Madagaskar fresende kakerlakk som en alternativ ikke-pattedyr dyr modell å undersøke virulens patogenesen og narkotika effekt

Summary

Vi presenterer en protokoll for å utnytte Madagaskar fresende kakerlakk som en alternativ ikke-pattedyr dyr modell å gjennomføre bakteriell virulens, patogenesen, medikament toksisitet, narkotika effekt og medfødte immunforsvaret studier.

Abstract

Mange aspekter av medfødt immunitet er bevart mellom pattedyr og insekter. Et insekt, Madagaskar fresende kakerlakk fra slekten Gromphadorhina, kan benyttes som en alternativ dyr modell for studiet av virulens, vert-patogen samhandling, medfødte immunforsvaret og narkotika effekt. Details for the rearing, care and breeding of the hissing cockroach are provided. Vi viser også hvordan det kan bli infisert med bakterier som intracellulær patogener stokk mallei og B. pseudomallei, B. thailandensis. Use of the hissing cockroach is inexpensive and overcomes regulatory issues dealing with the use of mammals in research. I tillegg er resultater funnet ved hjelp av fresende kakerlakk modellen reproduserbare og ligner de får pattedyr modeller. Dermed representerer den Madagaskar fresende kakerlakk en attraktiv surrogat vert som skal utforskes når du utfører dyrestudier.

Introduction

Bruk av insekter som alternativ ikke-pattedyr dyremodeller bakteriell patogenesen og medfødte vert forsvar har vært økende momentum de siste årene. Logistisk, er dette på grunn av deres relativt rimelig pris og bekvemmeligheten ved å skaffe håndtering og omsorg for insekter sammenlignet pattedyr. Det er også noen regulerende politikk regulerer bruk av forskning; Det er ikke underlagt purview eller begrensninger som er fastsatt av alle dyr bruk komiteen eller statlig organ. Insekter som surrogat dyremodeller er spesielt mottagelig for omfattende screening undersøkelser for virulens faktorer, vert-patogen interaksjoner og vurderinger av anti-mikrobielle narkotika effekt. Bruken kan redusere antall pattedyr brukes til forskning og dermed overvinne noen av de etiske dilemmaene iboende gjennomføringen av dyr eksperimentering ^1,2.

Insekter kan tjene som surrogat verter fordi det er en høy grad av alminnelighet mellom de medfødte immunsystem insekter og pattedyr ^1,3. Både insekt plasmatocytes og pattedyr makrofager phagocytose mikroorganismer ⁴. Insekt tilsvarer nøytrofile er hemocyte ^5,6. Intracellulær oksidativt burst stier i insekt og pattedyrceller ligner; frie radikaler i begge produseres av orthologous p47^phox og p67^phox proteiner ⁵. Signalnettverk kaskader nedstrøms Toll reseptorer i insekter og Toll-like reseptorer og Interleukin-1 i pattedyr er også bemerkelsesverdig lik; begge føre til produksjon av antimikrobielle peptider som defensins ⁷. Insekter kan dermed benyttes for å studere generell medfødte immunsystemet mekanismer som deles av Metazoer.

Et insekt kalt Madagaskar fresende kakerlakk fra slekten Gromphadorhina, er en av de største kakerlakk artene som finnes, vanligvis nå 5 til 8 cm på modenhet. It is native only to the island of Madagascar and is characterized by the hissing sound it makes - a sound that is produced when the hissing cockroach expels air through respiratory openings called spiracles ⁸. Den karakteristiske susing fungerer som en form for sosial kommunikasjon mellom fresende cockroaches for frieri og aggresjon ⁹ og kan bli hørt når en mann er forstyrret i sitt habitat. The Madagascar hissing cockroach is slow moving compared to the American cockroach and other urban pest species. Det er lett å omsorg for og rase; en gravid fresende kakerlakk kan produsere 20 til 30 avkom samtidig. En baby fresende affinitet kalt en nymfe, når seksuell modenhet i 5 måneder etter gjennomgår 6 molts og kan leve opp til 5 år både i naturen og i fangenskap ⁸.

Vi har utnyttet Madagaskar fresende kakerlakk som surrogat vert for infeksjon med intracellulære patogener stokk mallei, B. pseudomalleiog B. thailandensis ^10,11. Virulens av disse patogener i fresende cockroaches var i forhold til deres virulens i benchmark dyr modellen for stokk, Syreren hamster. Vi fant at 50% dødelig dose (LD₅₀) B. pseudomallei og B. mallei var lik i begge modeller ¹¹. Interessant, er B. thailandensis, selv om avirulent i gnager modellen dødelig i fresende kakerlakk ¹¹. Denne forskjellen med hensyn til B. thailandensis infeksjon understreker nytten av den fresende kakerlakk modellen; B. thailandensis demping mutanter kan lettere løses i den fresende kakerlakk enn i gnager modeller. Videre som B. thailandensis brukes ofte som kan modell organismen for B. pseudomallei og B. mallei ^10,12,13, identifisere demping mutasjoner i det føre til lignende mål i sin mer virulente slektninger.

Despite the difference in virulence of B. thailandensis in the hissing cockroach versus the Syrian hamster, mutations in critical virulence factors, such as those in the type 6 secretion system-1 (T6SS-1), which are attenuating in B. mallei and B. pseudomallei, er tilsvarende demping for B. thailandensis ¹¹. Fresende kakerlakk modellen valideres videre i den personlige T6SS mutanter (T6SS-2 til T6SS-6) i B. pseudomallei, som har ingen peiling på virulens i syrer hamsters, forblir virulente i fresende cockroaches ¹¹. Thus, the hissing cockroach is a viable surrogate animal model for the three Burkholderia species. We recently utilized the hissing cockroach as a surrogate animal model to examine the efficacy of the anti-malarial drug chloroquine (CLQ) against Burkholderia infection ¹⁰ and its toxicity.

Her beskriver vi de Stell og omsorg i Madagaskar fresende kakerlakk og gir detaljer om hvordan å infisere dette insektet med tre stokk arter. Furthermore, we illustrate that the hissing cockroach is a viable surrogate model to study virulence and drug efficacy in Burkholderia infections and that it likely can also serve as a surrogate host for other bacterial pathogens in similar studies.

Protocol

1. forberedelser for å opprettholde en fresende kakerlakk koloni

1. Forberede bur for de fresende cockroaches å leve i. Bruke et tynt lag med vaselin, ca 20 til 30 mm bredde, omkrets av indre veggene øverst i buret for å hindre de fresende cockroaches klatre ut av buret og unnslippe.
   Merk: Fresende cockroaches kan bli plassert i en rekke containere som har en stor gulvplass er tilstrekkelig høyde og har lokk. Bruk musen bur (~ 43 cm x 23 cm x 20 cm). For burene til 37 ° C, gjelde ikke vaselin.
2. Inkluder en papp egg kartong plassert opp-ned inne byrået å gi et gjemmested for naturlig sjenert insekter. Ikke erstatte papp egget kartongen med en laget av polystyrenskum å unngå inntak av plast.
3. Gir ikke sengetøy for enklere opprydding og øke synligheten av nyklekte nymfer.
4. Få tørr hunden næringen som inneholder en sammensetning av ~ 20% råprotein. Grovt slipe hundemat med blender eller food prosessor og lagre på 4 ° C.
5. Få flere grunt retter og akvariet steiner eller en svamp for mat og vann.
   Merk: Petri retter er recommeded.

2. fresende kakerlakk omsorg og oppdrett

1. Få outbred Madagaskar fresende cockroaches (~ 5 cm) fra en reklamen oppdretter. Arten brukes i denne protokollen er Gromphadorhina laevigata. Pakk ut esken som inneholder de fresende cockroaches umiddelbart ved mottak.
2. Følg passende institusjonelle retningslinjer for bruk av personlig verneutstyr i håndtering av dyr.
   Merk: Bruk tykk engangshansker for håndtering cockroaches som tarsal klørne på en fresende kakerlakk er skarp.
3. Overføre opptil 75 store fresende cockroaches (> 3 cm) per store buret. Overføre nylig skravert og mindre nymfene (< 3 cm) til separate bur.
   Merk: Å holde betydelig mer enn 75 store fresende cockroaches per musen bur kan føre til dårligere helse av kolonien og kan også føre til dødsfall.
4. Håndtere nylig molted affinitet som natur farge, forsiktig og unngå å klemme det. Alternativt kan exoskeleton til mørkere, og forherde før håndtering.
   Merk: Det er ikke nødvendig å fjerne midd, Gromphadorholaelaps schaeferi, som ofte følger fresende cockroaches mottak fra oppdretter. Det gunstige midd holde de fresende cockroaches ren og er ufarlig for mennesker.
5. Feed fresende cockroaches med bakken tørr hunden næringen i et grunt fat én eller to ganger i uken. Gi nok hundemat for å sikre at de fresende cockroaches ha nok mat til neste mating. Kast noe mat som har blitt våt og mugg.
6. I tillegg hundemat, gi kutte opp frukt og grønnsaker, som epler, poteter eller salat, i et grunt fat. Kast moldy eller råtten mat.
7. Gi drikkevann én eller to ganger i uken i et grunt fat, men må ikke overfylle retten for å hindre søl i buret. Sett lite akvarium steiner eller en svamp i retten å gi en landing pad for små nymfer. Bruk omvendt osmose vann, hvis tilgjengelig.
8. Holde fresende cockroaches i mørket ved temperaturer mellom 21 ° C til 30 ° C. Holde store fresende cockroaches til eksperimentering ved lavere temperatur (~ 21 ° C) ~ 2 måneder å redusere avl og graviditet. I motsetning, hold nymfer ved høyere temperaturer (28 ° C til 30 ° C) for å skynde vekst.
   Merk: Holde burene ved romtemperatur (21 ° C) i mørket kabinett.
9. Gir fuktighet ved å inkludere en separat panne med vann hvis fresende cockroaches holdes i en inkubator.
10. Feilfri byrået av øste ut tørr avføring regelmessig eller ved å overføre fresende cockroaches å en ren bur hver 2 til 3 uker. Holde bunnen av byrået tørr. Feilfri byrået umiddelbart hvis overflødig vann tillates å samle og bland med ekskrementer på bunnen av byrået.

3. kakerlakk forberedelse til eksperimentering

1. Overføre riktig antall fresende cockroaches i bur til en 37 ° C fuktet inkubator 1 til 3 uker før et eksperiment til å akkumulere. Inkluder en kontrollgruppe for injeksjon. Dette Akklimatisering er avgjørende for å unngå temperatur støt under eksperimentering.
2. Gjelde ikke vaselin for bur til 37 ° C fordi jo høyere temperatur smelter gelé.
3. Sjekk de fresende cockroaches hver 1 til 2 dager for å erstatte mat og vann og feilfri byrået.
4. Få helt disponibel plastic mat containere med lokk for gruppering av de fresende cockroaches under eksperimentering. For ventilasjon, hull i lokket eller på siden av beholderen med en spiker og hammer.
   Merk: Bruk skrukork containere over snapin cap beholdere i innstillingen biosikkerhet nivå 3. Feste cap beholdere kan bli forsterket med tape, om nødvendig.
5. På dagen for injeksjon, distribuere 6 til 12 akklimatisert fresende cockroaches i grupper per container, sikre lik fordeling av sex og kroppens masse.
6. Avgjøre sex av personlige fresende cockroaches. Avgjøre sex av prominence av horn på menn og mangel derav på kvinner.
7. Veie de personlige fresende cockroaches. For å lette vekt av en fresende kakerlakk på balansen, legge den i to veier båter som har vært tared.
   Merk: For konsistens mellom eksperimenter, bruke fresende cockroaches med en vekt på 4 til 8 g. Men ingen forskjell i overlevelse etter smitte har blitt funnet mellom små (1,5 til 2 g) og stor (6 til 8 g) fresende cockroaches. For medikament studier, bruke fresende cockroaches med en vekt på ~ 5 g for å få en mer konsekvent narkotika konsentrasjon per kroppen masse.
8. I stedet for en vann rett, Inkluder høy vann innhold frukt eller grønnsaker, som en del av apple eller potet. Kast råtne mat. Gir ikke vann for å beholde beholderen tørr.
9. Tilbake fresende cockroaches til 37 ° C til injeksjoner.

4. bakteriell kultur og preparater

Merk: Bakteriell arten brukes i denne protokollen er B. mallei, B. pseudomallei og B. thailandensis. Alle manipulasjoner med B. mallei og B. pseudomallei må utføres i klasse II eller klasse III biologiske sikkerhetskabinett skap ligger i et biosikkerhet nivå (BSL) 3 laboratorium. Utføre manipulasjoner med B. thailandensis i lignende biologiske sikkerhetskabinett skap ligger enten i en BSL2 eller BSL3 laboratorium. Følg institusjonelle standard prosedyre for BSL3 arbeid. Følg institusjonelle retningslinjer for bruk av personlig verneutstyr når du håndterer bakterier.

1. Forberede en master plate av stokk minst 3 dager før infeksjon. Bruk Luria-Bertani (Lennox) (LB) agar B. pseudomallei eller B. thailandensis og bruk LB agar supplert med 4% glyserol for B. mallei. Strek bakterier fra en 25% glyserol lager lagret på-80 ° C.
   Merk: Alltid strek master platen direkte fra frosne glyserol lager; unngå føljetong passering av bakterier fra platen til plate som dette medfører redusert virulens.
2. Vaksinere 10 til 20 mL LB buljong med flere kolonier av B. pseudomallei eller B. thailandensis fra master plate. Tilsvarende vaksinere LB kjøttkraft supplert med 4% glyserol for B. mallei.
3. Riste kjøttkraft kulturen på 175 til 250 rpm på 37 ° C for ~ 18 h.
4. Sentrifuge 2 til 3 mL kultur på 5000 x g i 10 min.
5. Forkast nedbryting og resuspend bakteriell pellet i sterilt fosfat bufret saltvann (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂PO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7.4).
6. Fortynne bakterier med PBS å oppnå en optisk tetthet (OD) på 0,5, målt på en absorbans ved 600 nm i et spektrofotometer.
7. Serielt fortynne bakterier tidoble i PBS fra Start OD på 0,5. Bruk disse suspensjoner for infeksjon.
8. Bestemme kolonien forming enheter (CFU) av inoculum av føljetong fortynning og plating av 100 µL dele på agar medier. Inkuber plater ved 37 ° C i 24 til 48 h.

5. narkotika forberedelser

1. Fastslå riktig mengde narkotika gis per kroppen masse. The CLQ dosage given to the hissing cockroach was based on the standard dosage for mammals, which is 50 mg/kg/day.
2. Resuspend eller fortynne stoffet rundt i bilen. For eksempel fortynne CLQ i PBS i en konsentrasjon av 12 mg/mL. Denne konsentrasjonen gir 300 µg narkotika til en ~ 6 g fresende kakerlakk i en 25 µL injisert volum.
3. Eventuelt sterilisere narkotika løsningen ved å sende det gjennom en 0.22 µm sprøyten.
4. Lagre narkotika løsningen på 4 ° C før bruk. Varm stoffet løsningen minst 21 ° C (romtemperatur) før injeksjoner.

6. montering av injektoren

1. Sett pekeren til ønsket volum (25 µL) ved å vri justeringsskruen på en repeterende pipette.
2. Skyv utgivelsen bar den repeterende pipette innover og dra inn sylinderen utover. Repeterende pipette er nå klar til å betjene en lastet sprøyte.
   Merk: Kalibrere volumet utløst av repeterende pipette ved å måle mengden vann kastet på en balanse.
3. Fyll en 1 mL sprøyte med suspensjon som inneholder bakterier eller narkotika.
4. Feste sprøyten til en steril 26 eller 27 G x ½ tomme (eller kortere) p.
5. Trykk sprøyten flyte luften bobler til toppen og utvise boblene og noen suspensjon i en container fylt med 10% blekemiddel.
6. Feste sprøyten på sprøyten klippet av repeterende pipette med nål skråkanten vender.
7. Trekke baren utgivelsen utover og trykk dispenser fast å utføre tom injeksjoner i en container fylt med 10% blekemiddel til sprøytestempelet er mot overflate.
8. Utføre 1 eller 2 flere tomme injeksjoner for å sikre at væsken er kastet ut av sprøyten. Den repeterende pipette er klar for injeksjoner.

7. kakerlakk injeksjoner

1. Utfører alle kakerlakk injeksjoner i en klasse II eller klasse III biologiske sikkerhetskabinett regjering i en BSL2 eller BSL3 bruker institusjonelle anbefalt personlig verneutstyr.
2. Rent arbeid overflater i sikkerheten kabinett som kan komme i kontakt med de fresende cockroaches. Bruk 10% blekemiddel etterfulgt av 70% etanol for å fjerne gjenværende blekemiddel. La overflaten luften tørr.
3. With one hand, grip the hissing cockroach by its side. Nakkens en fresende kakerlakk slik at ikke rekyl under injeksjon. Bend the hissing cockroach slightly so that the cutaneous membranes between the abdominal terga are exposed.
4. With the other hand, hold the repetitive pipette such that the needle is at a 0° to 30° angle from the dorso-ventral midline of the hissing cockroach. Punktering kutan membranen tilstøtende 3^rd, 4^theller 5^th tergum fra den bakre enden.
   NOTE: Entry of the needle into the hissing cockroach at the angle indicated ensures that the needle does not go through and exit out of the hissing cockroach. Injeksjonsstedet sikrer at utløst materialet som finnes i bukhulen fylt med hemolymph. Øv holde de fresende cockroaches og injisere med vann før foretaket injeksjoner med levende bakterier eller narkotika.
5. Trykk knappen dispense fast å injisere volumet. Forsiktig ta nålen i samme vinkel som brukes for oppføringen.
6. Plass den injiserte fresende kakerlakk i en egen beholder å skille den fra de fresende cockroaches som ennå ikke vært injiseres. Tørk av noen hemolymph som kan ha Oste ut fra injeksjonsstedet.
7. Fortsette sprøytebruk andre fresende cockroaches i en gruppe med samme sprøyte og sprøytespiss. Stopp sprøytebruk før sprøytestempelet når bunnen av tønnen å hindre ufullstendig dosering i siste injeksjon.
8. For flere injeksjoner i enkelt fresende affinitet som dem med bakterier og narkotika, injisere på forskjellige sider av en tergum på dorsal side av de fresende cockroaches. Alternativt, utføre flere injeksjoner ved å injisere på ulike terga (3^rd til 5^th).
9. Kontroller at lokkene av beholderne er forsvarlig festet. Forsterke lokkene med tape, om nødvendig.
10. Inkuber fresende cockroaches i en fuktet 37 ° C inkubator.

8. opptak fresende kakerlakk sykelighet og dødelighet

1. Utføre alle fresende kakerlakk eksamen i en klasse II eller klasse III biologiske sikkerhetskabinett kabinett med institusjonelle anbefalt personlig verneutstyr. Rengjør i sikkerhet regjering med 10% blekemiddel etterfulgt av 70% etanol. Tillate arbeidsområdet til luft tørr.
2. Score fresende cockroaches én eller to ganger daglig over en periode på 1 til 2 uker med sykelighet scoring tabell (tabell 1).
3. Fjern død fresende cockroaches fra beholderen og registrere antall overlevende.
4. Overføre gjenstående live fresende cockroaches til en ren beholder hvis fuktighet akkumulert nederst i beholderen. Alternativt bruke engangs papirhåndklær for å tørke av fuktighet.
5. Erstatte råtten mat daglig og retur fresende cockroaches å fuktet 37 ° C inkubator.
6. På slutten av studien, plassere resterende overlevende i en biohazard pose og fryse på-80 ° C til euthanize.
7. Statistisk analysere data¹⁴ for å fastslå LD₅₀ og Kaplan-Meier og logg-Rank analyse for å overleve. Som med alle insekt eksperimentering, oppstå noen dødsfall i kontrollgruppen. Disse dødsfallene tilskrives til den naturlige dødeligheten insekter ¹⁵. For en mer detaljert diskusjon om hvordan konto for dødsfall i kontrollgruppen, se referanse¹⁵.

Representative Results

Denne delen illustrerer resultatene som ble oppnådd når Madagaskar fresende cockroaches var infisert av B. mallei, B. pseudomallei, eller B. thailandensis; resultatene viser at dette insektet er medgjørlig dyr modell for ulike arter av stokk i å studere virulens drug giftighet og narkotika effekt mot bakteriell infeksjon. Flere fresende cockroaches overlevde i grupper som ble infisert med dempes mutanter (Δhcp1) enn i grupper som ble infisert med wildtype B. pseudomallei K96243, foreldrekontroll B. mallei SR1 og B. thailandensis () DW503 Figur 1). Derimot drept infeksjon med virulente mutanter (Δhcp2 eller Δhcp3) de fresende cockroaches slik wildtype B. pseudomallei (figur 1). Infeksjon med avirulent stokk pattedyrarter, B. thailandensis E264 og dens aminoglycoside følsom derivat DW503, viser at den fresende kakerlakk modellen er spesielt egnet for Klargjørende mutasjoner i B. thailandensis som fører til demping (figur 2). Dermed er det en mer passende dyr modell for B. thailandensis studier enn gnager modeller. Økende konsentrasjoner eller flere injeksjoner av CLQ drepe ikke de fresende cockroaches; Dette illustrerer at drug giftighet kan også testes i fresende kakerlakk modellen (Figur 3). Videre er effekten av CLQ mot B. thailandensis infeksjon vist i Figur 4. Viktige aspekter av fresende kakerlakk og smitte er vist i figur 5. Tabell 1 kan brukes å score sykelighet av fresende cockroaches under eksperimenter.

Figur 1: Fresende kakerlakk overlevelse etter injeksjon med virulente og dempes Stokk . Åtte fresende cockroaches per gruppe ble injisert med 25 µL av bakteriell suspensjon. Fresende cockroaches ble sjekket for å overleve en gang om dagen i 5 dager. (A) Hissing cockroaches ble injisert med foreldrekontroll B. mallei SR1 (åpen firkant) eller Δhcp1 mutant (lukket firkantet) på 100 CFUs. (B) Hissing cockroaches ble injisert med wild type B. pseudomallei K96243 (åpen firkant), Δhcp1 (stengt firkantet), Δhcp2 (åpne trekant), eller Δhcp3 (åpne sirkelen) mutant på 10 CFUs. (C) Hissing cockroaches ble injisert med foreldrekontroll B. thailandensis DW503 (åpen firkant) eller Δhcp1 mutant (lukket firkantet) på 100 CFUs. Figur opprinnelig publisert i referanse ¹¹. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 : Fresende kakerlakk overlevelse etter injeksjon av økende konsentrasjoner av B. thailandensis for LD₅₀ besluttsomhet. Åtte fresende cockroaches per gruppe ble injisert med wildtype B. thailandensis E264 (A) eller aminoglycoside følsom avledede DW503 (B) og overlevelse ble scoret i 7 dager. LD₅₀ er 3 CFUs for E264 og 6 CFUs for DW503. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 : Fresende kakerlakk overlevelse etter injeksjon med chloroquine. Fem fresende cockroaches per gruppe ble injisert en gang (A) eller to ganger på to påfølgende dager (B) med 250 (diamant), 500 (torget), eller 1000 µg (trekant) CLQ eller PBS (sirkel) og overlevelse ble scoret i 7 dager. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Fresende kakerlakk overlevelse etter infeksjon med B. thailandensis og behandling med chloroquine. 10 til 12 fresende cockroaches per gruppe var infisert med B. thailandensis DW503 og ikke behandlet (torget), infisert med B. thailandensis DW503 og behandlet med CLQ ( trekant), behandlet med CLQ alene (diamant), eller var infisert og ubehandlet (sirkel). Overlevelse ble spilt inn i 7 dager. Den overlevelse kurven, sammensatt av 4 separate forsøk, er uttrykt i prosent tilsvarer det totale antallet overlevende delt på totalt antall fresende cockroaches for hver behandling på dager angitt. CFU inoculum gitt varierte fra 10 til 20 LD₅₀. Figur opprinnelig publisert i referanse ¹⁰. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: Bilder relatert til fresende kakerlakk modellen. (A) A kvinnelig fresende kakerlakk mangler utstikkende deler på hodet. (B) en mannlig fresende kakerlakk kan identifiseres ved tilstedeværelsen av horn. (C) en fresende kakerlakk må molt av sin exoskeleton å vokse. Nye insekt er hvit i fargen, men mørkere gradvis som den nye exoskeleton stivner. (D) fresende cockroaches kan lagres på en fest cap plastboks med ventilasjonshull under et eksperiment. (E) Under BSL3 forhold, fresende cockroaches ligger i skruen cap plastbeholdere. (F) A store musen bur brukes til å huse en fresende kakerlakk koloni. Den bør inneholde mat, vann og en papp egg kartong for skjuling. (G) Hissing cockroaches er injisert med en 1 mL sprøyte knyttet til en repeterende pipette. (H) A fresende kakerlakk er inokulert ved injeksjon gjennom kutan membran mellom abdominal terga. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1	Leve, normalt	-aktivt mobil -forstå og holde på fingrene når fresende kakerlakk er plukket opp
2	Live, sløv	-immobile men kravlesøk når prodded
3	Live, døende	-immobile Ben tucked i -ikke beveger seg når prodded -antenner og / eller Ben flytte når prodded
4	Døde	-immobile Ben tucked i -antenner ikke flytte når prodded -Ben ikke flytte når prodded

Tabell 1: fresende kakerlakk sykelighet poengsystem. The overall score for a group of hissing cockroaches is based on the hissing cockroach with the highest score in the group.

Discussion

Optimale eksperimentelle forhold begynner med en sunn fresende kakerlakk koloni, som krever en minimal men konsekvent tid forpliktelse. Selv om fresende cockroaches kan gå i relativt lang tid (~ uker) uten mat og vann, ukentlig eller bi-ukentlige bur vedlikehold må angis. Dette inkluderer mat og vann og at buret er tørr. Opprettholde tørr levekår er spesielt viktig i Akklimatisering og inkubasjon ved høyere temperaturer; Vi finner at mer fresende cockroaches dø og raskere ved høyere temperaturer når beholdere ikke var rengjort daglig.

The key to consistent dosing or inoculation of the hissing cockroach is to press the dispenser button on the repetitive pipette firmly. Vi anbefaler praktisere denne teknikken, lasting av sprøyten til den repeterende pipette og utføre tom injeksjoner. The most time-consuming step of the procedure for an operator new to the technique is holding or immobilizing the hissing cockroach during injection. Derfor anbefaler vi praktisere teknikken av holder og sprøytebruk flere fresende cockroaches før takle et mer ambisiøst prosjekt. Dette kan oppnås ved å opprettholde en liten gruppe fresende cockroaches som brukes for injeksjon praksis. Although we have found that injection can be performed quickly when holding the hissing cockroach on its side, other techniques for holding hissing cockroaches (e.g. immobilizing a hissing cockroach on a smooth curved surface; perching the hissing kakerlakk på langfingeren mens pekefingeren og tommelen nakkens det) kan bli foretrukket og bør bli utforsket av forskjellige operatører.

Bruk av den fresende kakerlakk modellen gir flere fordeler sammenlignet med andre insekt modeller (voks ormen Larven Galleria mellonella og frukt fly Drosophila melanogaster) som tidligere har vært brukt som dyr modeller med Stokk infeksjon ^16,17,18. For eksempel er vinduet eksperimentelle for en fresende kakerlakk varierer fra måneder til år noe som gir fleksibilitet til forskerne, mens det for en voksen orm Larven er bare fem dager ^19,20. For en voksen orm larve sammenfaller fem dagers perioden også med kokong encasement; fjerning av cocoons er en arbeidsintensiv prosess som kan føre til fysiske traumer til Larvene ²⁰. Enda viktigere, en B. thailandensis T6SS-1 mutant som er svekket i både Syreren hamster og fresende kakerlakk ¹¹, ble virulente i Galleria, antyder at Galleria ikke er en god modell for studiet av noen mutanter som T6SS i B. thailandensis (data ikke vist).

The use of the hissing cockroach presents several advantages over the fruit fly. The hissing cockroach is large and of a substantial body mass with a tough exoskeleton that allows it to be easily handled during injections. Derimot er liten og krever spesialisert utstyr for vaksinering. Also, whereas the hissing cockroach naturally lives in temperatures that are similar to or exceed human body temperature, the optimal temperature for the fruit fly is between 22 to 28 °C. Dette gjør frukt fly i begrenset bruk i forbindelse med studere prosesser som er avhengige av menneskelig kroppstemperatur (for eksempel multi kjerne gigantiske celle formasjon i stokk ¹⁰).

Noen ulemper til bruk av fresende cockroaches eksisterer. The genetics of the hissing cockroach are not as well studied as those of Drosophila or even Galleria. The hissing cockroach also has a substantial "ick" or gross factor. However, the hissing cockroach remains an attractive and viable surrogate host for Burkholderia by providing clear advantages to its use in research that are unique to the species. Som vi har vist at Madagaskar fresende kakerlakk er en tett surrogat vert for stokk, det sannsynligvis kan også tjene som en surrogat vert for andre bakterielle patogener og vi bruker for tiden det i slike studier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Madagascar hissing cockroach	Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC	143668
Kibbles n Bits, any flavor	Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA	UPC #079100519378
Snap on disposable plastic containers or equivalent	Rubbermaid, Huntersville, NC	UPC #FG7F71RETCHIL
Screw on disposable plastic containers or equivalent	Rubbermaid, Huntersville, NC	UPC #FG7J0000TCHIL
Tridak STEPPER series repetitive pipette	Dymax Corporation www.dymax.com	T15469
Syringe (1 mL)	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ	309659
Needle (26 or 27G x 1/2)	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ	305109, 305111
Chloroquine diphosphate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	C6628
Phosphate buffered saline	Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD	10010023
Difco Luria- Bertani (Lennox)	Becton Dickinson, Sparks, MD	240230
Agar	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A1296
Glycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G6279