Summary
Урана известно влияет на метаболизм костной ткани. Здесь мы представляем протокол, направленный на изучение влияние природного урана воздействия на жизнеспособность, дифференциация и функция остеокласты, клетки отвечает за резорбции кости.
Abstract
Было показано, что уран вмешиваться кости физиологии и хорошо известно, что этот металл накапливается в костях. Однако мало что известно о влиянии природного урана на поведение клеток кости. В частности влияние урана на остеокласты, клетки, ответственные за резорбцию костной матрицы, не документированы. Для расследования этого вопроса, мы создали новый протокол с помощью уранила ацетат как источник природного урана и мышиных RAW 264.7 клеточная линия как модель остеокластов прекурсоров. Здесь мы подробно все анализы, необходимые для тестирования урана цитотоксичность на остеокластов прекурсоров и оценивать его воздействие на osteoclastogenesis и на resorbing функцию зрелых остеокластов. Условия, которые мы разработали, в частности для подготовки уранила содержащих культуры средств массовой информации и для посева RAW 264.7 клетки позволяют получить надежный и высоко репродуктивного результатов. Кроме того мы оптимизировали использования средств программного обеспечения для облегчения анализа различных параметров, таких как размер остеокласты или процент рассосалась матрицы.
Introduction
Уран является естественным радиоактивного элемента, присутствующего в почвы, воздуха и воды; Таким образом животные и люди подвергаются воздействию природного урана в их рационе. В дополнение к естественным источникам уран исходит от антропогенной деятельности, который увеличивает его изобилия в окружающей среде. Уран представляет химической и радиационной опасности. Однако, поскольку природный уран (который является изотопный смесь содержащая 99,27% 238U, 0,72% 235U и 0,006% 234U) низкой удельной активностью (25.103 Bq.g-1), ее воздействия на здоровье объясняются его Химическая токсичность.
Независимо от его запись маршрута (ингаляции, при приеме внутрь или трансдермальном воздействии), большинство урана ввода тела выводится с калом и только небольшая часть достигает кровообращения. Около 67% урана в крови в свою очередь фильтруется почками и покидает тело в моче в течение 24 ч1. Остальные главным образом на хранение в почки и кости, два главных целевых органов урана токсичности2,,34. Потому что скелет был определен как основного сайта урана долгосрочного хранения2,3,4,5,6, было проведено несколько исследований для изучения Влияние урана на кости физиологии7.
Кости является минерализованной ткани, которая непрерывно перестроенный на протяжении всей его жизни. Костного ремоделирования представляет собой сложный процесс, который зависит от типов специализированных клеток и состоит главным образом из двух фаз: рассасывания существующей старой матрицы, остеокласты следуют путем de novo кости строительство остеобластов. Остеокласты являются большие мультипотоковый клетки, обусловленные слияния клеток-предшественников гемопоэтических происхождения которые мигрируют для рассасывания сайты, где они придают кости8. Их привязанность возникает одновременно с обширной реорганизацией их цитоскелета9. Эта реорганизация необходима для создания изолированных отсека между ячейкой и поверхности кости, в которой остеокластов выделяет протонов, что приводит к растворению гидроксиапатита и протеаз, участвующих в деградации органической матрицы. Результате продукты деградации endocytosed, перевозимых через ячейку в области мембранных противоположной поверхности костей и выделяется, этот процесс называется Трансцитоз10,11.
Результаты в vivo и in vitro исследования показывают, что уран препятствует формирования костей и изменяет количество и активность остеобластов7,12. Напротив плохо изучены последствия урана на костную резорбцию и остеокласты. Несколько в vivo исследований сообщали укрепление костной резорбции после отправления уранилнитрата мышей или крыс13,14. Кроме того эпидемиологическое расследование предложил, что увеличение потребления урана через питьевой воды, как правило, быть связано с увеличением уровень в сыворотке крови маркера резорбцию кости в15мужчин. Взятые вместе, эти выводы привели к выводу, что уран, который накапливается в костях, могли бы содействовать резорбции кости. Однако клеточных механизмов, участвующих в этом потенциальное влияние урана остается открытым вопросом. По этой причине мы решили изучить влияние урана на поведение resorbing костных клеток.
Здесь мы описываем протокол, мы создали характеризуют и количественной оценки последствий природного урана на предварительно остеокласты жизнеспособности и дифференциация остеокластов и резорбтивного действия. Эксперименты, описанные здесь было сделано с линией клеток RAW 264.7 мышиных преобразованные макрофагов, которые легко могут дифференцироваться в остеокласты когда культивированный присутствии цитокина RANKL для 4 или 5 дней, и классическом стиле, который используется для изучения остеокластов дифференциации и функции16. Разработанные процедуры являются надежными, дают высокую воспроизводимость результатов и являются полностью применимы к первичной остеокластов. По всем этим причинам мы считаем, что эта методология является полезным для получения лучшего понимания молекулярных механизмов, участвующих в токсичности урана в кости. Кроме того мы считаем, что этот подход может быть адаптирована как инструмент скрининга для выявления новых урана, хелатирующие агенты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление раствора ацетата уранила
- Для приготовления 2 мл раствора ацетата 100 мм уранилнитрата, добавьте 85 мг ацетата уранила (UO2(3OCOCH)2, 2 H2O; M = 424 г‧моль-1) в твердом состоянии в 5 мл пластиковую трубку.
- Добавить 2 мл дистиллированной воды в пластиковую трубку и установите его с пластиковой пробкой.
- Встряхните трубки до полного распада твердого тела. Положите раствор в холодильнике в течение 24 ч.
Предупреждение: Манипуляции уранила [U(VI)] представляет некоторые химической и радиационной опасности. Все образцы следует подготовить и характеризующиеся специального оборудования в определенных лабораториях. Все U VI-содержащие жидкости должны быть собраны в специально назначенные мусорных контейнеров и утилизировать как токсичных отходов. Сухих отходов (пипец, трубки и т.д.) можно мыть с 0,1 N HNO3 решения, которое будет солюбилизировать последнего и удалить U(VI). - Проверьте рН раствора с помощью микроэлектродные и рН метр.
Примечание: Микроэлектродные должны быть ранее калибровка с использованием коммерческих Буферные растворы (рН = 4 и pH = 7).
2. сырье 264.7 клеточной культуры
-
Техническое обслуживание клеток.
- Культивировать RAW 264.7 клетки (ATCC, Тиб-71) в 75 см2 фляги в следующем среднего роста: Дульбекко модифицированная орла среднего (DMEM) с 5% плода Bovine сыворотки и антибиотики: 100 МЕ/мл пенициллин, стрептомицин 100 мкг/мл. Сохранить клетки в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO2.
- Изменение среднего каждые 2-3 дней. Когда клетки 85-90% притока, механически удалить их из культуры колбу с помощью скребка ячейки (как рекомендованный ЦУВД) и разбить их в соотношении 1:6.
Примечание: только клетки между проходы 3-10 используются для дифференциации экспериментов.
-
Подготовка клетки для экспериментов
- Выбить клетки от субстрата настой, как описано выше и перенести их в стерильных 50 мл трубки. Смешайте клетки закупорить вверх и вниз, чтобы порвать пряди. Считать их с Горяева. Ожидаете 35-40 миллионов клеток за флакон 75 см2 .
- Рассчитайте объем подвеска клеток, необходимых для каждого эксперимента следующим образом:
Количество экспериментальных условиях x 3 (triplicates) x 1 мл/хорошо + 3-4 мл (дозирования потери).
Примечание: Заполнение плотности для всех анализов, указанных в настоящем Протоколе — это 5000 клеток/см2. Таким образом для 24-ну плиты, значит 10 000 ячеек на скважину в 1 мл среды, и плотность клеток подвеска является таким образом 10 000 клеток/мл. - Подготовить необходимый объем 10000 клеток/мл суспензии клеток и семян клетки в 24-ну пластины. Для анализа цитотоксичности используйте нормальный рост среднего. Для дифференциации и рассасывания анализов, использование альфа изменение минимум основных средних (αMEM) с 2 мм L-глютамином, 5% FBS и 50 нг/мл GST-RANKL17.
Примечание: GST-RANKL белок собственного производства может быть заменен на любой коммерчески доступных RANKL цитокина. При работе с новой партии RANKL, это может быть полезно для проверки его эффективности в привлечении osteoclastogenesis, выполнив в эксперименте ответ дозы с RANKL концентрации от 20 до 150 нг/мл.
3. разведение ацетата раствор уранилнитрата 100 мм в среде культуры
Примечание: Уранила ионов [U(VI)] в питательной среды образуют несколько комплексов с других компонентов среды, которые могут изменять свой сотовой токсичности18,19,,2021. По этой причине уранила содержащих СМИ должны быть готовы экспромтом без пропуска или укорочения уравновешивания шаги.
- Выбрал уранила воздействия концентраций и расчета объемов культуры средств массовой информации, необходимых для эксперимента (принимая во внимание, что каждое условие выполняется в трех экземплярах).
- Начиная с стерильных клеточной культуры испытания 7.5% водный раствор бикарбоната натрия ([HCO3–] = 893 мм), подготовить 100 мм HCO3– раствор в воде и охладить его на льду.
- Добавьте по капле 1 объем Стоковый раствор уранилнитрата ацетата 100 мм 9 томов ледяной 100 мм HCO3– раствора, слегка покачивая смешивания трубки. Эта операция будет разбавить раствор уранилнитрата ацетат ([UO22 +] = 100 мм, pH 4) до 10 мм и довести рН около 7.
- Добавить 1 объем стерильной воды 9 томов решения3– HCO ледяной 100 мм до 90 мм HCO3– (равный HCO3– концентрации в растворе уранила 10 мм), который будет служить для подготовки элемента управления Средний.
- Разрешить готовые решения стоять за 3 ч при комнатной температуре (RT) для уравновешивания.
- В то же время подготовить основные воздействия среды: αMEM с 2 мм L-глютамина и 5% FBS.
Примечание: Для дифференциации и рассасывания анализов, добавьте 50 нг/мл GST-RANKL средний основной экспозиции. - После 3 h разбавляют соответствующее количество раствор уранилнитрата 10 мм по капле в средстве воздействия для достижения желаемого уранила рабочей концентрации. Подготовьте одновременно средство управления, добавляя количество бикарбоната, используемых в наиболее концентрированным уранила лечение условие, воздействия среды.
- Разрешить подготовленные СМИ стоять на 3 ч для уравновешивания в рт.
- Удалите средства роста из скважин и заменить его с элементом управления и уранила содержащих средств массовой информации.
4. Анализ сырья жизнеспособности 264.7 прекурсоров в присутствии U(VI) (МТТ цитотоксических анализов)
ВНИМАНИЕ: Оба МТТ и ДМСО может вызвать кожи и раздражение глаз. Надевайте перчатки и средства защиты глаз при их обработке. Сбор отходов в специально назначенные мусорных контейнеров.
- Растворите соответствующее количество 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium бромид (МТТ) порошка в PBS для получения 10 x Стоковый раствор на 5 мг/мл. Стерилизовать его путем фильтрации с 0,22 мкм фильтром и хранить аликвоты при-20 ° C.
- Плита клетки на 24-ну пластины (3 скважины на экспериментальной состояние каждой пластины). Не забудьте зарезервировать 3 пустых скважины на пластину для заготовок спектрофотометра.
- Инкубируйте клетки при 37 ° C для 22-24 ч до облучения урана чтобы прикрепить клетки.
- Подготовьте уранила содержащих средств массовой информации, как описано в разделе 3.
- Заменить средство роста клеток посеян пластины уранила содержащих средств массовой информации. Проинкубируйте 24 ч.
- Рассчитайте необходимый объем раствора 1 x MTT следующим образом:
(Количество экспериментальных условиях + пробел) x 3 (triplicates) x 0,4 мл/хорошо + 10% объем дозирования потерь. - Подготовьте необходимый объем 1 x MTT раствора путем разбавления 10 x акции MTT решение в орла минимум основных средних (EMEM) без фенола красного.
Примечание: для успешного колориметрические assay, МТТ должны быть защищены от света. Рекомендуется разбавлять МТТ в ЕМЕМ, а не в среде DMEM для того, чтобы ограничить фонового сигнала. - Удаление уранила содержащих СМИ из скважин, мыть их с PBS и 400 мкл раствора МТТ для каждой скважины (включая 3 пустых скважины для заготовок). Инкубируйте 2,5 ч при 37 ° C в темноте. Проверьте под микроскопом, что кристаллы темно фиолетовый Формазаны создали внутри жизнеспособных клеток.
- Отменить решение МТТ и 220 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) на хорошо. Оберните пластины в алюминиевой фольгой, чтобы защитить их от света и аккуратно агитировать за 10 мин распустить Формазаны кристаллов.
- Использование Считыватель микропланшетов спектрометр для определения оптической плотности (ОД) в 570 Нм (конкретно Формазаны) и 690 Нм (фон). Для каждой скважины вычтите 690 нм ОД от 570 Нм ОД скорректировать возможные неспецифичные ОД значение колебания из-за царапин или помутнение воды22.
- Вычислить ОД пустым исправлены для каждой скважины путем вычитания средней ОД заготовки из ОД, полученные на предыдущем шаге. Определите среднее ОД значения для каждого экспериментальные условия.
- Установить средний ОД состояния элемента управления ([UO22 +] = 0 мм) до 100% жизнеспособность и вычислить соответствующий процент жизнеспособность клеток для других протестированных уранила концентрации. Участок кривой доза ответ. Оцените цитотоксичность индекс 50 (50CI), определяется как уранила концентрации приводит к гибели клеток 50% после 24 часов.
5. анализ остеокластов дифференциации в присутствии U(VI)
-
Дифференциация RAW 264.7 клетки присутствии ЛОВУШКУ и уранила (тартрат-устойчивостью кислоты фосфатазы) пятнать.
- Пластина RAW 264.7 клетки на пластине 24-а, 3 скважины на экспериментальной условие. Инкубировать при 37 ° C для примерно 6 ч, время для подготовки и сбалансировать уранила содержащих воздействия СМИ.
- Подготовьте дифференциация СМИ с желаемой уранила концентрации, как описано в разделе 3 (не забудьте добавить GST-RANKL в СМИ).
- Аккуратно заменить основные среды в скважинах с уранила содержащих среднего. Этот день считается днем 0 osteoclastic дифференцировки.
- Измените носитель в день 2 или 3 osteoclastic дифференцировки, повторив шаги 5.1.2 и 5.1.3. Многоядерные остеокласты должен появиться между 3 и 4-й день.
- Выполняют окрашивание ловушки с коммерчески доступных комплект кислой фосфатазы лейкоцитов следуя инструкциям производителя.
Примечание: тартрата-устойчивостью кислой фосфатазы (TRAP), также называется кислой фосфатазы 5, тартрат устойчивостью (ACP5) высоко выражается в зрелых остеокластов и широко используется в качестве маркера для дифференциации остеокластов. Таким образом окрашивание ЛОВУШКУ выполняется визуализировать остеокластов. В зависимости от экспериментальных условий и скорость osteoclastogenesis это можно сделать на день 4 или 5 день процесс дифференциации. - Держите ловушка окрашенных скважин в PBS на 4 ° C для дальнейшего анализа (они могут быть сохранены в этих условиях до 3 или 4 недели).
-
Анализ размера/морфологии остеокластов.
- Получить изображение всей поверхности каждой скважины. Разрешение изображения должно быть достаточно, чтобы различать клеточных ядер. Ловушка положительных клеток с 3 или более ядрами, считают остеокластов.
- Открыть изображение одной скважины в программном обеспечении ImageJ: «Файл» → «Открыть».
- Проверьте единицы масштаба в левом верхнем углу изображения. Для количественной оценки относительной может использоваться любая единица. Если требуется абсолютное значение размера остеокластов, преобразовать единицы масштаба в мкм: «Образ» → «свойства». Установите флажок «Глобальный» во всплывающем окне для того чтобы иметь новые единицы масштаба, применяется ко всем изображениям, открыт позже.
Примечание: Если микроскоп был использован для захвата изображений, размер пикселя в мкм указана для каждой цели в программе обработки изображений. - Укажите параметры измерения для анализа: «Анализировать» → «набор измерений». В окне задать измерения флажки «Область» и «Дисплей Label» и снимите все другие коробки.
- Откройте диспетчер ROI (регион интерес): «Анализировать» → «инструменты» → «ROI менеджер».
- В главном окне выберите инструмент Прямоугольное выделение. Используйте его где угодно в изображении наметить сектора около 1000 x 1000 мкм. Этот выбор теперь определяет первый регион, в котором остеокластов размер будет анализироваться.
- В окне диспетчера ROI нажмите на кнопку «Добавить» для добавления этого региона интерес к диспетчеру ROI и сохранить его, нажав на «Больше» → «Сохранить». Сохраненный ROI теперь могут быть перезагружены к диспетчеру ROI в любое время, нажав на «Больше» → «Открыть».
- Повторите шаги с 5.2.5 - 5.2.6 определение 4 дополнительных областей для анализа размер остеокластов (рисунок 2A и 2D).
Примечание: Определенные регионы будет использоваться для анализа остеокластов размеров во всех изображениях. - Создайте копию одного из 5 регионов для анализа: выбрал этот ROI в основном ROI менеджер (на основное изображение появится соответствующее выделение) → щелкните правой кнопкой мыши внутри выделения → «Дубликат». Используйте этот дубликат для дальнейшего анализа.
- В окне Менеджер ROI, установите флажки «Показать Al» l и «Ярлыки».
- В главном окне выберите инструмент Многоугольник выбора наметить один из остеокласты в выборе вручную. Добавьте этот план к диспетчеру ROI, нажав на «Добавить» в окне менеджера ROI. Аналогичным образом действовать для всех остеокласты, которые полностью лежат внутри выбранной области (Рисунок 2B и 2E).
- В окне диспетчера ROI выберите все контуры и измерить их поверхности, нажав на «Мера». Передавать таблицы измерений, которые появились в новом окне (окне результаты, Рисунок 2 c и 2F).
Примечание: В этой точке, регионе анализа с все контуры остеокластов может сохраняться как независимый образ: «Файл» → «Сохранить как» формат по выбору. - Повторите шаги 5.2.8 - 5.2.12 для оставшихся областей анализа текущего изображения. Затем повторите всю процедуру для всех других изображений.
-
Анализ номера остеокластов с ImageJ программного обеспечения.
Примечание: Как остеокластов распределение в скважине редко однородной, выполняют подсчет в целом хорошо, а не на несколько отдельных зон. Учитывая, что остеокласты гетерогенных формы и размера, не автоматизированный подсчет клеток метод практически.- Откройте изображение всего также в ImageJ программного обеспечения (для этого анализа, использования изображений из предыдущего подраздела).
- Откройте окно счетчик клеток: «Плагины» → «анализировать» → «Счетчик соматических клеток». Нажмите на флажок «Типа 1» и «Инициализировать» (или любой тип номера вы предпочитаете). Убедитесь, что установлен флажок «Показать номера» и «Удалить режим» флажок не установлен.
- На изображении, нажмите на один из остеокластов: цветная точка и ряд будет отображаться при нажатии. Действовать аналогичным образом, для всех остеокластов. Регулярно сохранять маркеры, нажав на «Сохранить маркеры» в окне Счетчик клеток
Примечание: Если последний пункт должен быть удален из граф, нажмите на «Удалить» в окне Счетчик клеток. Если существует более чем одна точка для удаления, установите флажок «Удалить режим» и указать все недопустимые точки, нажав на них. Затем снимите флажок «Удалить режим» продолжать отсчет. - Отобразить результат подсчета, нажав на результаты в окне Счетчик клеток. Передача окончательного подсчета результатов в электронную таблицу.
6. анализ функционирования остеокластов присутствии U(VI)
-
Пит рассасывания assay.
- Плиты СЫРЫЕ 264.7 клетки на 24-ну Остео пробирного пластиной, которая обеспечивает синтетических неорганических osteomimetic поверхности, которая может быть рассосалась, остеокласты.
Примечание: для того чтобы приложить к поверхности biomimetic клетки, это часто лучше пластины их день перед добавлением дифференциации среднего. - Дифференцировать RAW 246.7 клетки в остеокласты, как описано в разделе 5 (шаги 5.1.2 - 5.1.4)
- День 5 osteoclastogenesis удалите остеокласты из подражательный поверхности кости, заменив уранила содержащих среднего раствор 10% отбеливателя. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре. Промыть скважин дважды с дейонизированной водой и пусть воздушно-сухой.
- Добавьте 1% раствора соли натрия ализарин красный S скважин на выведение солей кальция в районах рассосалась. Удаление ализарин решения после 10-15 s инкубации и осторожно Промыть лунки 3 - 4 раза с водой. Пусть воздушно-сухой лунки.
Примечание: Окрашивание описанная выше процедура предназначена для расширения контраст между resorbed и не резорбируется районами в целях последовательного анализа. Эта процедура должна быть сделано тщательно потому что если скважины не высохнет до окрашивания, части поверхности оставшиеся кости подражательный может случайно удалены. Кроме того если ализарин решение оставить слишком долго в скважинах, появится стойких неспецифичный пятнать. Следует отметить, что испытания, описанные в этом разделе относится влияние урана на osteoclastic дифференциация и функции. Изучить влияние урана на рассасывания независимо от формирования остеокластов, RAW 264.7 клетки можно лечить с помощью уранила содержащих средние за 24 часа, только после зрелого остеокласты формируются (на день 4 или 5 процесс дифференциации) 23.
- Плиты СЫРЫЕ 264.7 клетки на 24-ну Остео пробирного пластиной, которая обеспечивает синтетических неорганических osteomimetic поверхности, которая может быть рассосалась, остеокласты.
-
Анализ полного рассасывания яму.
- Получить изображение всей поверхности каждой скважины Остео пробирного пластины.
Примечание: Методы приобретения изображений может варьироваться, но должно быть несогласованной реплицировать экспериментов. Они могут включать сфотографироваться с макро цель фиксированной камеры, с высоким разрешением сканирования или мозаики изображения, сделанные с помощью автоматизированных высокой пропускной способности микроскопа. - Процесс анализа, повторив шаги 5.2.2 чтобы 5.2.4 из предыдущего раздела.
- Преобразование изображения RGB в оттенки серого 8-битный формат: «Образ» → «Типа» → «8 bit».
- В главном окне выберите инструмент «Овальный выделение». Используйте его, чтобы нарисовать круг изложением всей поверхности хорошо проанализированы для рассасывания.
- Сохраните этот новый ROI как шаг 5.2.6.
- Чтобы облегчить выбор порога, снимите все функции вне определенных ROI: «Редактировать» → «Очистить вне».
Примечание: На данный момент, это часто лучше, чтобы сделать несколько копий изображения: отмените выбор ROI, нажав за пределами выбранной зоны → щелкните правой кнопкой мыши на изображение → «Дубликат». Это действие поможет избежать повторения изображения лечения, описанных выше, если порог, выбранных на следующем шаге является неудовлетворительным. - Выберите «Образ» → «Настройки» → «порог». В окне порог используйте ползунок, чтобы выбрать подходящее пороговое значение. Все resorbed районы должны быть ниже порогового значения (белый) и не рассосалась, выше (красный). Для подтверждения выбора порога, нажмите на «Применить» в окне порог.
- Сохранить окончательный двоичного образа: «Файл» → «Сохранить как» → формат по вашему выбору.
- Определение измерений должны быть приняты в регионе интерес: «Анализировать» → «набор измерений». В окне задать измерения установите флажок «Уголок», «Площадь фракции» и «Предел порога» коробок и снимите все остальные.
- Для того чтобы получить долю «рассосалась» области непосредственно в окне результатов, Инвертируйте двоичного образа («Правка» → «Инвертировать»). Убедитесь, что установлен основной ROI на окончательный двоичное изображение (в противном случае рассосалась области фракция будет рассчитываться на основании поверхности окна всего изображения). Мера рассосалась области фракция, либо нажав на «Измерения» в окне менеджера ROI или на «Анализировать» → «Измерения». Сохраните результат.
- Получить изображение всей поверхности каждой скважины Остео пробирного пластины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Тартрата стойкие кислой фосфатазы пятнать была использована для визуализации остеокласты как большие фиолетовый клеток, имеющих 3 или больше ядер. Представитель изображения остеокластов, полученные из RAW 264.7 клетки культивировали в присутствии RANKL и уранила ионы показаны на рисунке 1. Изменения в количество и размер остеокласты в ответ на уран легко видны в композитных изображений всей скважин и в расширенном фотографии.
Размер остеокластов был проанализирован с помощью программного обеспечения ImageJ (рис. 2). Для этой цели, использовались изображения всего ну ловушки, окрашенных остеокластов и тех же регионов обращались в каждую лунку каждого состояния культуры (рисунок 2A и 2D). Все остеокластов присутствуют в каждом регионе были изложены (Рисунок 2B и 2E) которой допускается определение их площади (выраженный в мкм2) (рис. 2 c и 2F). Показано на рисунке 2 примерах сильное влияние урана на размер остеокластов.
Исследовать влияние урана на активность остеокластов резорбции, сырье 264.7 клетки были покрытием и дифференцированных по osteomimetic поверхности пластины. В конце анализа были удалены остеокластов. Затем, подражательный поверхность кости в каждом хорошо лечили ализарин красный S натриевой соли для того, чтобы пятно не резорбируется области и изображения каждого состава также были приобретены (Рисунок 3А и 3D). Результирующие фотографии были обработаны с J образа программного обеспечения. Они были преобразованы в оттенки серого изображения 8 бит (рисунок 3B и 3E), подвергается Бинаризация (рис. 3 c и 3F) и resorbed области (белый регионов) автоматически рассчитывается.
Рисунок 1: Визуализация влияния U(VI) на формирование остеокластов. RAW 264.7 клетки были продифференцированы присутствии показанную концентрацию уранила. На 4 день окрашивание тартрата стойкие кислой фосфатазы (ловушка) была выполнена. Представитель целом ну микроскопии (верхняя панели) показывают ловушка окрашенных остеокласты, полученные в этих условиях. Приведены примеры многоядерные остеокластов в штучной упаковке областях с большим увеличением (стрелки в нижней панели). Эти фотографии иллюстрируют дозозависимый эффект U(VI) на формирование остеокластов. Черные головы стрелки показывают примеры остеокластов ядер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: анализ влияния U(VI) на размер остеокластов. (A и D): показаны изображения всего ну остеокластов площадью в штучной упаковке, соответствующих регионов, в которых остеокластов размер был проанализирован. Коробки, красный уголок (A и D) соответствуют показанным в (B) и (E), соответственно. (B и E): ручной рисунок остеокластов края в условиях двух уранила концентрация показаны синим цветом. (C и F): привести windows от программного обеспечения ImageJ показаны измерения от анализа (B и E) соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: анализ влияния U(VI) на функции остеокластов. Образы ализарин окрашенную поверхность osteomimetic после рассасывания osteoclastic, которые имели место в отсутствие (A) или при наличии 25 мкм уранила (D). Фотографии (A и D) были сначала преобразуется в оттенки серого изображения 8 бит, как показано на (B и E) и, впоследствии, в двоичных образах (C и F), применяя подходящий порог. Эти двоичные образы были использованы для расчета процент области резорбируется в каждом состоянии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Насколько нам известно, это первый раз, что описывается подробная процедура, направленных на изучение влияния природного урана на кости, resorbing клетки. Этот подход будет полезным для достижения лучшего понимания влияния урана на кости физиологии и может обеспечить интересный новый инструмент для скрининга хелаторов урана. Кроме того мы считаем, что протокол, описанные здесь может применяться для изучения воздействия других тяжелых металлов на osteoclatogenesis.
Известно, что уранила complexed с неорганических и органических компонентов в культуре средств массовой информации18,19,,2021. Эти complexations влияние видообразования урана и, таким образом, его цитотоксичности. По этой причине важным шагом в протоколе является подготовка урансодержащих культуры средств массовой информации. Ранее мы показали,23 , что присутствие плода бычьим сывороточным 5% в среде культуры клеток RAW 264.7 не оказало существенного влияния на цитотоксичность уранила при использовании в концентрациях от 0 до 400 мкм. Это важный момент, как присутствие сыворотки в среде требуется проанализировать влияние урана воздействия в течение всего процесса osteoclastic дифференцировки. Тем не менее мы хотели бы подчеркнуть, что необходимо внимательно следила за длинный двухэтапной процедуры, описанной для подготовки экспозиции СМИ (6 часов). Действительно инкубации шаг 3 часа после каждого разведения уранила солей позволяет стабилизации комплексов уранила потенциально сформирован в растворе до дальнейшего разбавления или ячейки экспозиции. Это абсолютно необходимо для получения надежных и воспроизводимых результатов.
Еще один важный параметр для воспроизводимости анализов различий и резорбции остеокластов это посева плотность сырых 264.7 клеток. Действительно было показано, что плотность мононуклеарных прекурсоров является важнейшим фактором, определяющим для формирования остеокластов, наиболее вероятно потому что близость к ячейке влияет сотовой синтез события24. Таким образом особое внимание должно уделяться клеток подсчета, подготовка сотовых подвеска и однородность заполнения в каждой скважине, с тем чтобы избежать неправильного толкования.
Инструмент порога полезны для автоматизации количественного определения полного рассасывания. Стоит отметить, что этот анализ требует должным образом освещенной изображений. Однако является общей проблемой, независимо от типа метода приобретения камеры и изображений является неравномерное освещение на краях изображения. В этом случае метод многоступенчатой Бинаризация может быть необходимым.
Таким образом мы создали надежный протокол, позволяющий изучение влияния урана на формирование остеокластов, жизнеспособности и функции. Эта процедура была разработана с использованием сырья 264.7 клеточная линия, но полностью применимы к первичной костного остеокластов прекурсоров, как мы показали23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Шанталь ОЦР для полезной технической помощи.
Это исследование финансировалось за счет субсидий из «меню энергетики комиссариата по атомной энергии et aux альтернативные источники энергии» (URANOs - программа поперечные де Toxicologie du РЭА и CPRR CEA-AREVA) и от НРУ (токсичности урана: многоуровневый подход biomineralization процесс в кости, АНР-16-CE34-0003). Эта работа была также поддержана Университет Ниццы София-Антиполис и CNRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| α-MEM | Lonza | BE12-169F | |
| EMEM without phenol red | Lonza | 12-668E | |
| Water for cell culture | Lonza | BE17-724F | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Life Sciences | SH30071.03 | |
| 7.5% sodium bicarbonate aqueous solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder | Sigma-Aldrich | M5655 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. | Alfa Aeros | 42746 | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 | |
| Multiwell 24 well plates | Falcon | 353504 | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 353133 | |
| Polypropylene Conical Tubes 50 ml | Falcon | 352070 | |
| Cell scrapers 30 cm | TPP | 90003 |
References
- Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. , Atlanta, GA. (2013).
- Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat. Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).
- Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual. Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).
- Kurttio, P., et al. Renal effects of uranium in drinking water. Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).
- Leggett, R. W. Basis for the ICRP's age-specific biokinetic model for uranium. Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).
- Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. Bone as target organ for metals: the case of f-elements. Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).
- Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development. Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).
- Ikeda, K., Takeshita, S. The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis. J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).
- Teiltelbaum, S. L. The osteoclast and its unique cytoskeleton. Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).
- Nesbitt, S. A., Horton, M. A. Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts. Science. 276 (5310), 266-269 (1997).
- Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis. Science. 276 (5310), 270-273 (1997).
- Pierrefite-Carle, V., et al. Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity. Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).
- Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling. Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).
- Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate. Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).
- Kurttio, P., et al. Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water. Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).
- Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells. Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).
- Beranger, G. E., et al. Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis. J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).
- Mirto, H., et al. Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells. Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).
- Carrière, M., et al. Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity. Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).
- Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation. Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).
- Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation. Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).
- Studzinski, G. P. Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. , Oxford University Press. Oxford. (1999).
- Gritsaenko, T., et al. Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts. Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).
- Motiur Rahman, M., et al. Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation. Bone. 81, 392-399 (2015).
