました。私たち定量法はピペッティング エラーなどから発生したすべてのエラーを修正します。可能であれば、具体的にはピペット ボリューム 5 μ L を超える誤差を軽減します。我々 は正確な 1:1 の混合を得られることを確認するこのプレミックス テストの複数のラウンドを行った。実行していないこのタイプのプレミックス比率テスト、プロトコルの免疫沈降サンプルを使用する場合我々 は変更するタンパク質の大部分を期待どおりに注意してくださいすることが重要です。このような場合は、プレミックス テスト結果に歪みが生じます。10 個のサンプルの少なくとも 1 の発現(空のベクター、プロテアソーム阻害等)このような場合で大きく異なりますが予想される実験の場合はまた、強くお勧め定量を容易に複製を使用するには統計情報です。通常、これらのタイプのサンプルの複製 3 を実行することをお勧めします。最終的には、複製の数は、各サンプルの予想される変動に基づいています。
いくつかの微調整と蛋白質、タンパク質パスウェイ、病気の進行やその他の生物学的機能を調査するため、一般的なプロテオーム パイプラインとしてこの堅牢なプロトコルを使用できます。ここで提示されたプロトコルは、深いタンパク質カバレッジを取得し数量比率の抑制を軽減するための強力な手法を提供します。マイナーな修正は、このプロトコル蛋白質翻訳後修飾、リン酸化、ユビキチン化、アセチル化33,34などを量的に容易に適応することができます。包括的なプロテオミクス プロジェクトのこれらのタイプは、ゲノミクス、トランスクリプトミクス、および生物学的システムを理解し、分子機構の新規発見を容易にするシステム生物学のためのメタボロミクスを統合することバイオ マーカーや治療標的疾患13,28,35,36,37,38。
我々 は正確に細胞またはティッシュの lysates から 10,000 以上の蛋白質を量的に表わす方法を示しています。多くの生物学的システムに広く適用できるこのメソッドを見込んでいます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、役に立つ議論のためにすべての他の研究室、施設メンバーをありがとうございます。この仕事は部分的に支えられた R01GM114260、R01AG047928、R01AG053987、ALSAC NI H を付与します。聖ジュード小児研究病院プロテオミクス施設で、NIH がんセンター助成金 P30CA021765 で部分的にサポートされている MS 解析を行った。著者はニサ Badders の原稿を編集のヘルプをありがちましょう。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1220 LC system | Agilent | G4288B | |
| 50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
| Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
| Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
| C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
| DMSO | Sigma | 41648 | |
| Formic acid | Sigma | 94318 | |
| Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
| Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
| Lys-C | Wako | 125-05061 | |
| Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
| nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
| ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
| Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
| TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
| Trypsin | Promega | V511C | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
| Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |
References
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