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Medicine

Lesión basada en globo para inducir la hiperplasia Myointimal de la Aorta Abdominal de ratón

doi: 10.3791/56477 Published: February 7, 2018

Summary

Este artículo demuestra un modelo murino para el desarrollo de la hiperplasia myointimal (MH) después de lesión de globo.

Abstract

El uso de modelos animales es esencial para una mejor comprensión de la MH, una de las principales causas de estenosis arterial. En este artículo, nos muestran un modelo de denudación murine del globo, que es comparable con modelos de lesión de buque establecido en grandes animales. El modelo de denudación de aorta con catéteres de balón imita el ajuste clínico y conduce a cambios fisiológicos y pathobiological comparables. Brevemente, después de realizar una incisión horizontal en la aorta abdominalis, un catéter con balón se introduce en el recipiente, inflado y se introdujo retrogradely. Inflación del balón dará lugar a lesiones de la íntima y overdistension del buque. Después de retirar el catéter, se cerrará la incisión aórtica con puntos de sutura únicas. El modelo mostrado en este artículo es reproducible, fácil de realizar y pueden establecerse de forma rápida y fiable. Es especialmente conveniente para la evaluación de agentes terapéuticos experimentales costosos, que pueden aplicarse de una manera económica. Mediante el uso de diferentes cepas de ratón knockout, podrá evaluarse el impacto de diferentes genes en el desarrollo de MH.

Introduction

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Estenosis arterial en las arterias coronarias y periféricas tiene un gran efecto sobre la morbilidad y la mortalidad de pacientes1. Un mecanismo patológico subyacente es la hiperplasia myointima (MH), que se caracteriza por aumento de la proliferación, migración y síntesis de matriz extracelular proteínas del músculo liso vascular células (SMC)2. SMC se encuentran en la capa media del vaso y migrar sobre el estímulo a la superficie de la luz. Señales estimulantes incluyen factores de crecimiento, citoquinas, contacto célula-célula, lípidos, componentes de la matriz extracelular y esquileo mecánico y estiran las fuerzas3,4,5,6. Lesiones de la pared del vaso, patológica o iatrogénica, causan la célula endotelial y daño a las células del músculo liso y estimulan reacciones inflamatorias y así llevan a MH7.

Diferentes modelos animales están disponibles para el estudio de lesión arterial y la hiperplasia myointima. Grandes animales como cerdos o perros tienen la ventaja de compartir una similar de la arteria y la anatomía coronaria con los seres humanos y son especialmente adecuados para estudios investigando técnicas, procedimiento y dispositivos de angioplastia8. Sin embargo, modelos de cerdo tienen el inconveniente de mayor trombogenicidad9,10, mientras que los perros sólo tienen una suave respuesta a lesiones de vasos11. Además, todos los modelos animales grandes requieren especial, equipos y personal, que está relacionado con altos costos y no siempre está disponibles en una institución. Modelos animales pequeños incluyen ratas y ratones. En comparación con las ratas, ratones tienen las ventajas de menor costo y la existencia de una variedad de golpes modelos. El modelo descrito en este video se puede combinar con ApoE-/-los ratones alimentados con una dieta occidental que mímico de cerca el ajuste clínico de la angioplastia en los vasos ateroscleróticos12. Los modelos anteriores inducida por lesión vascular vía cable lesión13, desecación líquido14, primavera15o manguito lesiones16. Puesto que la naturaleza de la lesión afectará grandemente el desarrollo y Constitución de MH, utilizando un catéter con balón para inducir lesión de vaso es la mejor manera de imitar el ajuste clínico.

En este artículo describimos un nuevo método para inducir a MH con un catéter con balón en ratones. El uso de un catéter con balón (1,2 mm x 6 mm) con un puerto de RX (figura 1A) permite el raspado de la capa íntima y, al mismo tiempo, la inducción de un overdistension del buque. Ambos de estos factores son importantes factores desencadenantes para el desarrollo de MH. El tiempo de observación para este modelo es de 28 días17.

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Protocol

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Animales recibieron atención humanitaria conforme a la guía de principios de los animales de laboratorio, prepararon por el Instituto de recursos de animales laboratorio y publicaron por los institutos nacionales de salud. Animales todos los protocolos fueron aprobados por la autoridad local responsable ('' Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt (Oficina de salud y protección del consumidor) Hamburgo '').

1. preparación de catéter

Nota: Consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre el catéter.

  1. Tomar el catéter del soporte del catéter.
  2. Tire de la guía de la luz a través del orificio distal hacia fuera.
  3. Poner en una gota de cianoacrilato en el extremo distal del catéter.
    PRECAUCIÓN: Use guantes de látex o nitrilo.
  4. Coloque la guía en el puerto de RX del catéter y avanzarlo a través del lumen hasta el puerto distal. Luego, tire la guía ligeramente para dejar un espacio de ~ 5 m m hasta el final.
  5. Espere 5 minutos para permitir que el adhesivo se seque.
  6. Mueva la guía, debe ser fijo. Si es aún móvil, repita los pasos 1.3-1.6.
  7. Llene una jeringa de 3 mL con solución salina al de 0.9% 1.5 mL y conéctelo en el puerto de inflado del globo.
  8. Empuje el émbolo de la jeringa para comprobar la inflación del globo. Salir de 0.6 mL solución salina en la jeringa.

2. preparación de Mouse

  1. Obtener ratones machos a la edad de 14 semanas aproximadamente 30 g de peso.
    Nota: Se utilizaron animales obtenidos desde el Instituto de animales de laboratorio. Aquí utilizamos el C57BL/6J.
  2. Utilizar una cámara de inducción para anestesiar el ratón con 2.0-2.5% isofurane (tasa de flujo de oxígeno de 500 mL/min).
  3. Coloque el ratón sobre su espalda en un cojín de calefacción y mantener la anestesia con una máscara que cubre la boca y la nariz del ratón. Si hay suficiente profundidad de la anestesia por pellizcar las patas traseras y la cola para verificar la ausencia de los reflejos.
  4. Eliminar el vello abdominal utilizando un cortador de pelo.
  5. Extiende las piernas traseras y fijar su posición con cinta.
  6. Desinfectar la zona abdominal con povidona-yodo, seguido de etanol al 80%. Repita este paso dos veces más.
  7. Utilice un paño quirúrgico para asegurarse no contaminado Haz sitio quirúrgico. Abrir las capas de piel y músculo a lo largo de la linea alba con una tijera (o bisturí) para exponer los órganos abdominales.
  8. Poner los intestinos en un guante hidratada solución salina 0.9% y envolver para mantenerlos húmedos.
  9. Use dos pinzas finas para quitar el tejido fino graso por encima de la aorta abdominal.
  10. Utilizando una jeringa de insulina (30G), inyectar 250 μl de solución de heparina (50 U/mL) en la Vena Cava Inferior (IVC) y espere 3 minutos para su distribución sistémica. Heparina se suprimen la hemostasia y prevenir la coagulación no deseada durante la cirugía.
  11. Utilizando dos pinzas, disecar la aorta del infrarenal hasta su bifurcación y sus vasos de rama saliente.
  12. Ligar los vasos laterales, que deben colocarse en la zona sujeta, con un cauterizador de alta temperatura.
  13. Detener el flujo de sangre por pinzamiento de la aorta del infrarenal directamente debajo de las arterias renales.
  14. Coloque la segunda abrazadera en una posición distal justo por encima de la bifurcación aórtica.
  15. Realizar una pequeña incisión horizontal con unas tijeras en el punto medio entre las abrazaderas a lo largo de la nave.
    Nota: El tamaño de la incisión debe ser equivalente a 1/3 de la circunferencia del vaso.
  16. Inserte una jeringa con una aguja (30G) en la incisión y al ras de la aorta con solución de heparina de 250 μl (50 U/mL).
  17. Utilizando suturas 10-0, coloque un nudo a cada lado de la incisión.
  18. Dilatación de la aorta por inserción de un dilatador de vasos en la incisión y extendió el vaso ligeramente. Repetir la dilatación 2 a 3 veces.
  19. Hidratar el catéter de balón con solución salina al 0.9%.
  20. Inserte el catéter de globo aplanado en la aorta y avanzar hacia la pinza proximal en la aorta.
  21. Al llegar a la pinza proximal, cuidadosamente abra la pinza proximal e inflar el balón para evitar fugas de sangre, inyectando ~0.6 mL de solución salina.
    Nota: La relación entre el globo inflado al recipiente es 1.5:1.
  22. Haga avanzar el catéter retrógrado de aproximadamente 2 cm.
  23. Tire el catéter ampliado, al desinflar el balón ligeramente por la liberación de la jeringa.
  24. Vuelva a colocar la pinza proximal cuando el catéter alcanza la incisión de la aorta. Desinflar el balón completamente y sáquela.
  25. Enjuague la aorta con solución de heparina de 250 μl (50 U/mL) usando una jeringa de 30G.
  26. Cerrar la incisión aórtica usando suturas 10-0. Lugar interrumpe puntadas en cada lado lateral, seguido por una o dos puntadas en el lado ventral.
  27. Abra la pinza distal. En caso de sangrado, vuelva a cerrar la pinza y colocar puntos de sutura adicionales.
  28. Abrir con cuidado la pinza proximal.
  29. Coloque dos hisopos en la sutura para apoyarlo y detener cualquier sangrado.
  30. Colocar pinzas hemostáticas absorbibles sobre la sutura para mantenerla.
    Nota: Un pulso aórtico debe ser visible distal de la incisión.
  31. Coloque los intestinos en el abdomen.
  32. Lavar la cavidad abdominal con solución salina 0.9% estéril, que ha sido precalentado a 37 ° C.
  33. Cerrar la capa de músculo abdominal usando suturas corrientes 6-0.
  34. Cierre la piel con suturas corrientes 5-0.
  35. Inyectar en forma subcutánea 4-5 mg/kg de carprofeno antes de permitir que el ratón despertar. Seguimiento del animal hasta que se ha ganado conciencia, mantener recumbency esternal. No el animal solo en una jaula hasta su recuperación completa.
  36. Añadir químicos al agua de bebida (50 mg/100 mL) como medicamento para el dolor por 3 días y monitorear diariamente el animal. Generalmente ratones como el dulce sabor de Metamizol y comenzar a beber inmediatamente después de la cirugía. Si lo prefiere, pueden utilizarse agentes inyectables de liberación sostenida en lugar de químicos.
    Nota: El período de observación para este modelo es de 28 días.

3. histopatología

  1. La cosecha la aorta lesionado globo después de 28 días preparando los ratones como se describe en los pasos 2.2 a 2.9.
  2. Utilice tijeras para quitar la aorta lesión de globo (entre la bifurcación y 0,3 mm por encima de los vasos renales) y eutanasia el ratón cortando a su corazón.
  3. Irrigue el lumen del vaso con 0.9% NaCl.
  4. Fijar la embarcación cosechada en paraformaldehído al 4% (PFA) durante la noche y deshidratar en el aumento de las concentraciones de etanol, a partir de etanol al 70% de etanol al 80% durante 1 hora, 2 horas, etanol al 95% durante 2 horas y el etanol al 100% durante 5 horas. Luego, incubar las muestras en xileno durante 2 horas 3 veces, antes de infiltrarse en las muestras con parafina.
    Nota: en lugar de rubor el buque cosechado con 0.9% NaCl, puede aclararse con 4% PFA.
    PRECAUCIÓN: PFA y el xileno son tóxicos y deben manipularse con especial cuidado.
  5. Embeber la muestra en parafina y cortadas en rodajas de 5 μm de espesor utilizando un micrótomo.
  6. Desparafinizar el portaobjetos con xileno 3 veces durante 5 minutos.
  7. Rehidratar las diapositivas de tejidos utilizando una serie decreciente de etanol. Iniciar con 100% etanol 2 veces durante 5 min, seguido de 3 minutos de etanol 95%, 80% y 70%.
  8. Mancha de los portaobjetos con tinción tricrómica de Masson como descrito18.
  9. Deshidratar diapositivas manchadas en etanol al 100% 2 veces por 10 minutos cada uno. Claro con xileno 2 veces de 10 minutos cada uno y Monte en medio de montaje.
  10. Ver las diapositivas con un microscopio de campo brillante. Utilizar un objetivo con 5 aumentos y una apertura numérica de 0.12 para un cuadro de resumen o una lente de 20 aumentos x con una apertura numérica de 0.35 para observación detallada.

4. microscopia de la inmunofluorescencia de

  1. Rehidratar las diapositivas de tejidos utilizando una serie decreciente de etanol. Iniciar con 100% etanol 2 veces durante 5 min, seguido de 3 minutos de etanol 95%, 80% y 70%.
  2. Realizar recuperación de antígeno por calentar los portaobjetos en solución de recuperación de antígeno en un vapor durante 20 minutos.
  3. Deje que las diapositivas se enfríe a temperatura ambiente.
  4. Después de lavar los portaobjetos tres veces con tampón fosfato salino (PBS), aplicar solución de bloqueo de antígeno en secciones de 30 minutos.
  5. Lave el portaobjetos tres veces durante 5 minutos con PBS.
  6. Incubar las secciones con anticuerpo primario diluido en un diluyente de anticuerpo primario.
    Nota: El momento de concentración y la incubación debe ser elegido por separado para cada anticuerpo.
  7. Lave el portaobjetos tres veces durante 5 minutos con PBS para retirar el anticuerpo no Unido.
  8. Incubar las secciones con un anticuerpo secundario conjugado previamente diluido en un diluyente de anticuerpo secundario.
    Nota: El momento de concentración y la incubación debe ser elegido por separado para cada anticuerpo.
  9. Eliminar los anticuerpos no Unidos por el lavado de los portaobjetos durante 5 minutos tres veces.
  10. Contratinción los núcleos celulares con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) durante 15 minutos; la concentración final de DAPI debe ser 350 nM.
  11. Montar diapositivas en inmunofluorescencia compatible con solución de montaje.
    Nota: Usando la solución de montaje incorrecto puede oscurecer la señal de fluorescencia.
  12. Diapositivas de la vista con un microscopio de fluorescencia. Use un lente de aumento de 40 x con una apertura numérica de 1.3.

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Representative Results

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Denudación de globo es un modelo adecuado para estudiar el desarrollo de MH en ratones. Animales recuperan bien de la cirugía y mostrar después de la operación de una excelente condición física. Se estableció este modelo en 50 ratones con menos de 3% de mortalidad debido a la intervención quirúrgica. Figuras 1B -C muestra los principales pasos quirúrgicos. Después de una incisión en la piel a lo largo de la linea alba, identificar la aorta abdominalis. Coloque pinzas de microcirugía (figura 1B). Haga una pequeña incisión en el medio de la aorta, fijó un catéter con balón en la nave y diapositiva retrógrado, contra la dirección del flujo de sangre (figura 1). Movimiento del balón inflado lleva a raspado de íntima y, al mismo tiempo, overdistension del buque. La incisión aórtica se cerrará con puntos de sutura únicas. Debe verse un pulso aórtico distal de la incisión.

MH se convierte progresivamente en el injerto con el tiempo. Histológico de tinción con Masson trichrome demuestra myointima formación dentro de la lámina elástica interna (figura 2A). Myointimal lesiones consistieron en principalmente componentes celulares positivos para SM22 y algunos componentes de la matriz extracelular (figura 2B). Más se evalúan células myointimal manchando de la inmunofluorescencia. La población principal en el myointima consiste en las células musculares lisas (actinia del músculo liso (SMA) positiva) y células de miofibroblastos (fibroblastos activación proteína (FAP) positivos) (figura 2B).

Figure 1
Figura 1. Esquemas del catéter y su implantación. (A) esquema detallado del catéter. Puerto distal, globo, intercambio rápido puerto (RX-), guía, luz simple RX-puerto, doble lúmenes de RX-Port a globo, centro, Puerto de inflado del globo. (B) ilustración esquemática del procedimiento quirúrgico. Flujo de sangre de la Aorta abdominalis se detiene con dos pinzas de micro y se realiza una pequeña incisión. C. inflado de catéter en aorta abdominalis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Myointima formación dentro de la lámina elástica interna. (A) ratón denudada aortas son cosechadas, embebido de parafina, y una sección representativa del representante se muestra en la tinción tricrómica. (B) inmunofluorescencia doble tinción de aortae de denuda de globo se muestra. La fila superior muestra lesiones de myointimal manchadas para SM22 y colágeno III. En la fila inferior, los vasos se tiñen para SMA y FAP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Este artículo demuestra un modelo murino para el desarrollo de la hiperplasia myointimal y permite la exploración de los procesos patológicos subyacentes y la prueba de nuevos medicamentos o terapéuticas.

El paso más crítico en este protocolo es la denudación de la aorta. Debe prestarse especial cuidado durante este paso como denudación excesiva dará lugar a la formación de aneurismas y el fracaso del modelo. Por otro lado, si la denudación se realiza escaso, desarrollará myointima muy poco. Por lo tanto, la intensidad de la etapa de denudación es crucial para el resultado y el éxito de este modelo animal.

Con respecto al procedimiento quirúrgico, es fundamental que las dos paredes de la nave no son perforadas mediante el establecimiento de los puntos de sutura, que pueden resultar en fracaso precoz de la permeabilidad del vaso. Anteriormente hemos descrito un modelo de ratón indujo estenosis de vasos en la aorta abdominal de ratones18. Sin embargo, esto y la mayoría de los otros modelos sólo proporciona una pequeña cantidad de tejido para análisis. Una ventaja de este método es la cantidad relativamente grande de tejido obtenido (segmento vascular de ~ 1 cm). Un injerto de vaso solo así puede dividido en múltiples partes y utilizado para diversos análisis, con eficacia reduciendo el número de animales de experimentación requeridas.

Además, animales knock-out adecuados pueden utilizarse para estudiar el desarrollo de la hiperplasia myointima en condiciones diferentes de la enfermedad. Los antecedentes genéticos pueden combinarse también con este modelo animal para comprender los mecanismos de la hiperplasia myointimal de una variedad de escenarios o el impacto de ciertos genes.

En Resumen, el modelo descrito aquí es reproducible, fácil de realizar y pueden establecerse de forma rápida y fiable. Tratamiento con éxito probado opciones en este modelo se pueden confirmar más lejos en grandes animales modelos19.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Christiane Pahrmann para su asistencia técnica.

D.W. fue apoyado por el Max Kade Foundation. T.D. recibidas becas de la Fundación de Kröner otro (2012_EKES.04) y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2-1_. S. S. recibió becas de investigación de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-0 Ethilon suture Ethicon 2814G
3 mL Syringe BD Medical 309658
37% HCl Sigma-Aldrich H1758
5-0 prolene suture Ethicon EH7229H
6-0 prolene suture Ethicon 8706H
Acid Fuchsin Sigma-Aldrich F8129-25G Trichrome staining
Antigen retrieval solution Dako S1699
Azophloxin Waldeck 1B-103 Trichrome staining
Bepanthen Eye and Nose ointment Bayer 1578675 Eye ointment
Betadine Solution Betadine Purdue Pharma NDC:67618-152
C57BL/6J Charles River Stock number 000664
Clamp applicator Fine Science Tools 18056-14 JAW DIMS: 4 x 0.75 mm LENGTH: 13 mm
Collagen 3 abcam ab7778 Antibody
DAPI Thermo Fischer D1306
Donkey anti-Goat IgG AF555 Invitrogen A21432 Secondary antibody
Donkey anti-Rabbit IgG AF488 Invitrogen A21206 Secondary antibody
Donkey anti-Rabbit IgG AF488 Invitrogen A11055 Secondary antibody
Donkey anti-Rabbit IgG AF555 Invitrogen A31572 Secondary antibody
Ethanol 70% Th. Geyer 2270
Ethanol 96% Th. Geyer 2295
Ethanol absolute Th. Geyer 2246
FAP abcam ab28246 Antibody
Forceps fine Fine Science Tools 11251-20
Forceps standard Fine Science Tools 11023-10
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 537020
Hair clipper WAHL 8786-451A ARCO SE
Heparin Rotexmedica PZN 3862340 25.000 I.E./mL
High temperature cautery kit Bovie 18010-00
Image-iT FX Signal Enhancer Invitrogen I36933 Blocking solution
Light Green SF Waldeck 1B-211 Trichrome staining
Microsurgical clamp Fine Science Tools 18055-04 Micro-Serrefine - 4mm
MINI TREK Coronary Dilatation Catheter 1.20 mm x 6 mm / Rapid-Exchange Abbott 1012268-06U
Molybdatophosphoric acid hydrate Merck 1.00532.0100 Trichrome staining
NaCl 0,9% B.Braun PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160
Needle holder Fine Science Tools 12075-14
Novaminsulfon Ratiopharm PZN 03530402 Metamizole
Orange G Waldeck 1B-221 Trichrome staining
Paraffin Leica biosystems REF 39602004
PBS pH 7,4 Gibco 10010023
PFA 4% Electron Microscopy Sciences #157135S
Ponceau S solution Serva Electrophoresis 33427 Trichrome staining
Primary antibody diluent Dako S3022
Prolong Gold Mounting solution Thermo Fischer P36930 Mounting solution for immunofluorescence stained slides
Replaceable Fine Tip Bovie H101
Resorcin-Fuchsin Weigert Waldeck 2E-30 Trichrome staining
Rimadyl Pfizer 400684.00.00 Carprofen
Scissors Fine Science Tools 14028-10
Scissors Vannas-style Fine Science Tools 15000-03
Secondary antibody diluent Dako S0809
Fast acting Adhesive MINIS 3x1g UHU 45370 Cyanoacrylate
Slide Rack Ted Pella 21057
SM22 abcam ab10135 Antibody
SMA abcam ab21027 Antibody
Staining dish Ted Pella 21075
Surgical microscope Leica M651
Tabotamp fibrillar Ethicon 431962 Absorbable hemostat
Transpore Surgical Tape 3M 1527-1
U-100 Insulin syringe BD Medical 324825
Vessel Dilator Fine Science Tools 18603-14
Vitro-Clud Langenbrinck 04-0001
Weigerts iron hematoxylin Kit Merck 1.15973.0002 Trichrome staining
Xylene Th. Geyer 3410

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References

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Tediashvili, G., Wang, D., Reichenspurner, H., Deuse, T., Schrepfer, S. Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta. J. Vis. Exp. (132), e56477, doi:10.3791/56477 (2018).More

Tediashvili, G., Wang, D., Reichenspurner, H., Deuse, T., Schrepfer, S. Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta. J. Vis. Exp. (132), e56477, doi:10.3791/56477 (2018).

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