Summary
هنا يصف لنا طريقة لوضع نموذج لصغر الرأس التي يسببها فيروس زيكا في الماوس. ويشمل هذا البروتوكول أساليب التطعيم intracerebral الجنينية والأطفال حديثي الولادة، ومرحلة الكبار فيروس زيكا.
Abstract
فيروس زيكا (زيكف) مصفر مستوطنة حاليا في شمال ووسط وجنوب أمريكا. من الثابت الآن أن زيكف يمكن أن يسبب صغر الرأس وتشوهات الدماغ إضافية. ومع ذلك، الآلية الأساسية لأمراض ال زيكف في المخ النامي لا يزال غير واضح. كثيرا ما تستخدم الطرق الجراحية intracerebral في أبحاث علم الأعصاب لمعالجة مسائل حول تطور الدماغ العادية وغير العادية ووظيفة المخ. هذا البروتوكول يستخدم التقنيات الجراحية الكلاسيكية، ووصف الطرق التي تسمح بالمرتبطة زيكف نموذج البشرية الأمراض العصبية في الجهاز العصبي الماوس. بينما نموذج التطعيم الدماغ مباشرة لا الوضع العادي من انتقال الفيروس، يسمح الأسلوب المحققين طرح أسئلة هادفة بشأن النتيجة بعد الإصابة زيكف في المخ النامي. ويصف هذا البروتوكول المراحل الجنينية والمواليد الجدد، والكبار من التطعيم داخل البطيني من زيكف. حالما يتقن، يمكن أن يصبح هذا الأسلوب أسلوب مباشر واستنساخه يستغرق سوى ساعات قليلة لأداء.
Introduction
صغر الرأس شرط الناجمة عن نمو الدماغ المعيبة تتميز بأقل من متوسط حجم الرأس في الأطفال حديثي الولادة. الأطفال مع صغر الرأس يحمل مجموعة من الأعراض التي يمكن أن تشمل تأخر في النمو والاستيلاء والإعاقة الذهنية، وفقدان السمع، ومشاكل في الرؤية ومشاكل في الحركة والتوازن، بين أمور أخرى، اعتماداً على شدة المرض و تسبب2،،من13. هذا الشرط المتعددة العوامل في طبيعتها، مع عامل الوراثي، والمعدية، والعوامل البيئية المرتبطة بالتسبب في صغر الرأس4،،من56،،من78، 9. وقبل اندلاع زيكف عام 2015-2016، تم تشخيص 8 أطفال من أصل عشرة آلاف ولادة مع صغر الرأس في الولايات المتحدة وفقا لمركز السيطرة على الأمراض10. ش يوم 1 شباط/فبراير من عام 2016 أعلنت "منظمة الصحة العالمية" أن الفيروس Zika "الطوارئ الصحة العامة من القلق الدولي" سبب الزيادة المزعجة في التشخيص صعل المرتبطة بالعدوى زيكف في الأمهات11، 12. وتقترح دراسة حديثة من مركز السيطرة على الأمراض في حالات زيكف في الولايات المتحدة قد أسفرت نتائج الإصابة زيكف الأم إلى خطر زيادة برنامج لطفل لتطوير صعل مقارنة بالأفراد غير مصاب، و 4 في المائة من الأمهات المصابة زيكف من الولايات المتحدة الأمريكية الأطفال مع صغر الرأس11. أبلغ عن معدل العيوب الخلقية المرتبطة بصغر الرأس أثناء الحمل من الإصابة زيكف في البرازيل قد أثرت تصل إلى 17 في المائة من الأطفال الرضع في الأمهات المصابات بالفيروس، مما يشير إلى أن عوامل أخرى في أمريكا اللاتينية قد يسهم في زيادة مخاطر 13-وفي حين أننا نعرف أن زيكف يمكن أن يسبب صغر الرأس والمرضية في السلف العصبية خلية (مجلس الشعب) السكان7،،من814، الدماغ المرضية كاملة من زيكف في البلدان النامية لا يزال بعيد المنال. من المهم تطوير نماذج حيوانية لمواصلة التحقيق آليات المرض الكامنة وراء شذوذ الدماغ المرتبطة بالإصابة زيكف.
لمباشرة دراسة تفيد بأن زيكف على نمو الدماغ، وضعنا أول طراز ماوس باستخدام تطعيم اليوم الجنينية 14.5 (E14.5) المخ intracerebral مع زيكف7. تم اختيار هذه المرحلة كما أنه يعتبر الممثل لنهاية الاثلوث الأول في الحمل البشرية14. الجراء يمكن البقاء على قيد الحياة حتى اليوم بعد الولادة 5 (P5) مع هذا الأسلوب حقن intracerebral الجنينية (~ 1 ميليلتر من 1.7 × زراعة الأنسجة6 10 الجرعة المعدية (TCID50/mL)). هذه الجراء بعد الولادة يحمل مجموعة من تعمل وبالمثل لوحظ في الرضع البشرية المصابة بما في ذلك البطينين الموسع وفقدان الخلايا العصبية والاستنفاد محواري، أستروجليوسيس، و microglial التنشيط12،15. دماغ الفأر حديثي الولادة غير ناضجة نسبيا، أقرب إلى مرحلة النمو في الدماغ البشري في منتصف الأسبوع الحملي16، ونمو الدماغ الماوس يتضمن عنصرا رئيسيا بعد الولادة. دراسة الحمل فيما بعد مرحلة العدوى، كما يتم وصف طريقة للعدوى بعد الولادة. حديثي الولادة المصابين زيكف في P1 قادرة على البقاء على قيد الحياة حتى لحقن بعد 13 يوما. مرحلة الكبار ولد الدم العدوى قد وصفت في الماوس سابقا17 لكنها تتطلب الاستخدام عوامل النسخ العوامل التنظيمية (المتكامل) انترفيرون (IFN) المتكامل-3،-5، سلالة-7 ثلاثية خروج المغلوب. ويصف هذا البروتوكول طريقة لتطعيم زيكف إينترافينتريكولارلي للتحايل على تعطيل الاستجابة المضادة للفيروسات لنموذج مورين في الكبار. بينما هذا تلتف المناعي مورين، هذا الطريق من الحقن لا تقليد مباشرة مسار نموذجي للعدوى. لمعالجة هذا التناقض مباشرة، يمكن أداء المجرب عدوى داخل الرحم من زيكف بدلاً من الطريق داخل الجمجمة. اتخذ من العمل السابق18، التي وصفناها بإيجاز هذا الأسلوب في هذا البروتوكول العدوى الجنينية.
سلالات الفيروس Zika تنفيذها مع هذه التقنية تشمل عزل المكسيكية7،MEX1-4419 والأفريقية عزل السيد-766 معزولة في عام 194720. MEX1 زكى-44 كانت معزولة في ولاية شياباس بالمكسيك في كانون الثاني/يناير 2016 من المصابين بعوض الزاعجة المصرية البعوض. حصلنا على هذا الفيروس بإذن من خلال الفرع الطبي بجامعة تكساس في غالفستون (يزيد). وبالإضافة إلى ذلك، تم تلقيح حمى الضنك فيروس النمط المصلي المسيطر 2 (DENV2) استخدام هذا الأسلوب في دراسة مقارنة. DENV2، سلالة S16803 (تسلسل GU289914 بنك الجينات)، كانت معزولة من عينة مريض من تايلاند في عام 1974، وباساجيد في الخلايا C6/36. الفيروس باساجيد مرتين في الخلايا فيرو بمركز المرجع العالمي "الفيروسات الناشئة" وسيتناقش (ورسيفا) قبل الحقن الماوس. وهذا يدل على أن هذا الأسلوب يعمل بنفس القدر أيضا لسلالات متنوعة من زيكف وفلافيفيروسيس الأخرى التي قد يكون لها تأثير على نمو الدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الحيوانات استخدام بروتوكولات اتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان في جامعة كاليفورنيا الجنوبية وجامعة جورجيا. يتم تنفيذ أساليب القتل الرحيم للسدود الحوامل والكبار وفقا للبروتوكولات المعتمدة: الخنق ثاني أكسيد الكربون، متبوعاً بخلع عنق الرحم كوسيلة ثانوية لضمان القتل الرحيم. هي euthanized الجراء الوليد بقطع الرأس.
تنبيه: ينطوي البروتوكول التالية على التعامل مع فيروسات المسببة للأمراض. وينبغي اتخاذ الاحتياطات المناسبة أثناء التعامل مع الفيروس. يجب موافقة مسبقة اللجنة المؤسسية المناسبة لاستخدام كافة البروتوكولات.
1-الجنينية تلقيح Intracerebral فيروس Zika
- للتزاوج الحوامل موقوت، تنظر ظهر اليوم بعد التزاوج ك E0.5. زوج الفئران في نهاية اليوم، وتحقق من المقابس في الصباح الباكر للحد من تقلب التزاوج مرة.
- إعداد الإبرة الزجاج قبل الجراحة. سحب الإبرة وقطع في 1/3 طوله، ثم شحذ بزاوية 45 درجة باستخدام طاحونة ميكروبيبيتي مع بالتنقيط مياه حتى المسام هو الحجم إلى 50-70 ميكرومتر. نصائح إبرة الاختيار تحت ستيريوسكوبي لجودة والكسر.
- إبقاء الفيروس الكوة على الجليد. فقط قبل الجراحة، تحميل ميكس حقن زيكف إبرة حقن الزجاج المعدة. تجميع حقن الغاز محكم المحاقن (50 ميليلتر الحجم)، ومرفق اللوير لوك، والأنابيب، وتشبع المحاقن تجميعها مع الأنبوب مع الزيوت المعدنية. مرة واحدة مشبعة، إرفاق الإبرة، ورسم ~ ميليلتر 6-7 زيكف في الإبرة (~ 1 ميليلتر هو 1.7 × 106 مل/TCID50).
- حقن الحوامل C57BL/6J أو الفئران 129S1/سفيمج مع يوم الجنينية E14.5 الأجنة (للحقن داخل الجمجمة) أو الأجنة E10.5 (للحقن داخل الرحم) مع الكيتامين هيدروكلوريد (80-100 مغ/كغ) وإكسيلازيني (5-10 مغ/كغ) المخفف في المحلول الملحي المعقم إينترابيريتونيلي للحث على التخدير في الأم. وبدلاً من ذلك، تخدير الأمهات مع isoflurane isoflurane رصد تقدمها الاستنشاق، مع مسح النفايات الغازية، إذا كان ذلك مناسباً. حقن البوبرينورفين ريال (0.5-1.0mg/kg) تحت الجلد للحث على التسكين.
- اختبار قرصه تخديره من الأمهات على طرف إصبع القدم أو الذيل وثم وضع لهم ضعيف على منصة تدفئة الموافقة على الحيوان (لوحة الحرارية من 2.5 100 × 200 ملم). ملقط قرصه إصبع القدم ليست عقيمة ولا تستخدم للتعامل مع الأنسجة في الجراحة. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام الأيدي القفاز لاختبار منعكس سحب قرصه أخمص القدمين.
ملاحظة: تشير إلى الخاصة بك الموظفين البيطريين المؤسسية المحيطة بالجراحة يفضل تدفئة أسلوب. كان وضع غطاء بين هذا وسادة تدفئة والحيوان. - إضافة مرهم العيون إلى العيون.
- يحلق على سطح البطن وتعقيم مع اليود والكحول ثلاث مرات. البديل مناديل اليود والكحول؛ المسح في حركة دائرية بعيداً عن موقع الجراحية.
- ثني الجلد المحيطة بالموقع الجراحي مع أقمشة معقمة لتجنب التلوث بالشق والصكوك.
ملاحظة: فتح ثني ينبغي أن لا تكون أكبر من إعداد موقع الجراحية؛ الشعر لا ينبغي أن ينظر في فتح ثني. - قرصه الجلد الأم بعيداً عن بطنها بالملقط وقص أسفل البطن في سطر 1-1.5 سم في الخط السهمي الآنسي مع مقص الجراحية المعقمة. هذه التخفيضات في الجلد وزيادة في تجويف البطن حيث أن الأجنة معرضة الآن.
ملاحظة: تستخدم المقص الجراحي لجدا الجلد وطبقة البريتوني. وتستخدم الصكوك العقيمة وقفازات لكل عملية جراحية. - قطع فتحه في منتصف شاش معقم صغيرة وتنطبق على رأس افتتاح العمليات الجراحية. هيدرات مع المالحة العقيمة. سحب الأجنة من خلال الشق للراحة على شاش معقم، مع الحرص على عدم إزالة الأجنة أكثر من 4-5 مع التركيز على القرن الرحم واحد في وقت واحد.
- هيدرات الأجنة مع سالين معقم قبل وخلال التطعيم التأكد من أنهم لم تجف. تتبع عدد الأجنة التي يتم حقنها ومواقعها داخل القرن الأفريقي الرحم. وهكذا تعامل الأجنة الفردية كتجارب منفصلة، كما الأجنة لا تقم بتغيير الموقف حين وضع في الرحم. (الاستمرار في الخطوة 1، 15 للحقن داخل الرحم).
- بلطف ضع ملعقة تحت رأس الجنين. تسليط الضوء الأجنة جيدا مع مصباح لتصور خيوط الرأس والجمجمة.
ملاحظة: يتبع الأسلوب العقيم، بما في ذلك القفازات الجراحية المعقمة والصكوك. بعد البنود غير معقمة (مثل المصباح) يتم التلاعب بها، وقفازات ينبغي الاستعاضة بقفازات معقمة جديدة قبل التعامل مع أدوات معقمة والمناطق. - رفعت مباشرة ضد جدار الرحم موضع الرأس عن طريق التلاعب في الجنين مع كل من مصباح (خلف الرأس للرؤية) وأصابع مجاناً حتى رأس الجنين والذي عقد في مكان باليد غير المهيمنة.
ملاحظة: وضع الجنين هو جزء هام والأسلوب الذي يأخذ ممارسة معظم. الكثير من الضغوط الإصبع يمكن أن تتلف الأغشية embryonic مما أدى إلى هلاك وليس ما يكفي من الضغط يمكن أن تجعل من الصعب الحقن. - استخدام الأوعية الدموية تعمل على طول خياطة الجمجمة كدليل. حقن فيروس زيكف (~ 1 ميليلتر، 1.7 × 106 TCID50 مليلتر عزل المكسيكي MEX1-44) في البطينات الجانبية لأدمغة الأجنة E14.5 مع المجتمعون المحاقن والإبر. استخدام مراقبة وسائط الإعلام كحقنة شام.
- لتحسين القدرة على الاحتفاظ الحمل، وتجنب الفيروسية حقن الأجنة اثنين بجوار المبايض والأجنة اثنين بجوار المهبل العلوي (الشكل 1A). عموما، يتم حقن الأجنة لا يزيد عن 6 في القمامة تقليل الوقت اللازم لعملية جراحية، ومنع فقدان الجنين.
- وضع الأجنة حقن مرة أخرى إلى السدود للحوامل، وملء تجويف البطن مع ~ 0.5 مل سالين معقم. إغلاق وخياطة كل عضلة البطن البريتوني أولاً وثانيا ثم خياطة طبقة الجلد الخارجية مع 4.0 خيوط عقيمة. فمن الأفضل استخدام خيوط متقطعة؛ هناك إمكانية ل dehiscence الجرح إذا كان الماوس يمضغ خياطة الجروح.
- ضع الماوس في قفص جزئيا يستريح على وسادة تدفئة للسماح بالماوس للهروب إلى منطقة غير ساخنة إذا لزم الأمر. مراقبة الأمهات في حين أنهم استرداد (ح 1-2) من التخدير. تطوير الأجنة بعد عملية جراحية لتفاوت الأوقات وفقا للتجارب الفردية.
-
الحقن داخل الرحم
- مع واحد من القرن الرحم والأجنة المعرضين، استخدام إبرة المحقن و 27 ز 1 مل حقن 100 ميكروليتر Zika الفيروس (106 تسيد50 وحدة علقت في 100 ميكروليتر دميم)، أو مراقبة المتوسطة، في الفضاء داخل الرحم أو الأنسجة المشيمية. ملاحظة قد تم حقن الأجنة التي لتشريح المرحلة الجنينية. انظر العمل المنشورة سابقا لمزيد من التفاصيل18.
- مكان حقن الأجنة إلى السدود للحوامل، وملء تجويف البطن مع ~ 0.5 مل سالين معقم. إغلاق وخياطة العضلات البطن البريتوني أولاً وثانيا ثم خياطة طبقة الجلد الخارجية مع 4.0 خيوط عقيمة. فمن الأفضل استخدام خيوط متقطعة؛ هناك إمكانية ل dehiscence الجرح إذا كان الماوس يمضغ خياطة الجروح.
- ضع الماوس في قفص جزئيا يستريح على وسادة تدفئة للسماح بالماوس للهروب إلى منطقة غير ساخنة إذا لزم الأمر. مراقبة الأمهات في حين أنهم استرداد (ح 1-2) من التخدير. تطوير الأجنة بعد عملية جراحية لتفاوت الأوقات وفقا للتجارب الفردية.
2. الولدان تلقيح Intracerebral فيروس Zika: P0/P1
- ضمان أن الحقن حقن الغاز (10 ميليلتر حجم) والإبر لا مسدودة. تنظيف واختبار عن طريق تحميل ثلاثة 20 مل المحاقن مع الإبر 26-قياس: واحدة مع المالحة وواحدة مع الإيثانول 70%، وواحدة مع الهواء لمسح الحلول. تعقيم بالتبييض 10% إذا استخدمت مسبقاً للحقن بالفيروس.
- يبقى الفيروس على الجليد. تحميل المحاقن بملئه بالمياه المالحة للحد من حجم القتلى في المحاقن، ورسم ميليلتر 0.75 من الهواء لفصل المحلول الملحي من مواد الحقن.
- قم بإعداد غرفة إنعاش هوميديفيد المعالجون لحقن الجراء. استخدام كتلة تدفئة، ضع حاوية كلوسيابل (مثل مربع تلميح فارغ) مع شاش معقم ويرطب مع المالحة. يسخن فإنه قبل البدء بالحقن.
- إعداد ميكروينجيكتور بما في ذلك الضخ والمراقب المالي. تحديد رمز نوع الجهاز للمحاقن المحددة (أي، لحقنه 10 ميليلتر، نوع الجهاز هو "D"). تحديد سرعة الحقن.
- جمع الجراء يوما بعد الولادة 0 أو 1 (P0/P1) قرب الإعداد الجراحي. تحميل المحاقن الحقن بالفيروس. تطهير جبل الرأس ألجرو مع 70% EtOH.
- التفاف الجراء في طبقة رقيقة من الشاش ودفنها تماما في الجليد لتحقيق إقامة دولة مخدر. الجراء كريوانيسثيتيزيد لأدنى 5 ضمان أن الجراء تخديره بما فيه الكفاية لحقن قبل تنفيذ رشة ذيل/تو دون استجابة. وهذا غلة تقريبا 15 دقيقة دولة مخدر.
- ضع ألجرو في جبل الرأس وتعقيم سطح الرأس باليود، وفي الإيثانول (ثلاث مرات) ثم يمسح الجافة مع مسح عقيمة (الايزوبروبانول أو 70% EtOH).
- وضع علامة لامدا مع علامة سوداء وتسجيل الإحداثيات في لامدا باستخدام أداة ستيريوتاكسيك. قياس المسافة من لامدا إلى الحافة العين وبداية من الإحداثيات ستيريوتاكسيك أمداً حساب المسافة 2/5 من لامدا للعين (لنصفي إذا كنت يتم الحقن على حد سواء).
- إعادة فحص عمق مخدر قبل إنشاء حفرة في موقع الحقن. استخدام إبرة 26-قياس للثقب بعناية وسطحي في فروة الرأس والجمجمة في مكان الحقن (الجمجمة لينة جداً في حديثي الولادة) لخلق فرصة لابره حقن.
- انخفاض إبرة حقن في موقع ثقب، ومرة واحدة فقط قد أخلت بالإبرة الجلد، حساب عمق 1 مم للحقن (البطين الجانبي) باستخدام أداة ستيريوتاكسيك.
- حالما يتم خفض الإبرة إلى عمق الحقن، برنامج ميكروينجيكتور لحقن: 1 ميليلتر من الفيروسات، بمعدل 10 nL/s، الحقن حوالي 1 ميليلتر ما يزيد على 1.5 دقيقة (~ 1 ميكروليتر 3.4 × 105 TCID50/مل زيكف).
- عند انتهاء الحقن، انتظر 30 ثانية، وسحب الإبرة بزيادات 0.5 ملم بتدوير المسمار (دورسالي)، في انتظار 30 ثانية بعد كل زيادة.
ملاحظة: وهذا يقلل التسرب من حقن الفيروس. - بمجرد إزالة، أما بسرعة تحميل الإبر والمحاقن مع الفيروس أكثر (أنواع مختلفة من الفيروسات أو عناصر صورية ينبغي تحميلها إلى محاقن منفصلة/الإبر) أو إزالة ألجرو من جبل الرأس إلى الدائرة هوميديفيد المعالجون مسبقاً. رصد ألجرو كل بضع دقائق لقياس مدى الانتعاش. يستعاض في الجراء القمامة...
3-الكبار تلقيح Intracerebral فيروس Zika
- حقن الفئران الكبار إينترابيريتونيلي مع الكيتامين هيدروكلوريد (80-100 مغ/كغ) وإكسيلازيني (5-10 مغ/كغ) المخفف في المحلول الملحي المعقم للحث على التخدير. حقن البوبرينورفين ريال (0.5-1.0mg/kg) تحت الجلد للحث على التسكين. قرصه تو/ذيل الماوس للتأكد من حالتها مخدر، وفيما بعد جبل على الصك ستيريوتاكسيك (مع وسادة تدفئة) شل رأسه أثناء الجراحة.
- إضافة مرهم العيون إلى العيون لمنع جفاف خلال جراحة عيون الماوس. حلق فروة الرأس ابتداء من وراء العينين إلى بداية الأذنين. تعقيم الجلد المكشوفة باليود و 70% EtOH ثلاث مرات. البديل مناديل اليود والكحول؛ المسح في حركة دائرية بعيداً عن موقع الجراحية.
- إعادة فحص عمق مخدر قبل إينسيسينج الجلد. استخدام مشرط، جعل شق 0.5 سم على طول الخط السهمي الآنسي رئيس في مكان معقم، تعريض بريجما. استخدام اقتراح متداول مع قضيب القطن ذات الرؤوس، مسح سطح الجمجمة أنسجة سحائي، بينما في نفس الوقت يدفع الجلد بعيداً عن مواقع الحقن.
- بدءاً من بريجما، محاذاة مثقاب الجراحية وتحديد مواقع الحقن باستخدام الإحداثيات التالية: AP-0.50 مم، مل: +/--1.5 ملم. استخدام دواسة القدم التحكم، حفر في الجمجمة ببطء فيما يتعلق بحفر العظم فقط حتى تم مسح ثقب للابرة.
- يستعاض عن التدريبات مع مضخة ميكروينجيكتور والمحاقن الغاز (10 ميليلتر الحجم) على ستيريوتاكسيك. ترك فقاعة هواء صغيرة بين المحلول الملحي والفيروس، رسم ~ ميليلتر 4-5 من الفيروس. تحديد رمز نوع الجهاز لوحدة التخزين حقنه معينة (أي، د عن 10 ميكروليتر حجم المحاقن). انخفاض الإبرة للعنف المنزلي:-1.50 مم من سطح الدماغ. لبرنامج لحقن 1 ميليلتر من الفيروسات، بمعدل 10 nL/s، الحقن حوالي 1 ميليلتر ما يزيد على 1.5 دقيقة.
- عند انتهاء الحقن، انتظر 30 ثانية، وإزالة الإبرة بزيادات 0.5 مم، الانتظار 30 ثانية بعد كل دورة. هذا يقلل من تسرب الفيروس حقن والدفق.
- عند الانتهاء injection(s)، استخدام الملقط لتخفيف الجلد واسترداد الجمجمة المكشوفة. خياطة فروة الرأس مرة أخرى معا باستخدام خيوط 4.0 وإزالة الماوس من الصك ستيريوتاكسيك. مكان الماوس في قفص جزئيا يستريح على وسادة تدفئة للسماح بالماوس للهروب إلى منطقة غير ساخنة إذا لزم الأمر ورصد في حين أنهم استرداد (ح 1-2) من التخدير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر الصور التمثيلية لأساليب عملنا حقن التطعيم زيكف الدماغ الجنينية في المخططات التي تصور حقن إينتراسيريبرال (الشكل 1A) وداخل الرحم وحقن إينترابلاسينتال (الشكل 1B)، التي توضح ينبغي أن ينظر إلى طريقة السد الحوامل والأجنة، والموجهة لعملية جراحية (بروتوكول التطعيم الجنينية). الشكل 2 ألف معارض الإصابة زيكف (MEX1-44) (إيمونوستاينيد مع الجسم ضد مستضد المجموعة مصفر، أخضر) في قشرة الدماغ E18.5. Pax6 (أحمر) تسميات الشخصيات في قشرة النامي. تم تلقيح زيكف في أدمغة الأجنة E14.5. باستخدام مقايسة TCID50 من عينات الأنسجة7، تحليلاتنا منحنى النمو تظهر أنه في زيكف يمكن كفاءة النسخ المتماثل وتنمو في العقول النامية (الشكل 2، ج 2)، كما نشرت7. يظهر الشكل 2D الإصابة ناجحة مع DENV2 في قشرة النامية استخدام طريقة التطعيم الجنينية. DENV2 تم الكشف عن استخدام جسم مضاد ضد مستضد المجموعة مصفر (أخضر). ويبين الشكل 2E العدوى بسلالة مختلفة من زيكف، نسب الأفريقية (MR-766). يوضح الشكل 2 واو على إصابة ممثل لتلقيح إينترابلاسينتال الطريق البديل، زيكف-آسيا (MEX1-44) في مرحلة E10.5.
الشكل 3 ألف من رسم تخطيطي لتصور المعالم التي تستخدم لتحديد مكان الحقن في البطينات الجانبية لتطعيم الجراء P0/1 زيكف. ويبين الشكل 3B العدوى زيكف (MEX1-44) في قشرة الدماغ P13 بعد حقن P0/1. زيكف (MEX1-44) تم الكشف عن استخدام الأجسام المضادة ضد مستضد المجموعة مصفر (أحمر). ويبين الشكل 4 حبات الفلورسنت (أحمر) التي كانت تستخدم لممارسة موقع الحقن، ونجاح حقن البطين الجانبي في البالغين.
رقم 1: تلقيح الجنينية زيكف- (أ) رسم تخطيطي يمثل التعرض للقرن الأفريقي الرحم واحدة، مع ملاحظة تجنب حقن الأجنة المتاخمة للمهبل والجنين الأكثر الجانبية على طول القرن الأفريقي. (ب) رسم تخطيطي يمثل التعرض للقرن الرحم واحد، يصور موقع إينترابلاسينتال والحقن داخل الرحم. تم تعديل هذه المخططات من على المنشور الأصلي21. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تلقيح زيكف الجنينية في E14.5- (أ) في E18.5 إصابة في الدماغ الجنينية مع زيكف-آسيا (MEX1-44) في كافة طبقات من اللحاء الجديد النامي (شريط مقياس هو 200 ميكرومتر). الخلايا العصبية السلف إيمونولابيليد مع Pax6 (أحمر) وزيكف عبر مصفر مستضد (أخضر). (ب) TCID50 النتائج من أنسجة المخ بعد الولادة يوم 3 (P3) تلقيح في E14.5 مع زيكف وآسيا (MEX1-44). أشرطة الخطأ تشير إلى s.e.m. من ثلاثة مقاييس مستقلة مع واحد وهمية والدماغ المصابة زيكف واحد في كل قياس (* * *ف < 0.0001، اختبار t Student's)7. (ج) TCID50 نتائج وصف نموذجي زيادة النمو منحنى فريميا زيكف في أنسجة المخ الأجنة المصابة. أشرطة الخطأ تشير إلى s.e.m. من ثلاثة مقاييس مستقلة مع واحد وهمية والدماغ زيكف-آسيا (MEX1-44) إصابة واحدة في كل قياس. تحليل التباين (ANOVA) يكشف عن زيادة كبيرة في عيار الفيروسية كعائدات التنمية7. (د) إصابة فيروس حمى الضنك (DENV2) الممثل علم الأنسجة (تلقيح الأجنة E14.5 مع ~ 1 ميليلتر من 3.4 × 105 مليلتر TCID50، شريط مقياس هو 200 أم) وأفريقيا زيكف (E) (MR766) إصابة الأنسجة التمثيلية (مقياس بار 200 ميكرومتر). (و) زيكف-آسيا (MEX1-44) إصابة الأنسجة التمثيلية من استراتيجية حقن إينترابلاسينتال (مقياس بار هو 200 ميكرومتر). في كل الصور، البقع هويشت الأنوية. تم تعديل هذه الأرقام على المنشور الأصلي7. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: علم الأنسجة التمثيلية لتلقيح P1 من زيكف- (أ) مخطط مما يدل على الأسلوب لتحديد مكان الحقن في البطينات الجانبية تكاثرية P1. (ب) إيمونوستينيد كريوسيكشنز الاكليلية الممثل مستضد المجموعة مصفر مع منخفضة (على اليسار، وهو شريط مقياس 100 ميكرومتر) وعالية (على الحق، وهو شريط مقياس 50 ميكرومتر) التكبير لتلقيح P1 من زيكف في P15 (~ 1 ميكروليتر 3.4 × 105 TCID50/مل زيكف). هويشت البقع الأنوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: بالغ مرحلة الحقن داخل البطيني. قد ضحى الماوس الكبار حقن مع الخرز الفلورسنت بعد وقت قصير من عملية جراحية لتحديد مدى نجاح موقع الحقن (شريط مقياس هو 200 ميكرومتر). ويمكن اعتبار كريوسيكشن السهمي فورا بعد تمزيقها كما الخرز لا تتطلب زيادة تلطيخ. هويشت البقع الأنوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الموصوفة هنا أسلوب التطعيم إينتراسيريبرال زيكف في مراحل الأجنة والأطفال حديثي الولادة والكبار لتحقيق الأضرار التي يسببها زيكف في نمو الدماغ. بينما مباشرة، وهناك بعض الاعتبارات التي ينبغي أن المحققين لضمان نوعية الدراسة وسلامة الأشخاص المعنيين.
DENV ارتباطاً وثيقا زيكف في جنس مصفر. DENV لا يرتبط سببياً باضطرابات الدماغ طب الأطفال في البشر. DENV2 يمكن أن تصيب بنجاح وتكرار في الدماغ باستخدام طريقة التطعيم الجنينية (~ 1 ميليلتر من 3.4 × 105 مليلتر TCID50) (الشكل 2D). لذلك، بالإضافة إلى مصابة فيرو خلية الإعلام (صورية)، يمكن استخدامها العدوى DENV كعنصر تحكم سلبية بغية دراسة محددة زيكف المرضية في الدماغ. من المهم تجنب الفيروسات التسرب في الرحم، مما يؤدي إلى تلوث غير المرغوب فيها الأخرى الأجنة. ولذلك، من الضروري التحقق من الأفراد المصابين وغير المصابين من خلال عزل أنسجة المخ من كل جنين تليها qRT-PCR أو المقايسة TCID50. يمكن إضافة صبغة للمتوسط الفيروسية بصريا تأكيد الحقن، ولكن بإجراء اختبار للتأكد من أن الصبغة لا تسبب الضرر نفسه.
معرض سلالات الماوس تقلب النمو، وذلك P1 حقن المواقع تحتاج إلى التحقق من كل خط الماوس. إجراء حقنه الوليد وهمية مع الخرز الفلورسنت لتصور موقع الحقن. سيتم إبلاغ هذه الدراسة الأولية عما إذا كان الحقن تصل البطين أو يذهب عميقا في أنسجة المخ. للحصول على نتائج مثالية، يمكن التضحية الجراء بعد وقت قصير من الحقن تحديد مكان الخرز الفلورسنت في البطين. رئيس ألجرو أكمله يمكن أن تكون ثابتة بين عشية وضحاها، مضمن، وكريوسيكتيونيد لمراقبة موقع الحقن بدقة. حقن بحقنه المشبعة النفط يتطلب خبرة ومن المستحسن أن ممارسة استخدام الحقن الشام مع صبغ على بارافيلم للتحقق من أن حجم حقن دقيقة.
تدابير السلامة الأحيائية الحاسمة في هذه الدراسات لتجنب الإصابة العرضية لموظفي المختبرات العاملة مع الفيروس. الموافقات على السلامة الأحيائية يجب أن مقدما في المرفق حيث يتم إنجاز العمل. يعتبر زيكف ممرض 2 مستوى السلامة الأحيائية (BSL2) مراكز الولايات المتحدة لمراقبة الأمراض والوقاية. ينبغي أن يكون جميع الأفراد العاملين مع الفيروس أو العمل في المناطق حيث يتم معالجة الفيروس علم وإطلاع مع بروتوكولات السلامة الأحيائية لمؤسستهم. ينبغي تطهير جميع الأدوات والأسطح المعرضة إلى زيكف أو DENV2 مع التبييض 10% لتدمير المتبقية الجسيمات الفيروسية بعد الاستخدام. النساء الحوامل أو تحاول أن تصور ينصح بعدم التفاعل مع مجالات البحث يتعرض إلى زيكف أو DENV2. يتم إصلاح جميع الأنسجة المستخدمة للأنسجة في 4% منهاج العمل لإلغاء تنشيط الفيروسات للتحليل. وينبغي أن يتم تخزين واستزراع الفيروس في الخلايا فيرو في غطاء مخصص لعمل BSL2. فيروسات الأسهم ومعايرة الأنسجة يمكن قياسها كمياً باستخدام بروتوكول TCID50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب يود أن ينوه الدكتور عبد اللطيف بينريس في جامعة روتشستر للإرشاد والمناقشات ذات الصلة بتعلم الكبار الجراحية وتقنيات الوليد. الكتاب تود أيضا أن نعترف بالدكتور جيمس لودرديل في UGA لاستخدام معدات ستيريوتاكسيك والمناقشات المتعلقة بإعداد المنهجية لهذا الأسلوب، والنهوض بمؤسسة بحوث كلية العلماء (الأقواس) لما الدعم ودعمنا المعاهد الوطنية للصحة (NINDS المنح R01NS096176-02، R01NS097231-01 و F99NS105187-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | - | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | - | |
| Mineral Oil | VWR | - | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
References
- Dreher, A. M., et al. Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection. J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).
- Lanzieri, T. M., et al. Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease. J of Perinatol. 37 (7), 875-880 (2017).
- Naseer, M. I., et al. A novel WDR62 mutation causes primary microcephaly in a large consanguineous Saudi family. Ann Saudi Med. 37 (2), 148-153 (2017).
- Abuelo, D. Microcephaly Syndromes. Semin Pediatr Neurol. 14 (3), 118-127 (2007).
- Nicholas, A. K., et al. WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly. Nat Genet. 42 (11), 1010-1014 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (38), 16595-16600 (2010).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. Zika virus infection disrupts neurovascular development and results in postnatal microcephaly with brain damage. Development. 143 (22), 4127-4136 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Miki, T., Fukui, Y., Takeuchi, Y., Itoh, M. A quantitative study of the effects of prenatal X-irradiation on the development of cerebral cortex in rats. Neurosci Res. 23, 241-247 (1995).
- Cragan, J. D., et al. Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation. Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106 (11), 972-982 (2016).
- Cragan, J. D., et al. Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66 (8), 219-220 (2017).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016. Bull World Health Organ. 95 (3), 191-198 (2017).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105 (1), 7-17 (2001).
- Driggers, R. W., et al. Zika Virus Infection with Prolonged Maternal Viremia and Fetal Brain Abnormalities. N Engl J Med. 374 (22), 2142-2151 (2016).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106, 1-16 (2013).
- Li, H., et al. Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters Proliferation. Cell Stem Cell. 19 (5), 593-598 (2016).
- Vermillion, M., et al. Intrauterine Zika virus infection of pregnant immunocompetent mice models transplacental transmission and adverse perinatal outcomes. Nat. Commun. 8, 14575 (2017).
- Goodfellow, F., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells Dev. 25 (22), 1-27 (2016).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. Zika Virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and Dengue virus. Development. , (2017).
