מתח osmotic משפיע אקסוציטוזה ואת כמות הנוירוטרנסמיטר שפורסמו במהלך תהליך זה. נדגים כיצד שילוב שיטות אלקטרוכימיות יחד עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של לחץ אוסמוטי חוץ-תאית על פעילות אקסוציטוזה, שלפוחית quantal בגודל כמות הנוירוטרנסמיטר משוחרר במהלך אקסוציטוזה.
הקלטה Amperometry של תאים נתון שוק אוסמוטי מראים כי תאים הפרשה להגיב על הלחץ הפיזי הזה על-ידי הפחתת הפעילות אקסוציטוזה ואת כמות הנוירוטרנסמיטר שוחרר מן שלפוחית באירועים אקסוציטוזה יחיד. הוצע כי הירידה נוירוטרנסמיטורים גורשו היא עקב שינויים במאפייני biophysical ממברנה כאשר תאים להתכווץ בתגובה ללחץ osmotic עם ההנחות זה שלפוחית הפרשה בציטופלסמה תא אינן מושפעות על ידי מתח osmotic חוץ-תאית. Amperometry הקלטה של אקסוציטוזה מפקחת מה הוא שוחרר מן התאים הרגע שלפוחית ולספות עם קרום פלזמה, אך אינו מספק מידע על תוכן שלפוחית לפני המיזוג שלפוחית מופעלת. לכן, על ידי שילוב של amperometry הקלטה עם שיטות אנליטיות משלימים אחרים המסוגלים אפיון השלפוחיות המוגלתיות הפרשה לפני אקסוציטוזה-תאים המופעלת מציע סקירה רחבה יותר לבחינת שלפוחית איך הפרשה ו בתהליך אקסוציטוזה מושפעים שוק אוסמוטי. כאן נתאר כיצד משלימים amperometry הקלטה עם cytometry אלקטרוכימי תאיים והדמיה מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) שידור ניתן להשתמש כדי לאפיין שינויים בגודל שלפוחית הפרשה ותוכן עצבי- תאים chromaffin ביחס אקסוציטוזה פעילות לפני ואחרי חשיפה osmotic מתח. על-ידי קישור כמותיים המידע שנצבר ניסויים באמצעות כל שלוש שיטות אנליטיות, מסקנות בעבר נעשו כי הפרשה שלפוחית להגיב ללחץ osmotic חוץ-תאית על ידי כיווץ גודל הקטנת גודל quantal שלפוחית כדי לשמור על ריכוז עצבי קבוע שלפוחית. ומכאן, זה נותן קצת הבהרה בנוגע למה שלפוחית, בתגובה osmotic מתח, להפחית את כמות נוירוטרנסמיטורים שפורסמו במהלך שחרור אקסוציטוזה. ההקלטות amperometric כאן מציינים שזה הוא תהליך הפיך, את שלפוחית לאחר הלם אוסמוטי והינם מחודשים עם נוירוטרנסמיטורים כאשר תאים שמוקם הם להחזירה לתוך סביבה מול.
Chromaffin תאים בבלוטות יותרת הכליה הם תאים נוירואנדוקריניים שחרור נוירוטרנסמיטר מולקולות לתוך זרם הדם. מצב זה מתרחש דרך הסלולר התהליך הכרוך עגינה של פיוז’ן של שלפוחית מלאה נוירוטרנסמיטר, וכתוצאה מכך שחרור תוכן שלפוחית למרחב חוץ-תאית בתהליך הנקרא אקסוציטוזה. נוירוטרנסמיטרים תאים chromaffin (אדרנלין, ונוראדרנלין) מועבר על ידי קרום חלבונים לתוך שלפוחית גדול ליבה צפופה (LDCVs) ומאוחסנים באופן פעיל-ריכוזים גבוהים (~0.5-1 מ’)1,2. הצטברות של נוירוטרנסמיטורים פנימה LDCVs מושגת על ידי בזיקה של מולקולות קטכולאמין למטריקס חלבון intravesicular ליבה צפופה המורכבת chromogranin חלבונים (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6ופתרון קוקטייל intravesicular המכיל רכיבי מפתח קטכולאמין העמסה ואחסון לתוך שלפוחית כגון ATP (125-300 מ מ)7, Ca2 + (50-100 מיקרומטר פתרון ו ~ 40 מ מ חייב מטריקס חלבון)8,9מ ג2 + (5 מ מ), ascorbate (10-30 מ מ)10ו- pH של ~5.511,12. LDCVs לשמור על תנאי iso-osmotic עם תא הציטופלסמה (310 mOsm/kg)13, למרות הריכוז ממס תיאורטי בתוך השלפוחיות המוגלתיות לסכם עד יותר מ 750 מ”מ. ההרכב של הרכיבים intravesicular חיוני לא רק עבור העמסה ואחסון של catecholamines, אלא גם לצורך צבירת של מומסים בגבול למטריקס חלבון הליבה צפופה. זה מפחית באופן משמעותי את osmolarity של השלפוחיות המוגלתיות פוחת באופן משמעותי והוא יכול להשפיע על קטכולאמין סכום זה הוא שוחרר במהלך אקסוציטוזה5,6.
מחקרים על ההשפעה של לחץ אוסמוטי חוץ-תאית על התהליך אקסוציטוזה הקלטה amperometric דיווחו על הזאת לחץ אוסמוטי גבוה חוץ-תאית מעכב פעילות אקסוציטוזה ומפחיתה את מספר הנוירוטרנסמיטרים המופרשים יחיד שלפוחית תאים4,14,15,16,17,18,19. ההסברים מתצפיות אלה העריכו על שיפור אפשרי של הצפיפות macromolecular את האירועים של התא הציטופלסמה פיוז’ן שלפוחית מעכבות, שינוי במאפייני biophysical ממברנה להשפיע על מספר נוירוטרנסמיטורים שפורסמו במהלך אקסוציטוזה. מחשבות אלו הניחו כי מתח נפשי גבוה osmotic חוץ-תאית אינה משפיעה על גודל quantal שלפוחית, אשר מגדירה את מספר מולקולות עצבי המאוחסן בתא שלפוחית בשלב קודם של אקסוציטוזה מופעלות14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. במדידות amperometric של שחרור אקסוציטוזה תאים בודדים, microelectrode דיסק סיבי פחמן מושם בקשר הדוק עם פני השטח של התא, יצירת ערכה ניסוי למעלה מחקה את תצורת סינפסה, איפה amperometric אלקטרודה משמש22,גלאי postsynaptic (איור 1)23. על ידי גירוי תא אקסוציטוזה, אחד יכול לגרום שלפוחית מלאה עצבי נתיך עם קרום פלזמה התא ולשחרר חלק או את התוכן שלפוחית מלאה לחלל חוץ-תאית. מולקולות אלה הנוירוטרנסמיטר משוחרר על פני השטח של האלקטרודה ניתן להבחין electrochemically אם נוירוטרנסמיטורים הם electroactive (למשל, catecholamines) על-ידי החלת פוטנציאלי חמצון-חיזור של +700 mV vs אלקטרודה הפניה של Ag/AgCl . כתוצאה מכך, סדרה של קוצים הנוכחי לסמן את הגילוי של אירועים בודדים אקסוציטוזה. הנוכחי לעומת עקיבה זמן הקלטת amperometric, האזור שמתחת לכל ספייק amperometric יחיד מייצג את המטען זוהה לכל אירוע אקסוציטוזה, ניתן להמיר את החפרפרת של נוירוטרנסמיטרים שוחרר, באמצעות המשוואה פאראדיי. לפיכך, ההקלטות amperometric לספק מידע כמותי על כמות נוירוטרנסמיטורים שגורשו אירועים אקסוציטוזה יחיד, הדו ח על התדר של אירועים אקסוציטוזה, אבל לא מציגות מידע כמותי על השלפוחיות המוגלתיות הפרשה תוכן לפני שחרור נוירוטרנסמיטר וה פיוז’ן שלפוחית החל.
לכן, כדי לקבל הבנה טובה יותר של שלפוחית איך הפרשה בתא הציטופלסמה להגיב חוץ-תאי הלחץ osmotic לפני התא מופעלת בתהליך אקסוציטוזה, שיטות אנליטיות משלימים אחרים יכול לשמש כדי להעשיר את המידע הזה. למשל, כדי לחקור אם הלחץ osmotic הפיצולים נפח שלפוחית, במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) הדמיה ניתוח יכול לשמש כדי למדוד את גודל שלפוחית של תאים לאחר קיבוע כימי. כדי לבחון אם osmotic לחץ משפיע על גודל quantal שלפוחית, amperometric פיתחה לאחרונה בטכניקה הקרויה תאיים cytometry אלקטרוכימי, יכול להיות מיושם על כימות של שלפוחית תוכן עצבי ב שלפוחית הפרשה ב שלהם מצב מקורי כאשר בעובדי בציטופלסמה של תאים חיים26. בשיטה תאיים cytometry אלקטרוכימי, אלקטרודה סיב פחמן גלילי nanotip בעדינות מוכנס לתוך הציטופלסמה של תאים חיים, על-ידי החלת +700 mV פוטנציאל אלקטרודה זו (לעומת Ag/AgCl להפנות אלקטרודה), קטכולאמין תכולת שלפוחית ניתן לכמת על ידי הגילוי של יתד הנוכחי חמצון-חיזור של שלפוחית אחת מתנגשים, adsorbing, ולא לאחר מכן stochastically קריעה על פני האלקטרודה, ובכך לשחרר את תוכנם נגד אלקטרודה משטח26. לפיכך, amperometric הנוכחי לעומת זמן מעקב, כל אירוע rupturing שלפוחית יחיד יכול לגרום ארעי הנוכחי ו, בהכניסו את האזור של ספייק הנוכחי כל, הגודל quantal שלפוחית ניתן לחשב באמצעות חוק Faraday´s.
לכן, על-ידי קישור המידע הכמותי שנרכשו מ מדידות גודל שלפוחית באמצעות הדמיה TEM יחד עם שלפוחית בגודל quantal ניתוח, כפי שנרשם על ידי תאיים cytometry אלקטרוכימי, שלפוחית עצבי הריכוז יכול גם להיות נחושים. זה מאפשר שלפוחית אפיון כאשר התאים חשופים למצבים שונים osmotic ומספק תצוגה טובה יותר על איך שלפוחית עשויים להגיב חוץ-תאי הלחץ osmotic בשלב לפני אקסוציטוזה. התוצאות של שילוב שיטות אלה הראו כי בנוכחות לחץ אוסמוטי גבוה חוץ-תאית, שלפוחית להתכווץ ולהתאים את גודלם quantal השוואת מידע כמותי על השינויים היחסיים של מדידות אלה מראה כי תוך כדי כיווץ, שלפוחית להתאים את התוכן ואת גודל כדי לשמור על ריכוז של עצבי קבוע24. לכן, הבנה זו הוא ערך שם מתחבר תצפיותיו על שחרור נוירוטרנסמיטר בתאים שנחשפו ללחץ osmotic. בפרוטוקולים אלה, אנו מתארים את השימוש האלה מתודולוגיות משלימות שלושה המאפשרים אפיון שלפוחית איך הפרשה ב שלהם לסביבתם הטבעית להגיב osmolality חוץ-תאית, את ההשפעות של תגובה זו על אקסוציטוזה תהליך. בנוסף התצפיות הקודמות לגבי ההשפעה של לחץ אוסמוטי גבוה על אקסוציטוזה24, אנו מציגים ניסויים נוספים המתארים תא התאוששות לאחר הלם אוסמוטי ואת השפעת stimulations בריום מרובים ב- chromaffin תאים.
אנו מציגים כאן פרוטוקול ומהם היתרונות של שילוב שלוש שיטות אנליטיות משלימים לנתח שלפוחית הפרשה ותהליך אקסוציטוזה כדי להשיג הבנה טובה יותר של כיצד כוח פיזי כגון לחץ אוסמוטי יכולות להשפיע על הפרשה שלפוחית בתהליך אקסוציטוזה בתאי הפרשה. שיטות אלה כוללות סיב פחמן microelectrode amperometry, אשר היא שיטה ה?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצה להודות המועצה למחקר השבדי (349-2007-8680) למימון, Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, שוודיה) לתרומה של שור בלוטת יותרת הכליה.
NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M-2670 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
Collagenase P | Roche, Sweden | 11 213 857 001 | |
100-µM Nylon mesh | Fisher Sientific | 08-771-19 | |
Percoll | Sigma Aldrich | P1677 | |
Collagen IV coated 60 mm plastic dish | VWR | 354416 | |
Centrifuge | Avanti J-20XP | ||
Borosilicate glass capillary | Sutter instrument Co., Novato, CA | ||
Micropipette puller | Narishing Inc., Japan | PE-21 | |
Epoxy solutions (A and B) | Epoxy technology, Billerica, MA | ||
Beveller | Narishing Inc. | EG-400 | |
Inverted Microscope | Olympus | IX81 | |
Patch clamp Instrument | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200B | |
Micromanipulator | Burleigh Instrument Inc., USA | PCS-5000 | |
Butane Flame | Multiflame AB, Hässelholm, Sweden | ||
Transmission electron microscopy | Omega | Leo 912 AB |