Analys av immunceller i enda höftnerver och dorsalrotsganglier Ganglion från ett enda musklick med hjälp av flödescytometri
Summary
Kvantitativ analys av cellinnehållet inom murina ischiasnerven är svårt på grund av bristen på vävnaden. Det här protokollet beskriver en metod för vävnad matsmältningen och förberedelse som ger tillräckligt med celler för flödescytometri Flödesanalys av immunceller populationer från nerver av enskilda möss.
Abstract
Nerv-resident immunceller i det perifera nervsystemet (PNS) är avgörande för att bibehålla neuronala integritet i en hälsosam nerv. Immuncellerna i PNS påverkas av skador och sjukdom, som drabbar den nerv-funktionen och förmåga till förnyelse. Neuronala immunceller analyseras vanligen genom immunofluorescens (om). Medan om är avgörande för fastställandet av lokalisering av immuncellerna i nerven, om är bara semikvantitativt och metoden är begränsad till antalet markörer som kan analyseras samtidigt och graden av ytan uttryck. I denna studie användes flödescytometri för kvantitativ analys av leukocytinfiltration i höftnerver eller dorsalrotsganglier ganglier (DRGs) av enskilda möss. Enstaka cell analys utfördes med hjälp av DAPI och flera proteiner analyserades samtidigt för antingen yta eller intracellulära uttryck. Båda höftnerver från en mus som behandlades enligt detta protokoll genereras ≥ 30 000 enstaka kärnförsedda händelser. Andelen av leukocyter i höftnerver, bestäms av uttryck för CD45, var cirka 5% av totala cellinnehållet i ischiasnerven och ca 5-10% i DRG. Även om detta protokoll fokuserar primärt på immunceller befolkningen inom PNS, innebär flexibiliteten i flödescytometri att mäta ett antal markörer samtidigt att de andra celler populationerna inom nerven, såsom Schwann celler, pericyter , fibroblaster och endotelceller, kan även analyseras med hjälp av denna metod. Denna metod ger därför ett nytt medel för att studera systemiska effekter på PNS, såsom neurotoxicology och genetiska modeller av neuropati eller kroniska sjukdomar, som diabetes.
Introduction
Immunceller som anger PNS från cirkulationen, bidra som definieras av uttrycket av CD45 och CD11b, till att upprätthålla integriteten av nerv och spelar en roll både i regeneration och degeneration1. Makrofager (definieras av deras uttryck för CD68 i mus) kan vara sned mot en inflammatorisk fenotyp, uttrycker mer MHC klass II och CD86 på deras yta (M1), eller mot en antiinflammatorisk fenotyp, uttrycker mer intracellulära CD206 (M2)2 . Skevning av makrofag fenotypen är en dynamisk process som regleras genom Akt signalering3, vilket återspeglar de olika uppgifterna av makrofager i försvaret mot patogener (M1) och roll i vävnadsregenerering (M2). Förnyelse av en skadad nerv först kräver fagocytos av myelin skräp av makrofager i nerv4,5, och anti-inflammatorisk (CD68+CD206+) M2 makrofager har visat sig främja axon utväxt i den PNS6. Minskad rekrytering eller makrofager till PNS, eller försämrad kapacitet för fagocytos kan resultera i försämrad förnyelse och underhåll av nerv integritet. Inflammatoriska M1 makrofager, uttrycker MHC klass II, är mindre kapabla av fagocytos än M2 makrofager och neuronala inflammation är inblandade i patogenesen av flera neurodegenerativa sjukdomar7.
De förändringar som sker på nerv bosatt immunsystemet till följd av skada kan vara kvantitativa, manifesterar sig i förlusten av CD45+ leukocyter (eller ökad infiltration av CD45+ leukocyter i fall inflammation), eller kvalitativa, såsom ändra av makrofag fenotyp från M2 till M1 fenotyp. Immuncellerna i PNS har traditionellt analyserats med hjälp av IF, använder frysta sektioner eller paraffin-inbäddat material8. OM krävs för att bestämma localizationen av cellerna i intresse. Dock bygger kvantifiering med om ofta på räknar ett relativt litet antal celler i ett smalt avsnitt av vävnad, vilket gör kvantifiering opålitliga och sårbara för urval bias. För identifiering av enskilda undergrupper av immunceller krävs samtidiga detektion av extracellulära och intracellulära markörer, medan fastställande av makrofag fenotypen kräver minst minst två markörer, särskilt CD206 och MHC klass II. Som oftast tillgängliga Mikroskopen är begränsad till minst två-färg kanaler, såsom fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) och fykoerytrin (PE), kan karakterisering av specifika delmängder av immunceller med om restriktiva och ofullständig, som kräver behovet av att ha flera bilder, som härrör från samma område av intresse, som är målat och analyseras parallellt. Denna tidskrävande aspekt därför inte nödvändigt lämpar sig för analysen av stora provningssatser. Vidare, eftersom de flesta av markörerna av intresse är extracellulära, upptäckt i vävnad, som antingen har bäddats in i paraffin eller cryoconserved, kan vara problematiskt på grund av störningar av membran integritet och maskering av epitoper, samt förlust av antigenerna intresse från användningen av lösningsmedel, till exempel aceton och metanol9.
Däremot flödescytometri, som mäter optiska och fluorescens kännetecken för enstaka celler i suspension när de passerar genom en stråle av ljus, ger en mer praktisk och heltäckande sätt för analys av cellpopulationer. Flödescytometri, i stället för att producera en digital bild av vävnad, ger en automatiserad kvantifiering av parametrar, som inkluderar en cell relativa storlek och reflekterande index, kallad framåt scatter (FSC), granularitet/intern komplexitet eller sida-scatter (SSC) och relativa fluorescensintensiteten, som tillhandahåller att cellen har märkts med en lämplig fluorophore, såsom en konjugerad antikropp. En typisk flödescytometer består av två, luftkylda lasrar; en argon laser producerar blått ljus på 488 nm och en helium-neon laser producerar ljus på 633 nm. Denna kombination tillåter för detektering och mätning, samtidigt, med minst fem mål antingen på ytan eller inom intracellulära utrymmet. Mer avancerade flöde cytometers kan bestå av flera lasrar, som möjliggör upptäckt av upp till åtta olika fluorokromer samtidigt, ger att det peak utsläpp våglängder av de valda fluorokromer inte överlappar avsevärt.
För analys av flödescytometri, måste vävnaden av intresse först enzymatiskt smältas, allmänt med kollagenas, att generera en encellig suspension. Analysen av murina höftnerver har tidigare varit svårt på grund av den lilla mängden vävnad som erhålls från varje mus. Dessutom den höga fetthalten i myelin runt axoner hämmar cellen återhämtning och producerar stora mängder skräp. Den metod som beskrivs häri för ischiasnerven förberedelser och matsmältningen anpassades från protokollet Schwann cell isolering av hårspänne o.a. 7, och syftar till att isolera tillräckligt med celler från nerver av enskilda möss för flödescytometri Flödesanalys, för att minska variationen mellan möss. Med hjälp av DAPI för identifiering av enskilda celler i raw vävnad digest kringgår behovet av att undanröja axon skräp, vilket vanligen leder till cellförlust. Tvätta flera gånger med en tvättmedel-rika buffert aids i lanseringen av celler instängd i feta skräp, därmed öka avkastningen. Rötning av både fullängds höftnerver från en enda mus enligt detta protokoll genererar ≥30, 000 enstaka kärnförsedda händelser och minst 3 gånger numret var Hämtad från DRG. Andelen CD45+ leukocyter var cirka 5% av totala cellinnehållet i ischiasnerven digest och cirka 5-10% i DRG digest. Majoriteten av CD45+ celler i ischiasnerven uttryckt makrofag markörer, CD68 och CD206.
Protocol
Representative Results
Discussion
Höftnerver innehåller en stor andel av lipider, såsom kolesterol, p.g.a. innehållet av myelin runt axoner. Eftersom egenskaperna för lipider ändras med temperatur, kan olika resultat erhållas vid olika temperaturer. För att säkerställa cell bevarande, utfördes alla steg i detta protokoll efter matsmältningen på is. Samtidigt konsistens rekommenderas för skull reproducerbarheten för resultaten, kan det vara möjligt att öka avkastningen genom att utföra steg 3.6 och 3.7 i rumstemperatur. Om nerverna vid s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av den Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG; SFB1118). Författarna vill tacka Axel Erhardt för att utföra de flesta av dissektion och hjälpsamt sända denna kunskap, och Dr. Volker Eckstein för att bistå i den tekniska aspekten av flödescytometer.
Materials
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve – tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
- DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neuroscience. 302, 174-203 (2014).
- Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell. Mol. Life Sci. 72, 4111-4126 (2015).
- Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization. J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).
- Perrin, F. E., Lacroix, S., Avilés-Trieueros, M., David, S. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 128, 854-866 (2005).
- Niemi, J. P., et al. A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration. J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).
- Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair. Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).
- Martini, R., Willison, H. Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies?. Glia. 64, 475-486 (2016).
- Carriel, V., Garzón, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).
- Leong, T. Y. -. M., Leong, A. S. -. Y. How does antigen retrieval work?. Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).
- Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice. J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).
- Pannell, M., et al. Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides. J. Neuroinflammation. 13, 262 (2016).
- Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes. J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).
