Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Uso di zinco sinaptica istochimica per rivelare diverse regioni e lamine nel cervello in via di sviluppo ed adulto

Published: October 29, 2017 doi: 10.3791/56547
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biology, Chemistry and Environmental Sciences, American University of Sharjah, 2Department of Biology, The City College of New York

Summary

Descriviamo una procedura istochimica che rivela la caratteristica dello zinco laminare e areal modelli in diverse regioni del cervello di macchiatura. Il modello di macchiatura di zinco può essere utilizzato in combinazione con altri marcatori anatomici per distinguere attendibilmente strati e regioni nel cervello in via di sviluppo e adulto.

Abstract

Caratterizzazione di organizzazione anatomica e funzionale del cervello e sviluppo richiede un'identificazione accurata di circuiti neurali distinti e regioni nel cervello adulto e immaturo. Qui descriviamo una procedura di colorazione istochimica di zinco che rivela differenze nel pattern di colorazione tra diversi strati e regioni del cervello. Altri hanno utilizzato questa procedura non solo per rivelare la distribuzione di zinco-contenendo i neuroni e circuiti nel cervello, ma anche per delineare correttamente areali e laminari confini nel cervello in via di sviluppo e adulto in diverse specie. Qui illustriamo questa procedura con immagini dallo sviluppo di colorazione e furetto adulto cervelli. Abbiamo rivelato un modello di macchiatura di zinco che serve come indicatore anatomico delle aree e livelli e può essere utilizzati in modo affidabile per distinguere le aree corticali visive nella corteccia visiva in via di sviluppo e adulta. L'obiettivo principale del presente protocollo è di presente un metodo istochimico che permette l'identificazione precisa dei livelli e delle regioni nel cervello adulto e in via di sviluppo dove altri metodi non riescono a farlo. Secondariamente, in concomitanza con analisi densitometrica delle immagini, questo metodo permette di valutare la distribuzione di zinco sinaptica per rivelare potenziali modifiche nel corso dello sviluppo. Questo protocollo descrive dettagliatamente i reagenti, strumenti e passaggi necessari per successivamente macchia sezioni di cervello congelato. Anche se questo protocollo è descritto usando il tessuto di cervello di furetto, può essere facilmente adattato per l'uso in roditori, gatti o scimmie così come in altre regioni del cervello.

Introduction

Le macchie istologiche sono state usate tradizionalmente per aiutare nell'identificazione delle aree corticali in varie specie, rivelando le differenze nelle caratteristiche architettoniche. L'uso combinato di tecniche istochimiche come sostanza di Nissl, reattività del citocromo ossidasi (CO) o mielina può rivelarsi fruttuosa, come rivelano i limiti areali simili nel cervello adulto. Tuttavia, queste macchie istochimiche non rivelano sempre adeguatamente chiari confini tra aree corticali e livelli nel cervello immaturo.

Nel sistema nervoso centrale, lo zinco ha diverse funzioni critiche che includono la struttura del DNA, che agisce come cofattore degli enzimi, che partecipano a numerose funzioni di regolamentazione e di agire come un neuromodulatore attraverso la sua presenza in vescicole sinaptiche di stabilizzazione 1. zinco sinaptico è unico in quanto possono essere visualizzato utilizzando i metodi istologici, mentre lo zinco legato alle proteine non può essere visualizzato in quel momento2. Questa caratteristica è stata sfruttata per rivelare il disegno di zinco sinaptica in diverse regioni corticali e l'istochimica zinco sinaptica è stato utilizzato in una serie di studi. Un sottoinsieme di neuroni glutamatergici nella corteccia cerebrale contengono zinco nelle vescicole presinaptiche entro loro assoni terminali3,4. Gli studi istochimici hanno rivelato una distribuzione eterogenea di zinco sinaptica in corteccia cerebrale5,6,7. Ci sembra essere una diversa distribuzione area e laminare di zinco histochemically reattiva in diverse regioni corticali (ad es., visual contro corteccia somatosensory), o strati (ad esempio, i livelli dello zinco nella supragranular e infragranular strati della corteccia visiva primaria sono sostanzialmente superiori a livello di input thalamocortical IV con i livelli relativamente bassi dello zinco sinaptica)5,8,9. L'eterogeneità in zinco sinaptico colorazione osservata nella corteccia è particolarmente vantaggioso, in quanto facilita l'identificazione areal e laminare.

Qui presentiamo una descrizione dettagliata di una procedura di istochimica zinco sinaptica, che è una versione modificata 1982 metodo10 di Danscher. Questo metodo utilizza la selenite iniettata intraperitonealmente (IP) in animali come un agente chelante. La selenite viaggia al cervello di reagire con piscine di zinco liberi trovati in vescicole di un sottoinsieme di glutamatergic sinapsi nel cervello. Questa reazione produce un precipitato che può essere migliorato successivamente di sviluppo d'argento2,10,11.

Questa procedura rivela pattern laminare e areali di zinco sinaptico colorazione; l'analisi densitometrica può essere utilizzato per valutare questi modelli sia qualitativamente che quantitativamente nel cervello adulto e immaturo per studiare gli effetti di altri interventi, come manipolazioni sensoriale, ambientale, farmacologiche o genetiche. Inoltre, uno potrebbe anche voler valutare potenziali cambiamenti inerenti allo sviluppo nella distribuzione di zinco sinaptica in altre strutture corticale o sottocorticale in altri sistemi-modello. Le informazioni quantitative che fornisce analisi densitometrica in questo metodo possono essere vantaggiose per il seguente sviluppo del cervello nel corso del tempo. Questo protocollo fornisce un compagno ad altri marcatori istochimici e immuno - per rivelare i confini laminari e areali.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

il seguente protocollo segue le linee guida di cura degli animali istituite dall'istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) presso il City College di New York, che sono conformi a tutti i stato appropriato e le linee guida federali. L'anestesia è appropriato per i furetti e debbono essere modificato secondo le specie studiate.

Figure 1
Figura 1: diagramma di flusso che illustra i passaggi principali relativi a 3 fasi del presente protocollo e il tempo necessario per completare ogni passaggio. Periodi che richiedono sezioni asciugare completamente sono mostrati nei circoli testo verde, mentre tutti gli altri passaggi sono nei cerchi di testo bianco. La casella di testo verde a forma di diamante è un punto di decisione, mentre il rettangolo rosso è un passo fondamentale e deve essere eseguito con cura supplementare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. passaggi preparatori (Slide sottotitolazioni e soluzione facendo)

  1. lavare i vetrini unsubbed con un detergente in acqua calda e risciacquare più volte in acqua calda seguita con un risciacquo con acqua distillata per rimuovere completamente qualsiasi sporco o detriti. Vetrini asciugare a temperatura ambiente o in un forno a 37 ° C.
  2. Una volta diapositive sono completamente asciutti, strato un sottile strato uniforme di bianco d'uovo su ogni diapositiva utilizzando le dita o un pennello. Lasciare per asciugare in forno a 60 ° C per 20-30 min. Per un risultato ottimale ed evitare sezioni scivolare fuori, aggiungere una seconda mano di bianco d'uovo e far per asciugare ancora una volta in forno a 60 ° C.
  3. Preparare una soluzione di 1% gelatina sciogliendo 1 grammo di gelatina in 100 mL di acqua calda (60 ° C) e attendere che si raffreddi a temperatura ambiente.
  4. Preparare 200 mL di soluzione di sviluppatore come descritto di seguito per l'uso nella sezione 4.
    1. Preparare la soluzione di gomma arabica aggiungendo lentamente 40g in incrementi di 120 mL di acqua calda (si scioglie più facilmente in questo modo). Continuare a mescolare la soluzione con un bacchetta di vetro. Una volta che la soluzione si è completamente sciolto, e togliere dal fuoco e lasciare raffreddare per qualche minuto, poi filtrare attraverso 6-8 strati di panno di garza in un imbuto.
    2. Citrato di preparare buffer aggiungendo 5,04 g di acido citrico più 4,7 g di citrato di sodio in 20 mL dH 2 O e la miscela di dissoluzione. Assicurarsi che il pH di questa soluzione è 4.0 a 25 ° C. regolare il pH se necessario con l'aggiunta di idrossido di sodio o acido cloridrico alla soluzione.
    3. Preparare la soluzione di idrochinone di riscaldamento 30 mL dH 2 O e sciogliere 1,7 g di idrochinone.
      Nota: Riscaldamento della soluzione di idrochinone è essenziale per permettere che si dissolvono facilmente in acqua come idrochinone non è prontamente solubile in acqua a temperatura ambiente. Prestare attenzione a mantenere la temperatura dell'acqua inferiore a 60 ° C, altrimenti può essere ossidato idrochinone. Se la soluzione diventa gialla, scartare e preparare un'altra soluzione fresca.
    4. Preparare argento lattato soluzione sciogliendo 0,22 g in 30 mL di dH 2 O.
    5. Mescolare le soluzioni (1.4.1 - 1.4.4) nell'ordine in cui sono descritti quando si è pronti per eseguire le reazioni (vale a dire, dopo il sezionamento, asciugatura e fissaggio) ( Figura 2). Aggiungere la soluzione di lattato di argento alla fine. Assicurarsi che questo passaggio è completato rapidamente e la soluzione di sviluppatore è posto al buio fino a quando è il momento di reagire le sezioni come argento lattato è fotosensibile.

Figure 2
Figura 2: schema che illustra la sequenza di passaggi necessari per miscelazione di reagenti in fase di istochimica zinco del protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. trattamento di animale e anestesia

  1. prima del sedativo l'animale, preparare una soluzione di 1% sodio selenito (Na 2 SeO 3) sciogliendo 10 mg di selenito di sodio in 1 mL dH 2 O.
  2. Anestetizzare l'animale con un'iniezione intramuscolare di ketamina (25 mg/kg) e xilazina (2 mg/kg).
    Nota: Accertarsi che un adeguato livello di anestesia è raggiunto utilizzando il pedale risposta riflessa.
  3. Iniettare zinco soluzione di selenito di sodio chelante (15 mg/kg) per via intraperitoneale (IP).
    Nota: La tossicità di selenito di sodio alle età differenti o in altre specie poteva variare.
  4. Consentire 60 a 90 min per il selenito di sodio di viaggiare al cervello. Durante questo periodo, è indispensabile per garantire che l'animale è correttamente sedato e non risponde, quindi controllare la profondità dell'anestesia ogni 5 min.
  5. Il periodo di selenite, mentre l'animale è anestetizzato, assicurano che gli occhi sono chiusi per prevenire la secchezza, o amministrare unguento oftalmico per tenerli umidi.

3. Preparazione dei tessuti e colorazione

  1. eutanasia animale attraverso la somministrazione di una dose eccessiva di sodio pentobarbital (100 mg/kg, i. p).
  2. Eseguire perfusione perfusione con soluzione salina normale per 1 min e con paraformaldeide al 4% per 20 min., infine, somministrare una soluzione con 4% paraformaldeide e 10% di saccarosio (un periodo di fissazione totale di 1 h).
  3. Rimuovere la testina usando un paio di grandi cesoie.
  4. Fare un'incisione del midline usando un bisturi dal naso al collo per esporre il cranio.
  5. Attentamente rimuovere il cervello e separare gli emisferi con una lama.
  6. Bloccare la parte posteriore del cervello e postfix in paraformaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M (PB) per diverse ore.
  7. Posizionare i blocchi in una soluzione di saccarosio 30% in 0.1 M PB e permettere al cervello di lavello.
    Nota: Sostituire la soluzione di saccarosio 4% paraformaldeide e 30% con la soluzione di saccarosio al 30% in 0.1 M PB ad affondare il cervello limita il cervello ' s esposizione di paraformaldeide come questo può influenzare la qualità di colorazione del tessuto.
    8. Lavelli di
  8. una volta il cervello, taglio semi-tangenziale 40 µm spessore sezioni attraverso la corteccia visiva o la regione di interesse su un congelamento, scorrevole microtomo o criostato. Questo può essere realizzato inserendo il blocco con il mediale in superficie verso il basso e delicatamente spianatura con un vetrino.
  9. Raccogliere le sezioni con un pennello e un negozio in un tackle box contenente tampone fosfato salino (PBS).
  10. Separare le sezioni in serie numerata separato. Immediatamente montare uno o due serie di sezioni del cervello il bianco d'uovo subbed diapositive (sezione 1), permettono di asciugare durante la notte a temperatura ambiente e di elaborare le sezioni histochemically per zinco sinaptico.
    Nota: Altre serie possono essere trattata per altri indicatori per il confronto, ad esempio mielina 12 o citocromo ossidasi usando il protocollo modificato 13: incubare per 2-8 h a 40 ° C con 3% di saccarosio, 0.015% citocromo C, catalasi 0.015% e 0,02% diaminobenzidina in PB 0,1 M. Sostanza di Nissl può anche essere utilizzato come un indicatore istologico per distinguere le aree corticali visive. Queste altre macchie istologiche non richiedono che sezioni del cervello sono montate su vetrini subbed bianco d'uovo, quindi le diapositive di gelatina tradizionale rivestito possono essere usate invece.

4. L'istochimica zinco sinaptica

  1. Difficoltà sezioni scivolo montato in alcool assoluto per 15 min e lasciare per asciugare completamente a temperatura ambiente per 1 h.
    2. < lho > immergere brevemente sezioni per 10 s in una soluzione di 1% gelatina (sezione 1) e lasciar asciugare durante la notte a temperatura ambiente.
    Nota: Per risultati ottimali consentono sezioni per asciugare durante la notte. Permettendo sezioni per asciugare durante la notte produce migliore colorazione tissutale.
  2. Mescolare le soluzioni come descritto al punto 1.8, non appena sono pronti per essere reagito sezioni.
    1. Reagire le sezioni organizzando le diapositive fianco a fianco in un bicchiere o una vaschetta di plastica, e versando la soluzione in via di sviluppo le diapositive. Verificare che scivoli sono completamente immersi nella soluzione e trasferire il vassoio in uno spazio buio o coprono con una scatola a tenuta di luce.
      Nota: Un vassoio di plastica che è di circa 12 pollici lunga da 8 pollici di larghezza può essere utilizzato, che si adatta esattamente 18 scivoli. Un volume totale di 200 mL di soluzione di sviluppatore è sufficiente immergere completamente le diapositive, in modo da garantire che il volume corretto viene utilizzato per il numero di diapositive per essere reagito e regolare di conseguenza la ricetta. Uso di un vassoio di plastica o di vetro anziché utilizzare un vassoio di metallo è consigliabile in quanto c'è un certo grado di cross reattività tra il lattato di argento nella soluzione di sviluppatore e il ferro o altri metalli vassoi di metallo trovati in.
  3. Monitorare lo sviluppo della reazione controllando visivamente le sezioni ogni 30 min. Le sezioni richiedono generalmente 120-180 min per lo sviluppo completo.
  4. Se sezioni diventano overstained (Vedi Figura 3a), differenziare in 2% agricoltore ' soluzione s (9 parti di tiosolfato di sodio 2% in dH 2 O e 1 parte 2% ferricianuro di potassio in dH 2 O) per un minimo di 1-2
    Nota: Sezione di esempio che è scarsamente macchiata è illustrato nella Figura 3b.
  5. Una volta ottenuta l'intensità desiderata, terminare la reazione rimuovendo il vetrino montato sezioni dal vassoio e immissione le diapositive in un portavetrini.
  6. Mettere il portavetrini in un bicchiere grande vaschetta di colorazione e lavare i vetrini in ambiente caldo (40-50 ° C) in acqua corrente per 10 min rimuovere lo strato di gelatina e il deposito di argento esterno.
    Nota: Fare attenzione a non agitare il portavetrini per impedire sezioni di scivolare fuori. L'intensità desiderata della sezione è raggiunta quando la variazione laminare sufficiente è evidente e sezioni sono abbastanza scuro ma non esagerato (Vedi Figura 4a).
  7. Lasciare i vetrini asciugare a temperatura ambiente e quindi disidratare in 100% EtOH (5 min), chiaro in xilene (5 min) e coprioggetto con un mezzo di montaggio. In alternativa, porre i vetrini in una serie crescente di alcool, quindi disidratare, chiaro e il vetrino coprioggetti.
  8. Sezioni uso dagli animali senza trattamento precedente di selenite per servire come controllo negativo. Amplificazione d'argento di queste sezioni non deve cedere nessuna colorazione.

Figure 3
Figura 3: zinco sinaptico macchiatura nel cervello giovanile furetto. Microfotografie di semi-tangenziale sezioni macchiate di zinco che sono un) overstained e b) understained nel cervello giovanile furetto. Areali confini sono difficili da discernere come variazione laminare è carente. Materia bianca è anche fortemente macchiata. Ssy Suprasylvian corteccia, WM bianco importa, un'anteriore, D dorsale. Barra della scala = 500 µm (a-b). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. distinguere confini Areal e acquisizione di immagini

  1. uso caratteristiche architettoniche delle regioni differenti del cervello per l'identificazione di areal e laminare.
    Nota: ad esempio, nella sviluppo corteccia retrosplenial 14 ratto, gli autori hanno rivelato una modularità transitoria caratterizzata dalla macchiatura pesante per lo zinco, che non è presente nell'adulto, ma poteva essere utilizzato per descrivere corticale organizzazione durante lo sviluppo in questa specie. In un altro studio 15, gli autori hanno rivelato la specificità nella distribuzione sinaptica zinco di diversi nuclei trovato nell'amigdala scimmia macaco, che facilitano l'identificazione di queste divisioni. Aree corticali visive nel cervello in via di sviluppo e adulto furetto sono stati precedentemente descritti 16 , 17 , 18, suddivisione architettonica della neocorteccia in lo scoiattolo di gray sono stati descritti 19. Inoltre, l'istochimica zinco precedentemente utilizzato per distinguere tra aree in scimmia adulta corteccia visiva 8, sviluppando e adulto gatto corteccia visiva 5, lo sviluppo di corteccia somatosensory del ratto 9 , 20 e topo adulto corteccia somatosensoriale 6 , 21. Se disponibili, confrontare il modello di macchiatura nella mielina macchiato, citocromo ossidasi (CO) macchiato e zinco sinaptico macchiato le sezioni del cervello, per confermare i confini areali nell'adulto. Nelle sezioni semi-tangenziale della corteccia visiva di furetto macchiato per zinco sinaptico, esistono importanti differenze tra aree corticali visive che facilitano l'identificazione areal. Ad esempio, aree 17 e 18 del furetto adulto rivelano che zinco sinaptico macchiatura è alta in strati III e V. strato VI colora meno intensamente, mentre strato IV manca quasi di zinco. La cospicua mancanza di zinco macchiatura nel livello IV o contrasti di aree 17 e 18 con la band scuro macchiato trovato nello strato che IV in CO sezioni macchiate. Tuttavia, livello IV dell'area 17 a CO sezioni macchiata mantiene un bordo tagliente con strati III e V, ma strato IV nella zona 18 è caratterizzato da una sottile diminuzione nell'intensità di colorazione e suo limite superiore trovate nello strato III è meno distinguibile.
  2. Esaminare sezioni mediante microscopia in campo chiaro con un obiettivo di bassa potenza (2 X o ingrandimento 4x) e fotografare le aree di interesse.
  3. Migliora contrasto e luminosità di microfotografie utilizzando software di elaborazione immagine. Le immagini ottenute per misure di densità ottica non devono essere modificate in qualsiasi modo.

Figure 4
Figura 4: zinco sinaptico nel cervello adulto furetto la macchiatura distingue diverse aree corticali visive. Microfotografie di sezioni semi-tangenziale adiacenti hanno macchiato per (un'un) sinaptica zinco o (b) del citocromo ossidasi (CO) nell'adulto. Le frecce contrassegno i limiti dell'areali. Ssy Suprasylvian corteccia, un'anteriore, D dorsale. Barra della scala = 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. densitometria (opzionale)

Nota: DensitomAdriano analisi possono essere utilizzati per valutare la distribuzione di zinco sinaptica nel cervello misurando la densità ottica di zinco rappresentanza macchiato sezioni nelle regioni di interesse. Questo metodo è anche utile per tenere traccia di potenziali cambiamenti nei livelli di zinco sinaptica durante lo sviluppo.

Sezioni di zinco-macchiate
  1. Using selezionato, scegliere casualmente colonne corticali (colonnare microfotografie) di larghezza appropriata (può essere utilizzata una colonna larga 450 µm) acquisite microfotografie della regione di interesse. Una colonna corticale è una regione che attraversa tutti gli strati corticali dalla superficie pial alla materia bianca.
  2. Scegliere un numero appropriato di colonne di esempio da diverse sezioni differenti del cervello in ogni regione di interesse.
  3. Trasferire immagini di esempio di colonne rappresentative in una software di elaborazione immagine.
  4. Utilizzare lo strumento di selezione rettangolare per comprendere l'intera colonna corticale.
  5. Utilizzare lo strumento Inverti per creare un'immagine contrasto invertito simile a un negativo fotografico della colonna.
    Nota: Inversione di contrasto delle immagini viene eseguita per produrre alta densità ottica valori per i livelli dello zinco sinaptica alta e bassa densità ottica valori per i livelli basso dello zinco sinaptica. Si tratta di un modo più intuitivo per eseguire il rendering grafico profilo grafici simili a quelli visti nella Figura 5.
  6. Produrre profili di densità ottica da queste immagini utilizzando lo strumento di profilo di trama per generare un grafico bidimensionale delle intensità pixel lungo una linea.
  7. Opzioni di stampa di uso per convertire il grafico del profilo di trama in un profilo verticale e fare clic su trama profilo una volta più.
    Nota: La distanza rappresenta asse x lungo la linea e l'asse y rappresenta l'intensità di pixel. Di conseguenza, ogni valore di profilo trama riflette il valore di scala di grigi media ad ogni profondità su tutta la larghezza della colonna.
  8. i valori del profilo apre il diagramma come file di testo in foglio di calcolo, normalizzare e plottati con grafici (Vedi Figura 5).
    Nota: Si consiglia di utilizzare la densità relativa di zinco sinaptica per confronto di misure quantitative, come risultati possono essere confuse di variazione di intensità di colorazione generale a seguito di diversi tempi di reazione, lo stainability del tessuto, così come altri variabili.
  9. Calcolare la densità relativa zinco effettuando prima una media di boxcar dei valori di profilo di trama per lisciare i dati.
    Nota: Questa operazione viene eseguita facendo la media, ad esempio, ogni 20 o 30 pixel successivi (1 pixel = 2,5 µm) in profondità e quindi normalizzare alla massima intensità per ciascun campione. Di conseguenza, ogni valore di profilo medio trama riflette il valore di scala di grigio medio a quella profondità (intervallo di valori di scala di grigi da 0 a 255). Un metodo di normalizzazione diversi può essere utilizzato da prima acquisizione valori di densità ottica di materia bianca (WM) da regioni di campione che comprendono la materia bianca sottostante nelle aree di interesse. Idealmente, scegliere diverse regioni che sono come leggermente macchiate come possibile per ottenere una media del valore WM. Valori di densità ottica media allora sono divisi da valori medi di WM per ottenere i valori normalizzati di WM.
  10. Determinare valori di densità ottica a livelli specifici delle regioni di interesse medi per confronti quantitativi.
    Nota: ad esempio, il valore di densità ottica minima media nello strato IV delle aree corticali visive del furetto sono determinati da che comprende la regione meno macchiata di pixel ± 5.
  11. Densità ottica media calcola valori negli strati supragranular e infragranular delle aree corticali visive del furetto di che comprende la regione macchiata più buia di ± 5 pixel per determinare il valore medio massimo.
  12. Assicurarsi che i valori di densità ottica medi sono ottenuti da all'interno di particolari strati.
    Nota: È fondamentale per verificare i limiti di questi strati nelle immagini contrasto invertito confrontandole con le microfotografie originali così come la sezione CO adiacente. Questo garantisce che uno non sconfinare su strati adiacenti.

Figure 5
Figura 5: distribuzione laminare di zinco sinaptico in diversa visiva corticale aree nel furetto adulto. Rappresentante microfotografie di colonne attraverso tutti gli strati corticali con profili corrispondenti di densità ottica normalizzato in un adulto. Densità bassa sinaptica zinco nello strato IV dell'adulti aree 17 e 18 è indicata dal trogolo nella trama del profilo. In ogni profilo di trama, riempiti ovali nella depressione del livello IV indicano i valori utilizzati per determinare il valore di intensità media minima in pixel. Barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I passaggi principali relativi a questo protocollo per macchiare le sezioni del cervello per zinco sinaptico sono presentati in un diagramma di flusso nella Figura 1. Il protocollo può essere diviso in tre fasi: 1) aspersione e tessuto raccolta, preparazione 2) tessuto e la macchiatura e l'istochimica 3) zinco. Brevemente, durante la prima fase del protocollo, l'animale è anestetizzato e IP iniettato con la dose appropriata di selenito di sodio. Dopo un periodo di tempo sufficiente (idealmente 60-90 min), l'animale è successivamente sacrificato, irrorati con soluzione di NaCl 0,9% seguita da una soluzione di paraformaldeide 4%. La testa viene decapitata e il cervello viene rapidamente eliminato dal cranio. Il cervello è quindi consentito ad affondare in un paraformaldeide al 4% più 30% soluzione di saccarosio come crioprotettore. Nella seconda fase del protocollo, le sezioni congelate sono tagliate su un microtomo scorrevole a 40 µm in tampone fosfato salino (PBS) e separate in serie numerata. È importante montare profili il bianco d'uovo subbed diapositive subito dopo il sezionamento, lasciando sezioni ad asciugare durante la notte per ottenere risultati ottimali. Gelatina di subbed diapositive non sono raccomandati come il solfato di potassio cromo in genere utilizzato nella soluzione sottotitolazioni traversa-reagisce con il lattato d'argento, così conducendo alla macchiatura suboptimali. Sezioni vengono quindi incubate per 15 minuti in alcool assoluto e lasciato asciugare a temperatura ambiente. Questo passaggio è seguito da una breve immersione delle sezioni montate in 1% soluzione di gelatina preparata prima del tempo e lasciato asciugare durante la notte per ottenere risultati ottimali. Nell'ultima fase del protocollo (istochimica di zinco), la soluzione di sviluppatore è preparata seguendo i passaggi descritti nella sezione metodi e diapositive sono collocati in un vassoio di plastica o di vetro sommerso nella soluzione. Lo sviluppo della macchia in genere prende ovunque tra 2-3 h, ma visivo ravvicinato è necessario evitare le sezioni di overstaining. Quando è raggiunto intensità adeguata, diapositive dovrebbero essere rimosso, collocati su una rastrelliera di diapositiva e sciacquati in acqua calda per 5-10 minuti rimuovere il deposito di argento esterno. Le sezioni possono poi essiccare a temperatura ambiente, cancellato e coperti con. Uno schema dei passaggi specifici necessari per completare la fase di istochimica zinco del protocollo è illustrato nella Figura 2.

Questo protocollo utilizza l'istochimica zinco sinaptica per rivelare areal e laminare variazione nei livelli di colorazione tra aree visive corticali del cervello di furetto. Questo protocollo può essere adattato per l'uso in altre specie, così come in altre regioni del cervello. Ad esempio, i ricercatori che studiano altre cortecce sensoriali come la corteccia somatosensoriale, uditiva o frontale del furetto o qualsiasi altro sistema di modello sarebbero di grande beneficio dal usando questa macchia istochimica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che esso fornisce chiare transizioni tra aree per facilitare l'identificazione areal negli adulti così come differenziare attendibilmente aree corticali in giovani animali come scimmie, gatti, furetti e roditori.

Figura 3a viene illustrato un esempio di un sezione macchiato che abbiamo inavvertitamente sviluppato per troppo lungo e quindi è stato overstained di zinco nel processo. Tessuto overstained è caratterizzata da un colore marrone molto scuro, una mancanza di variazione laminare e fortemente macchiati della materia bianca. Tuttavia, sezioni del cervello macchiato di zinco possono a volte essere understained come illustrato in Figura 3b. Sezioni understained a volte possono verificarsi se l'animale non è sopravvissuto per un sufficiente lasso di tempo (almeno 60 min), che esclude tutti i selenito iniettato dal viaggio al cervello. Understaining del tessuto può verificarsi anche se la selenite non è stata amministrata correttamente e pertanto non viaggiare al cervello.

La distribuzione eterogenea di zinco sinaptica macchiatura in più aree corticali visive in un furetto adulto è mostrata in una sezione semi-tangenziale rappresentanza nella Figura 4a. Le frecce puntano ai confini areali. Nelle aree 17 e 18, l'intensità di macchiatura di zinco sinaptico è generalmente elevata in Layer I, II, III e V e a basso contenuto di livello IV (strato thalamorecipient) e moderato nel livello VI. La presenza di una transizione chiaramente identificabile tra aree 17 e 18 è evidente nella Figura 4a. Intensità di colorazione del IV livello in zona 18 aumenta leggermente e strato V diminuisce ed è di intensità variabile. Figura 4b è una sezione adiacente macchiata per la citocromo ossidasi (CO) che illustra i percorsi simili di areali confini per quelli che abbiamo osservato con la macchia di zinco. Regioni delle aree 17 e 18 che hanno alti livelli di zinco generalmente sembrano avere bassi livelli di CO la macchiatura.

La distribuzione dello zinco sinaptica nelle aree 19 e 21 è qualitativamente simile in entrambe le aree hanno meno laminare variazione rispetto nelle aree 17 e 18. Livello IV delle zone 19 e 21 è chiaramente diverso da strato IV nelle aree 17 e 18 in quanto esso è moderatamente macchiato. I livelli di supragranular e infragranular della zona 19 sono di intensità simile, ma strato V macchie leggermente più scura. Zona 21 ha una distribuzione di zinco sinaptica paragonabile a quella in zona 19. Tuttavia, strato VI dell'area 21 è caratterizzata da maggiori livelli di zinco sinaptica di strato IV di zona 19. Strati VI e IV di Suprasylvian (Ssy) sembrano essere moderatamente macchiato e sono di intensità paragonabile, mentre strato V è caratterizzato da maggiori livelli di zinco sinaptica e i livelli di supragranular sono contrassegnati da un motivo fluttuante dei livelli dello zinco sinaptica.

Valutazione quantitativa della distribuzione di zinco sinaptica in regioni differenti del cervello, con diversi trattamenti, o a diverse età, può essere compiuto, se lo si desidera. Per esempio, uno potrebbe voler valutare modifiche nella distribuzione di zinco sinaptica in adulti o durante lo sviluppo in primaria visiva, uditiva e corteccia somatosensory in qualsiasi sistema di modello. Utilizzando l'analisi densitometrica, precedentemente abbiamo indicato che la distribuzione dello zinco sinaptica in più aree visive (17, 18, 19, 21 e Suprasylvian) di sviluppo del cervello furetto, diminuire in maniera significativa da cinque a sei settimane di età17. Qui descriviamo la procedura necessaria per valutare le differenze nella distribuzione di zinco sinaptica in campioni rappresentativi prelevati da un furetto adulto per illustrare il processo. Questa procedura può essere seguita per tenere traccia delle modifiche nella distribuzione di zinco sinaptica nella corteccia visiva del furetto giovanile così come in altre regioni qualsiasi specie o cervello. La figura 5 Mostra rappresentative microfotografie colonnare da sezioni di cervello adulto elaborati per l'istochimica zinco insieme con i loro profili di trama di densità ottica normalizzato complementari. Normalizzato appezzamenti di valori di densità ottica sono stati generati per riflettere le modifiche secondo profondità corticale. Quindi, ogni valore di profilo trama riflette il valore di scala di grigio medio a profondità corticale consecutivi. Per esempio, aree 17 e 18 sono caratterizzate da un notevole calo in zinco macchiatura in strato IV (rappresentato dal trogolo), che è evidente dai loro profili di trama. Significa che i valori di densità ottica minima nelle aree 17 e 18 sono indicati con gli ovali riempita in nero. Lo zinco basso colorazione osservata nello strato IV di contrasti aree 17 e 18 con il solo un tuffo sottile in zinco livelli nelle aree 19, 21 e Ssy. Collettivamente, aree 19, 21 e Ssy sono qualitativamente differenti rispetto alle aree 17 e 18, in quanto i livelli dello zinco durante tutti gli strati è più omogenea rispetto nelle aree 17 e 18. Inoltre, i livelli di supragranular e strato V di aree 17 e 18 in genere macchia più intensamente di livello VI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lo studio corrente impiega una tecnica istochimica basata su una versione modificata del Danscher (1982) metodo10, per cui zinco sinaptica localizzazione può essere rilevato e visualizzato nel cervello. Questo metodo funziona essenzialmente iniettando l'animale con il selenito di sodio chelante (Na2SeO3) di zinco (15 mg/kg). A seguito di iniezione, la selenite viaggia al cervello e si lega di zinco liberi che è localizzato alle vescicole presinaptiche di zinco contenente neuroni. Gli ioni di zinco associato a molecole all'interno di vescicole sinaptiche precipitato e possono successivamente essere visualizzati attraverso lo sviluppo fisico2,11. Metodo di macchiatura d'argento di solfuro di Timm originale è stato inteso per rilevare e visualizzare un numero di metalli pesanti come Au, Ag, Pt, Fe, Cd, Cu, Ni e Zn in tessuti biologici22. L'agente chelante utilizzato per questo metodo è il solfuro di sodio. Di conseguenza, un grosso problema con l'utilizzo di metodo di solfuro di Timm è la mancanza di specificità come qualsiasi metallo che può essere trasformato in un solfuro metallico potrebbe effettivamente essere argento amplificato di sviluppo fisico. Tuttavia, la versione modificata del metodo Danscher che viene utilizzato in questo studio è specifica di zinco e nessun altri metalli pesanti. Ci sono molte differenze tra 1982 metodo di Danscher e il metodo presente che descriviamo in questo studio. Metodo di Danscher utilizza tessuto cerebrale unfixed fresco mentre utilizziamo tessuto congelato. Danscher utilizza anche glutaraldeide per la perfusione, mentre usiamo paraformaldeide come questo è più compatibile con altri marcatori istologici che abbiamo ordinariamente macchia nel nostro laboratorio e immunohistochemical. Danscher utilizza anche poststaining procedure come il blu di toluidina (1%), che non eseguiamo nel nostro metodo.

Una limitazione della tecnica attuale è l'imprevedibilità connesso con tolleranza di selenito di sodio dagli animali. Troviamo che dopo aver somministrato il selenito di sodio, a volte gli animali non sopravvivono più di 30 minuti. Questa situazione pone un problema in quanto non consente un tempo sufficiente per il selenito di viaggiare al cervello, e lo sviluppo successivo delle sezioni del cervello in genere porta a colorazione tissutale irregolare. Un'altra limitazione potenziale è relativo per la corretta amministrazione dell'iniezione intraperitoneale di selenito di sodio. Uno dovrebbe tirare la pelle sopra la cavità addominale inferiore e inserire il lato di smussatura dell'ago verso l'alto ad un angolo di 15-20 gradi, penetrano solo la parete addominale. L'ago dovrebbe essere tirato indietro leggermente per garantire che gli organi addominali non sono stati penetrati e materiale non è stato aspirato. L'ago dovrebbe essere smaltito e sostituito in questo caso.

Per garantire risultati di macchiatura di alta qualità e riproducibilità, consigliamo le seguenti misure cautelative. Corretta amministrazione di selenito di sodio nel tempo di sopravvivenza animale e massimizzazione dell'animale (60-90 min è ottimale) prima di eutanasia, sono fondamentali per garantire il tempo sufficiente per il selenito di viaggiare al cervello. Abbiamo trovato che più brevi periodi di sopravvivenza (30 minuti o meno) in genere portare a colorazione tissutale irregolare. Allo stesso modo, montaggio sezioni sui vetrini subbed-albume immediatamente dopo il blocco di sezionamento è un passo fondamentale. Lasciando appena tagliato le sezioni congelate in PBS per un numero di giorni è fortemente sconsigliato come gli ioni di zinco saranno percolare in soluzione. Durante la preparazione della soluzione dello sviluppatore, è fondamentale per garantire che il tampone citrato è il pH corretto (4.0) come questa reazione è molto sensibile a piccole variazioni di pH. Allo stesso modo, quando il riscaldamento della soluzione di idrochinone è indispensabile per mantenere la temperatura sotto i 60 ° C, come ulteriore riscaldamento sarà ossidare la soluzione e inibire la macchia. Allo stesso modo, sommergendo brevemente le sezioni montata in gelatina è fondamentale quanto impedisce la deposizione non specifici d'argento sulla superficie della sezione. Tuttavia, le sezioni non devono essere lasciati nella soluzione di gelatina più di 10 anni s come questo li indurrà a avvizzire che porta alla colorazione tissutale irregolare. Controllo visivo periodico delle sezioni mentre nella soluzione di sviluppatore è consigliato dopo aver lasciato che le sezioni per troppo tempo possono portare a overstaining. Questa macchia è abbastanza termosensibile, quindi sezioni tendono a sviluppare più rapidamente quando la temperatura ambiente è calda e più lentamente quando la temperatura è più fresca. Infine, se uno vuole agitare delicatamente le diapositive nel portavetrini durante la fase di risciacquo in acqua calda per facilitare la rimozione della gelatina e deposito residuo d'argento dalle diapositive. Tuttavia, agitazione eccessiva e incurante delle sezioni mentre risciacquo diapositive con acqua calda può causare sezioni a scivolare fuori le diapositive e dovrebbe essere evitato. È anche fondamentale per assicurare che un adeguato controllo è utilizzato per misurazioni densitometriche di fare confronti quantitativi. Uno potrebbe potenzialmente utilizzare un'area leggermente macchiata o non macchia come controllo interno. Nel nostro materiale, usiamo la materia bianca come controllo per normalizzare i valori di densità ottica in diverse aree visive corticali durante lo sviluppo. Troviamo che i valori della materia bianca sono comparabili attraverso diverse epoche e nell' adulto17. Pertanto, dato che la materia bianca valori non cambiano in funzione dell'età, materia bianca funge da un controllo valido per analisi densitometrica.

Il vantaggio principale di questo metodo è che è una macchia istochimica semplice ed affidabile cui distribuzione può essere utilizzata, come altri marcatori istochimici, per distinguere le regioni del cervello. Tuttavia, l'uso di questo metodo istochimico può non essere adatto per lo studio di alcune popolazioni di cellule (quelli privi di zinco), o in animali molto giovani come zinco sinaptico sono inizialmente bassi alla nascita, come mostrato nello sviluppo del mouse somatosensoriale e corteccia visiva del gatto5 livelli ,20. Un altro vantaggio di questo protocollo è che può essere utilizzato in combinazione con gli esperimenti di iniezione tracciante neuroanatomical. Nel nostro laboratorio, abbiamo in genere iniettare un tracciante neuronale bidirezionale in corteccia visiva primaria dei furetti giovanile per studiare i cambiamenti inerenti allo sviluppo nel modello di connettività tra più aree nella corteccia visiva. Pertanto, animali bisogno di non essere utilizzati esclusivamente per l'istochimica zinco se gli animali potrebbero essere sfruttati per un differente studio sperimentale. Il principale vantaggio del metodo descritto è che può essere adattato per l'uso in altre specie e in altre regioni del cervello. Anche se abbiamo dimostrato questo metodo utilizzando il tessuto cerebrale furetto, ci possono essere differenze sottili in alcuni dei passaggi quando si studia il tessuto cerebrale da roditori, gatti o scimmie. Altri hanno utilizzato con successo questo metodo istochimica di zinco per illustrare le differenze nel metodo di colorazione nella scimmia adulta corteccia visiva8, sviluppando e adulto gatto corteccia visiva5, lo sviluppo di ratto corteccia somatosensoriale9 , 20, topo adulto corteccia somatosensoriale6,21e adulti Parma wallaby corteccia visiva7.

Qui descriviamo la procedura di base dei parametri protocollo e sottolineatura importante che devono essere controllati per ottenere costantemente macchiatura di zinco di alta qualità. Uno potrebbe desiderare valutare i cambiamenti nei livelli di zinco sinaptica nelle altre cortecce sensoriali o motore o strutture subcortical in altri modelli animali. Le informazioni quantitative che densitometriche unnalisi fornisce in questo metodo può essere vantaggioso per il seguente sviluppo corticale nel tempo e possibilmente rivelando diversi profili inerenti allo sviluppo dei livelli di zinco sinaptica tra diverse regioni del cervello (come abbiamo in precedenza dimostrato17). Una considerazione importante è la questione inerente allo sviluppo e l'età corrispondente degli animali per studiare. L'istochimica zinco sinaptica rivela chiaramente identificabili aree corticali visive nei furetti e può servire come una guida utile in ulteriori studi di organizzazione corticale e funzione.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal centro nazionale per le risorse di ricerca (2G12RR03060-26A1); L'Istituto nazionale sulla salute delle minoranze e le disparità di salute (8G12MD007603-27) dal National Institutes of Health; Professional Staff Congress-City University of New York (PSC-CUNY); e facoltà Research Grant (la RFG II) American University of Sharjah. Ringraziamo Vidyasagar Sriramoju per introdurre noi a questi metodi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Euthasol (Euthanasia solution) Henry Schein 710101
Sodium selenite Sigma-Aldrich 214485
Ketamine (Ketaved) Henry Schein 48858 100 mg/ml injectables
Xylazine (Anased) Henry Schein 33198 100 mg/ml injectables
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Dilute to 4%
Gum arabic Sigma-Aldrich G9752-500G
Citric acid Sigma-Aldrich C1909
Sodium citrate Sigma-Aldrich W302600
Hydroquinone Sigma-Aldrich H9003
Silver lactate Sigma-Aldrich 85210
Fish gelatine Sigma-Aldrich G7765
Cytochrome c Sigma-Aldrich C2506 (Type III, from equine heart)
Catalse Sigma-Aldrich C10
Sucrose Domino
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL
Permount Fisher Scientific SP15-500
100% Ethanol Fisher Scientific A406-20 Used for dehydration prior to slide mounting
Coverslips Brain Research Laboratories #3660-1
Frosted unsubbed slides Brain Research Laboratories #3875-FR
Microtome American Optical Company 860
Microscope Olympus BX-60
Adope Photoshop Adobe Systems, San Jose, CA To assemble images
ImageJ Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ For densometric measurements
Plastic tray Any standard plastic tray may be used to immerse slides in developer solution
Hot plate Any standard hotplate may be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
  2. Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
  3. Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
  4. Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
  5. Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
  6. Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
  7. Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
  8. Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
  9. Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
  10. Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
  11. Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
  12. Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
  13. Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
  14. Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
  15. Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
  16. Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
  17. Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
  18. Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
  19. Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
  20. Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
  21. Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
  22. Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).

Tags

Neurobiologia problema 128 neuroanatomia corteccia cerebrale striato marcatore anatomico metodo di macchiatura corteccia variazione laminare
Uso di zinco sinaptica istochimica per rivelare diverse regioni e lamine nel cervello in via di sviluppo ed adulto
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Khalil, R., Levitt, J. B. Use of… More

Khalil, R., Levitt, J. B. Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain. J. Vis. Exp. (128), e56547, doi:10.3791/56547 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter