Summary
Questo articolo viene illustrato un modello murino per studiare lo sviluppo dell'iperplasia miointimale (MH) dopo la ferita aortica dell'aerostato.
Abstract
L'uso di modelli animali è essenziale per una migliore comprensione della MH, una delle principale cause di stenosi arteriosa. In questo articolo, dimostriamo un modello di decumulazione palloncino murino, che è paragonabile con modelli di lesione del vaso stabilito in animali di grandi dimensioni. Il modello di decumulazione aorta con cateteri a palloncino imita la regolazione clinica e conduce ai cambiamenti fisiologici e pathobiological comparabili. Brevemente, dopo aver eseguito un'incisione orizzontale in aorta centrifugalis, un catetere a palloncino verrà inserito nel vaso, gonfiato e presentare retrogradely. Gonfiaggio del palloncino porterà a biancheria intima ferita e overdistension della nave. Dopo rimozione del catetere, l'incisione aortica sarà chiuso con singoli pinzature. Il modello mostrato in questo articolo è riproducibile, facile da eseguire e può essere stabilita in modo rapido e affidabile. È particolarmente adatto per la valutazione di agenti terapeutici sperimentali costosi, che possono essere applicati in modo economico. Utilizzando diversi ceppi di topo knockout, può essere valutato l'impatto di diversi geni sullo sviluppo di MH.
Introduction
Stenosi arteriosa nelle arterie coronariche e periferiche ha un grande effetto sulla morbosità e della mortalità di pazienti1. Un meccanismo patologico di fondo è l'iperplasia myointima (MH), che è caratterizzato da aumentata proliferazione, migrazione e sintesi di proteine della matrice extracellulare da muscolo liscio vascolare cellule (SMC)2. SMC si trovano nello strato media della nave e migrare su stimolo alla superficie del lume. Segnali stimolatori includono fattori di crescita, citochine, contatto della cellula-cellula, lipidi, componenti della matrice extracellulare e cesoia meccanica e allungare le forze3,4,5,6. Lesioni della parete del vaso, patologica o iatrogena, causano delle cellule endoteliali e danno delle cellule di muscolo liscio e stimolano le reazioni infiammatorie e quindi portano ad MH7.
Diversi modelli animali sono attualmente disponibili per studiare lesioni arteriose e iperplasia myointima. Grandi animali come maiali o cani hanno il vantaggio di condividere una simile arteria e anatomia coronaria con gli esseri umani e sono particolarmente adatti per gli studi che studiano l'angioplastica tecniche, procedure e dispositivi8. Tuttavia, modelli di maiale hanno lo svantaggio di superiore trombogenicità9,10, mentre i cani hanno solo una lieve risposta a nave ferita11. Inoltre, tutti i grandi modelli animali richiedono speciale alloggiamento, attrezzature e personale, che sono collegato con costi elevati e non sempre sono disponibili presso un'istituzione. Piccoli modelli animali includono ratti e topi. Rispetto ai ratti, topi hanno i vantaggi di costo inferiore e l'esistenza di una varietà di knock out modelli. Il modello descritto in questo video può essere combinato con ApoE-/-topi alimentati con una dieta occidentale a imitare molto attentamente la regolazione clinica di angioplastia in vasi aterosclerotici12. Modelli precedenti ha indotto la lesione vascolare via filo ferita13, fluido essiccazione14, primavera15o polsino ferita16. Poiché la natura del pregiudizio inciderà notevolmente lo sviluppo e la costituzione di MH, facendo uso di un catetere a palloncino per indurre la lesione del vaso è il modo migliore per imitare la regolazione clinica.
In questo articolo descriviamo un nuovo metodo per indurre MH con un catetere a palloncino in topi. L'uso di un catetere a palloncino (1,2 x 6 mm) con un RX-porta (Figura 1A) permette la raschiatura dello strato intimal e, allo stesso tempo, l'induzione di un overdistension della nave. Entrambi questi fattori sono importanti trigger per lo sviluppo di MH. Il tempo di osservazione per questo modello è di 28 giorni17.
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Protocol
Animali ha ricevuto un'assistenza umana in conformità con la guida per i principi di animali da laboratorio, preparato da Istituto di laboratorio animale risorse e pubblicato da National Institutes of Health. Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dall'autorità locale responsabile (' Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Fiuggi (ufficio per la salute e tutela dei consumatori) ').
1. preparazione del catetere
Nota: Fare riferimento alla Tabella materiali per informazioni per quanto riguarda il catetere.
- Prendere catetere da titolare del catetere.
- Tirare il filo guida dal lume attraverso la porta distale fuori.
- Mettere in una goccia di adesivo cianoacrilato sull'estremità distale del catetere.
Attenzione: Indossare guanti in lattice o nitrile. - Inserire il filo guida al Porto RX del catetere e farlo avanzare attraverso il lume alla porta distale. In seguito, tirare la guida indietro leggermente per lasciare uno spazio di ~ 5 mm fino alla fine.
- Aspettare 5 minuti per consentire l'adesivo ad asciugare.
- Spostare il filo guida, dovrebbe essere fissato. Se è ancora mobile, ripetere i passaggi 1.3-1.6.
- Riempire una siringa da 3 mL con 1,5 mL di soluzione fisiologica 0,9% e collegarlo alla porta di gonfiaggio del palloncino.
- Spingere lo stantuffo della siringa per testare il gonfiaggio del palloncino. Lasciare 0,6 mL soluzione salina nella siringa.
2. preparazione di Mouse
- Ottenere topi maschi all'età di 14 settimane pesa circa 30 g.
Nota: Abbiamo usato animali ottenuti dall'Istituto di animali da laboratorio. Abbiamo usato qui C57BL/6J. - Utilizzare una camera di induzione per anestetizzare il mouse con 2.0-2.5% isofurane (500 mL/min portata di ossigeno).
- Posizionare il mouse sul dorso su un rilievo di riscaldamento e mantenere l'anestesia con una facciale che ricopre la bocca e il naso del mouse. Verifica per sufficiente profondità dell'anestesia pizzicando le zampe posteriori e la coda per verificare l'assenza di riflessi.
- Rimuovere i capelli addominali utilizzando un tagliacapelli.
- Allargare le gambe posteriori e fissare la loro posizione con del nastro.
- Disinfettare la zona addominale con povidone-iodio, seguito da 80% di etanolo. Ripetere questo passaggio altre due volte.
- Utilizzare un telo chirurgico per garantire il sito chirurgico non avere contaminato. Aprire gli strati di pelle e muscolo lungo il linea alba con una forbice (o bisturi) per esporre gli organi addominali.
- Posare l'intestino in un guanto idratata fisiologica 0,9% e avvolgere per tenerli umidi.
- Utilizzare due una pinzetta per rimuovere il tessuto adiposo sopra l'aorta addominale.
- Usando una siringa da insulina (30G), iniettare 250 µ l di soluzione di eparina (50 U/mL) nella Vena Cava inferiore (IVC) e attendere 3 minuti per la sua distribuzione sistemica. Eparina sarà sopprimere l'emostasi e prevenire la coagulazione del indesiderati durante la chirurgia.
- Utilizzando due pinze, la dissezione dell'aorta di infrarenal fino alla relativa biforcazione e relativi vasi di ramo in uscita.
- Legare i vasi collaterali, che sono tenuti a essere collocato nell'area bloccata, con un cauterizzatore ad alta temperatura.
- Interrompere il flusso sanguigno dal serraggio di aorta di infrarenal direttamente sotto le arterie renali.
- Posizionare una seconda fascetta una posizione distale appena sopra la biforcazione aortica.
- Eseguire una piccola incisione orizzontale utilizzando forbici a metà tra i morsetti lungo la nave.
Nota: La dimensione dell'incisione deve essere pari ad 1/3 della circonferenza del vaso. - Inserire una siringa con un ago (30G) nell'incisione e lavare l'aorta con 250 µ l di soluzione di eparina (50 U/mL).
- Usando i suturare 10-0, mettere un singolo nodo su ciascun lato dell'incisione.
- Dilatare l'aorta con l'inserimento di un dilatatore nell'incisione e diffondere il vaso leggermente. Ripetere la dilatazione 2 o 3 volte.
- Idratare il catetere a palloncino con soluzione fisiologica allo 0,9%.
- Inserire il catetere a palloncino appiattito nell'aorta e farlo avanzare verso il morsetto prossimale sull'aorta.
- Quando si raggiunge il morsetto prossimale, aprire il morsetto prossimale con cautela e gonfiare il palloncino per evitare perdite di sangue, iniettando ~0.6 mL di soluzione fisiologica.
Nota: Il rapporto del palloncino gonfiato al vaso è 1,5: 1. - Far avanzare il catetere retrogrado per circa 2 cm.
- Sfilare il catetere espanso indietro, mentre lo sgonfiamento del palloncino leggermente rilasciando la siringa.
- Ricollegare il morsetto prossimale quando il catetere raggiunge l'incisione dell'aorta. Sgonfiare il palloncino completamente e rimuoverlo.
- Sciacquare l'aorta con 250 µ l di soluzione di eparina (50 U/mL) usando una siringa da 30G.
- Chiudere l'incisione aortica usando i suturare 10-0. Luogo interrotto punti su ogni lato laterale, seguita da uno o due punti sul lato ventrale.
- Aprire il morsetto distale. In caso di sanguinamento, richiudere la pinza e inserire ulteriori punti.
- Aprire il morsetto prossimale con attenzione.
- Posizionare due tamponi sulla sutura per sostenerla e interrompere qualsiasi sanguinamento.
- Posto emostatiche assorbibili sulla sutura per sostenerla.
Nota: Un impulso aortico deve essere visibile distalmente dall'incisione. - Gli intestini sono inserire nuovamente l'addome.
- Sciacquare la cavità addominale con soluzione fisiologica 0,9% sterile, che è stato pre-riscaldato a 37 ° C.
- Chiudere lo strato del muscolo addominale utilizzando suture in esecuzione 6-0.
- Chiudere la pelle con suture in esecuzione 5-0.
- Iniettare Carprofen 4-5 mg/kg per via sottocutanea prima di consentire il mouse a svegliarsi. Monitorare l'animale fino a quando ha acquisito coscienza, mantenere decubito sternale. Tenere l'animale da solo in una gabbia fino al recupero completo.
- Aggiungere metamizolo per l'acqua potabile (50 mg/100 mL) come farmaco di dolore per 3 giorni e monitorare l'animale al giorno. Di solito topi come il dolce sapore di metamizolo e iniziano a bere immediatamente dopo l'intervento chirurgico. Se si preferisce, agenti iniettabili a rilascio prolungato possono essere utilizzati invece di metamizolo.
Nota: Il periodo di osservazione per questo modello è di 28 giorni.
3. istopatologia
- Raccogliere l'aorta palloncino-danneggiati dopo 28 giorni preparando i topi come descritto ai punti 2.2 a 2,9.
- Usare le forbici per rimuovere l'aorta palloncino-danneggiati (tra la biforcazione e 0,3 mm sopra i vasi renali) ed eutanasia il mouse tagliando fuori il suo cuore.
- Lavare il lume del vaso con 0,9% NaCl.
- Difficoltà durante la notte la nave raccolta in paraformaldeide al 4% (PFA) e si disidratano in aumento delle concentrazioni di etanolo, a partire con etanolo al 70% per 2 ore, etanolo di 80% per 1 ora, etanolo al 95% per 2 ore e 100% etanolo per 5 ore. Quindi, incubare i campioni in xilene per 2 ore 3 volte, prima che si infiltrano i campioni con paraffina.
Nota: invece di vampate di calore la nave raccolta con 0,9% NaCl, esso può essere lavata con 4% PFA.
Attenzione: PFA e xilene sono tossici e devono essere maneggiati con cura speciale. - Incorporare il campione in paraffina e tagliati in fette di 5 µm spessore utilizzando un microtomo.
- Deparaffinizzare le diapositive con xilene 3 volte per 5 minuti.
- Reidratare i vetrini di tessuto utilizzando una serie decrescente di etanolo. Iniziare con etanolo 100% 2 volte per 5 min, seguiti da 3 minuti di etanolo 95%, 80% e 70%.
- Colorare i vetrini con la colorazione tricromica di Masson come descritto18.
- Disidratare i vetrini colorati in etanolo 100% 2 volte per 10 minuti ciascuno. Chiaro con xilene 2 volte per 10 minuti ciascuno e montare in mezzo di montaggio.
- Mostra i vetrini con un microscopio a campo chiaro. Usare una lente con ingrandimento e un'apertura numerica di 0,12: 5x per una foto panoramica o una lente con 20 ingrandimenti x con un'apertura numerica di 0.35 per osservazione dettagliata.
4. microscopia di immunofluorescenza
- Reidratare i vetrini di tessuto utilizzando una serie decrescente di etanolo. Iniziare con etanolo 100% 2 volte per 5 min, seguita da 3 min di etanolo 95%, 80% e 70%.
- Eseguire ricupero dell'antigene riscaldando i vetrini nella soluzione di ricupero dell'antigene in un vapore per 20 min.
- Lasciate raffreddare il vetrini a temperatura ambiente.
- Dopo il lavaggio le diapositive per tre volte con tampone fosfato salino (PBS), applicare la soluzione bloccante antigene sulle sezioni per 30 min.
- Lavare i vetrini tre volte per 5 min con PBS.
- Incubare sezioni con l'anticorpo primario diluito in diluente per anticorpi primari.
Nota: Il momento giusto di concentrazione e incubazione dovrebbe essere scelti separatamente per ogni anticorpo. - Lavare i vetrini tre volte per 5 min con PBS per rimuovere l'anticorpo non legato.
- Incubare sezioni con un anticorpo secondario pre-coniugato diluito nel diluente di anticorpo secondario.
Nota: Il momento giusto di concentrazione e incubazione dovrebbe essere scelti separatamente per ogni anticorpo. - Rimuovere gli anticorpi non legati da lavare i vetrini per 5 minuti tre volte.
- Colorante di contrasto i nuclei cellulari utilizzando 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per 15 min; la concentrazione finale di DAPI dovrebbe essere 350 nM.
- Montare diapositive in immunofluorescenza compatibile soluzione di montaggio.
Nota: Utilizzando la soluzione di montaggio sbagliato può oscurare il segnale di fluorescenza. - Visualizzare le diapositive con un microscopio a fluorescenza. Utilizzare una lente di ingrandimento 40x con un'apertura numerica di 1,3.
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Representative Results
Decumulazione palloncino è un modello adatto per studiare lo sviluppo di MH in topi. Animali recupero bene dalla chirurgia e viene mostrata un'eccellente condizione fisica post-operazione. Abbiamo stabilito questo modello in 50 topi con meno di 3% di mortalità a causa della procedura chirurgica. Figure 1B -C mostrano i passaggi chiave chirurgici. Dopo un'incisione della pelle lungo il linea alba, identificare l' aorta centrifugalis. Posto microsurgical morsetti (Figura 1B). Praticare una piccola incisione nel mezzo dell'aorta, impostare un catetere a palloncino nel vaso e diapositiva retrogrado, contro la direzione del flusso sanguigno (Figura 1). Movimento del palloncino gonfiato conduce alla raschiatura del intima e, allo stesso tempo, overdistension della nave. L'incisione aortica sarà chiuso con singoli pinzature. Una pulsazione aortica deve essere visibile distalmente dall'incisione.
MH si sviluppa progressivamente nell'innesto nel tempo. Istologica di colorazione con ematossilina tricromica dimostra la formazione di myointima all'interno della lamina elastica interna (Figura 2A). Le lesioni miointimale consistevano principalmente di componenti cellulari positivi per SM22 e alcuni componenti della matrice extracellulare (Figura 2B). Miointimale cellule vengono ulteriormente valutate da colorazione di immunofluorescenza. La popolazione principale nel myointima è costituito da cellule muscolari lisce (actina del muscolo liscio (SMA) positivo) e miofibroblasti (fibroblasto attivazione della proteina (FAP) positivo) cellule (Figura 2B).
Figura 1. Schemi del catetere e relativo impianto. (A) schema dettagliato del catetere. Porta distale, palloncino, scambio rapido (porta RX-), filo guida e lume singolo a RX-porta, doppio lumen da RX-Port a palloncino, hub, la porta di gonfiaggio del palloncino. (B) illustrazione schematica della procedura chirurgica. Flusso sanguigno della Aorta centrifugalis viene arrestato con due morsetti micro e viene eseguita una piccola incisione. C. gonfiato catetere all'interno dell'aorta centrifugalis. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Formazione di Myointima all'interno della lamina elastica interna. (A) mouse Denuded aorte sono raccolte, paraffina incorporato e una sezione trasversale del rappresentante è mostrata nella colorazione tricromica. (B) doppia immunofluorescenza del palloncino-spogliati aortae è mostrato. La riga superiore raffigura miointimale lesioni macchiate per SM22 e collagene III. Nella riga inferiore, vasi sono macchiati per SMA e FAP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo articolo viene illustrato un modello murino per studiare lo sviluppo dell'iperplasia myointimal e permette l'esplorazione dei processi patologici sottostanti e la sperimentazione di nuovi farmaci o opzioni terapeutiche.
La fase più critica in questo protocollo è il denudation dell'aorta. Cura speciale dovrebbe essere pagata durante questo passaggio come eccessiva decumulazione porterà alla formazione di aneurismi e il fallimento del modello. D'altra parte, se decumulazione viene eseguita insufficientemente, troppo poco myointima si svilupperà. Di conseguenza, l'intensità del passaggio decumulazione è fondamentale per il risultato e il successo di questo modello animale.
Per quanto riguarda l'intervento chirurgico, è fondamentale che le due pareti della nave non sono trafitto impostando i punti, che potrebbero provocare il guasto iniziale della pervietà del vaso. Precedentemente abbiamo descritto un modello di topo in cui abbiamo indotto stenosi nave nell'aorta addominale di topi18. Tuttavia, questo e molti altri modelli forniscono solo piccolissime quantità di tessuto per l'analisi. Un vantaggio di questo metodo è la quantità relativamente grande di tessuto ottenuto (segmento di vaso ~ 1 cm). Un innesto singolo vaso così può essere diviso in più parti e utilizzato per varie analisi, riducendo il numero di animali sperimentali necessari.
Inoltre, animali knock-out adatti possono essere utilizzati per studiare lo sviluppo dell'iperplasia myointima in condizioni differenti di malattia. Gli ambiti di provenienza genetici può anche essere combinati con questo modello animale per capire i meccanismi dell'iperplasia myointimal in una varietà di impostazioni o l'impatto di determinati geni.
In sintesi, il modello descritto qui è riproducibile, facile da eseguire e può essere stabilita in modo rapido e affidabile. Collaudata con successo trattamento opzioni in questo modello possono essere ulteriormente confermate nel grande animale modelli19.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Christiane Pahrmann per la sua assistenza tecnica.
D.W. è stata sostenuta dalla Max Kade Foundation. T.D. ha ricevuto sovvenzioni dall'altro Kröner Fondation (2012_EKES.04) e la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2-1. _. S. S. ha ricevuto borse di ricerca dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Ethilon suture | Ethicon | 2814G | |
| 3 mL Syringe | BD Medical | 309658 | |
| 37% HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| Acid Fuchsin | Sigma-Aldrich | F8129-25G | Trichrome staining |
| Antigen retrieval solution | Dako | S1699 | |
| Azophloxin | Waldeck | 1B-103 | Trichrome staining |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
| Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| C57BL/6J | Charles River | Stock number 000664 | |
| Clamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | JAW DIMS: 4 x 0.75 mm LENGTH: 13 mm |
| Collagen 3 | abcam | ab7778 | Antibody |
| DAPI | Thermo Fischer | D1306 | |
| Donkey anti-Goat IgG AF555 | Invitrogen | A21432 | Secondary antibody |
| Donkey anti-Rabbit IgG AF488 | Invitrogen | A21206 | Secondary antibody |
| Donkey anti-Rabbit IgG AF488 | Invitrogen | A11055 | Secondary antibody |
| Donkey anti-Rabbit IgG AF555 | Invitrogen | A31572 | Secondary antibody |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Ethanol 96% | Th. Geyer | 2295 | |
| Ethanol absolute | Th. Geyer | 2246 | |
| FAP | abcam | ab28246 | Antibody |
| Forceps fine | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Forceps standard | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| Hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Heparin | Rotexmedica | PZN 3862340 | 25.000 I.E./mL |
| High temperature cautery kit | Bovie | 18010-00 | |
| Image-iT FX Signal Enhancer | Invitrogen | I36933 | Blocking solution |
| Light Green SF | Waldeck | 1B-211 | Trichrome staining |
| Microsurgical clamp | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4mm |
| MINI TREK Coronary Dilatation Catheter 1.20 mm x 6 mm / Rapid-Exchange | Abbott | 1012268-06U | |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 1.00532.0100 | Trichrome staining |
| NaCl 0,9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Orange G | Waldeck | 1B-221 | Trichrome staining |
| Paraffin | Leica biosystems | REF 39602004 | |
| PBS pH 7,4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | |
| Ponceau S solution | Serva Electrophoresis | 33427 | Trichrome staining |
| Primary antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Prolong Gold Mounting solution | Thermo Fischer | P36930 | Mounting solution for immunofluorescence stained slides |
| Replaceable Fine Tip | Bovie | H101 | |
| Resorcin-Fuchsin Weigert | Waldeck | 2E-30 | Trichrome staining |
| Rimadyl | Pfizer | 400684.00.00 | Carprofen |
| Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Scissors Vannas-style | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Secondary antibody diluent | Dako | S0809 | |
| Fast acting Adhesive MINIS 3x1g | UHU | 45370 | Cyanoacrylate |
| Slide Rack | Ted Pella | 21057 | |
| SM22 | abcam | ab10135 | Antibody |
| SMA | abcam | ab21027 | Antibody |
| Staining dish | Ted Pella | 21075 | |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Tabotamp fibrillar | Ethicon | 431962 | Absorbable hemostat |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| U-100 Insulin syringe | BD Medical | 324825 | |
| Vessel Dilator | Fine Science Tools | 18603-14 | |
| Vitro-Clud | Langenbrinck | 04-0001 | |
| Weigerts iron hematoxylin Kit | Merck | 1.15973.0002 | Trichrome staining |
| Xylene | Th. Geyer | 3410 |
References
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