Summary

Uso di zinco sinaptica istochimica per rivelare diverse regioni e lamine nel cervello in via di sviluppo ed adulto

Published: October 29, 2017
doi:

Summary

Descriviamo una procedura istochimica che rivela la caratteristica dello zinco laminare e areal modelli in diverse regioni del cervello di macchiatura. Il modello di macchiatura di zinco può essere utilizzato in combinazione con altri marcatori anatomici per distinguere attendibilmente strati e regioni nel cervello in via di sviluppo e adulto.

Abstract

Caratterizzazione di organizzazione anatomica e funzionale del cervello e sviluppo richiede un’identificazione accurata di circuiti neurali distinti e regioni nel cervello adulto e immaturo. Qui descriviamo una procedura di colorazione istochimica di zinco che rivela differenze nel pattern di colorazione tra diversi strati e regioni del cervello. Altri hanno utilizzato questa procedura non solo per rivelare la distribuzione di zinco-contenendo i neuroni e circuiti nel cervello, ma anche per delineare correttamente areali e laminari confini nel cervello in via di sviluppo e adulto in diverse specie. Qui illustriamo questa procedura con immagini dallo sviluppo di colorazione e furetto adulto cervelli. Abbiamo rivelato un modello di macchiatura di zinco che serve come indicatore anatomico delle aree e livelli e può essere utilizzati in modo affidabile per distinguere le aree corticali visive nella corteccia visiva in via di sviluppo e adulta. L’obiettivo principale del presente protocollo è di presente un metodo istochimico che permette l’identificazione precisa dei livelli e delle regioni nel cervello adulto e in via di sviluppo dove altri metodi non riescono a farlo. Secondariamente, in concomitanza con analisi densitometrica delle immagini, questo metodo permette di valutare la distribuzione di zinco sinaptica per rivelare potenziali modifiche nel corso dello sviluppo. Questo protocollo descrive dettagliatamente i reagenti, strumenti e passaggi necessari per successivamente macchia sezioni di cervello congelato. Anche se questo protocollo è descritto usando il tessuto di cervello di furetto, può essere facilmente adattato per l’uso in roditori, gatti o scimmie così come in altre regioni del cervello.

Introduction

Le macchie istologiche sono state usate tradizionalmente per aiutare nell’identificazione delle aree corticali in varie specie, rivelando le differenze nelle caratteristiche architettoniche. L’uso combinato di tecniche istochimiche come sostanza di Nissl, reattività del citocromo ossidasi (CO) o mielina può rivelarsi fruttuosa, come rivelano i limiti areali simili nel cervello adulto. Tuttavia, queste macchie istochimiche non rivelano sempre adeguatamente chiari confini tra aree corticali e livelli nel cervello immaturo.

Nel sistema nervoso centrale, lo zinco ha diverse funzioni critiche che includono la struttura del DNA, che agisce come cofattore degli enzimi, che partecipano a numerose funzioni di regolamentazione e di agire come un neuromodulatore attraverso la sua presenza in vescicole sinaptiche di stabilizzazione 1. zinco sinaptico è unico in quanto possono essere visualizzato utilizzando i metodi istologici, mentre lo zinco legato alle proteine non può essere visualizzato in quel momento2. Questa caratteristica è stata sfruttata per rivelare il disegno di zinco sinaptica in diverse regioni corticali e l’istochimica zinco sinaptica è stato utilizzato in una serie di studi. Un sottoinsieme di neuroni glutamatergici nella corteccia cerebrale contengono zinco nelle vescicole presinaptiche entro loro assoni terminali3,4. Gli studi istochimici hanno rivelato una distribuzione eterogenea di zinco sinaptica in corteccia cerebrale5,6,7. Ci sembra essere una diversa distribuzione area e laminare di zinco histochemically reattiva in diverse regioni corticali (ad es., visual contro corteccia somatosensory), o strati (ad esempio, i livelli dello zinco nella supragranular e infragranular strati della corteccia visiva primaria sono sostanzialmente superiori a livello di input thalamocortical IV con i livelli relativamente bassi dello zinco sinaptica)5,8,9. L’eterogeneità in zinco sinaptico colorazione osservata nella corteccia è particolarmente vantaggioso, in quanto facilita l’identificazione areal e laminare.

Qui presentiamo una descrizione dettagliata di una procedura di istochimica zinco sinaptica, che è una versione modificata 1982 metodo10 di Danscher. Questo metodo utilizza la selenite iniettata intraperitonealmente (IP) in animali come un agente chelante. La selenite viaggia al cervello di reagire con piscine di zinco liberi trovati in vescicole di un sottoinsieme di glutamatergic sinapsi nel cervello. Questa reazione produce un precipitato che può essere migliorato successivamente di sviluppo d’argento2,10,11.

Questa procedura rivela pattern laminare e areali di zinco sinaptico colorazione; l’analisi densitometrica può essere utilizzato per valutare questi modelli sia qualitativamente che quantitativamente nel cervello adulto e immaturo per studiare gli effetti di altri interventi, come manipolazioni sensoriale, ambientale, farmacologiche o genetiche. Inoltre, uno potrebbe anche voler valutare potenziali cambiamenti inerenti allo sviluppo nella distribuzione di zinco sinaptica in altre strutture corticale o sottocorticale in altri sistemi-modello. Le informazioni quantitative che fornisce analisi densitometrica in questo metodo possono essere vantaggiose per il seguente sviluppo del cervello nel corso del tempo. Questo protocollo fornisce un compagno ad altri marcatori istochimici e immuno – per rivelare i confini laminari e areali.

Protocol

il seguente protocollo segue le linee guida di cura degli animali istituite dall’istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) presso il City College di New York, che sono conformi a tutti i stato appropriato e le linee guida federali. L’anestesia è appropriato per i furetti e debbono essere modificato secondo le specie studiate. Figura 1: diagramma di flusso…

Representative Results

I passaggi principali relativi a questo protocollo per macchiare le sezioni del cervello per zinco sinaptico sono presentati in un diagramma di flusso nella Figura 1. Il protocollo può essere diviso in tre fasi: 1) aspersione e tessuto raccolta, preparazione 2) tessuto e la macchiatura e l’istochimica 3) zinco. Brevemente, durante la prima fase del protocollo, l’animale è anestetizzato e IP iniettato con la dose appropriata di selenito di sodio. Dopo un per…

Discussion

Lo studio corrente impiega una tecnica istochimica basata su una versione modificata del Danscher (1982) metodo10, per cui zinco sinaptica localizzazione può essere rilevato e visualizzato nel cervello. Questo metodo funziona essenzialmente iniettando l’animale con il selenito di sodio chelante (Na2SeO3) di zinco (15 mg/kg). A seguito di iniezione, la selenite viaggia al cervello e si lega di zinco liberi che è localizzato alle vescicole presinaptiche di zinco contenente ne…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal centro nazionale per le risorse di ricerca (2G12RR03060-26A1); L’Istituto nazionale sulla salute delle minoranze e le disparità di salute (8G12MD007603-27) dal National Institutes of Health; Professional Staff Congress-City University of New York (PSC-CUNY); e facoltà Research Grant (la RFG II) American University of Sharjah. Ringraziamo Vidyasagar Sriramoju per introdurre noi a questi metodi.

Materials

Euthasol (Euthanasia solution) Henry Schein 710101
Sodium selenite Sigma-Aldrich 214485
Ketamine (Ketaved) Henry Schein 48858 100 mg/ml injectables
Xylazine (Anased) Henry Schein 33198 100 mg/ml injectables
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Dilute to 4%
Gum arabic Sigma-Aldrich G9752-500G
Citric acid Sigma-Aldrich C1909
Sodium citrate Sigma-Aldrich W302600
Hydroquinone Sigma-Aldrich H9003
Silver lactate Sigma-Aldrich 85210
Fish gelatine Sigma-Aldrich G7765
Cytochrome c Sigma-Aldrich C2506 (Type III, from equine heart)
Catalse Sigma-Aldrich C10
Sucrose Domino
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL
Permount Fisher Scientific SP15-500
100% Ethanol Fisher Scientific A406-20 Used for dehydration prior to slide mounting
Coverslips Brain Research Laboratories #3660-1
Frosted unsubbed slides Brain Research Laboratories #3875-FR
Microtome American Optical Company 860
Microscope Olympus BX-60
Adope Photoshop Adobe Systems, San Jose, CA To assemble images
ImageJ Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ For densometric measurements
Plastic tray Any standard plastic tray may be used to immerse slides in developer solution
Hot plate Any standard hotplate may be used

References

  1. Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
  2. Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
  3. Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
  4. Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
  5. Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
  6. Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
  7. Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
  8. Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
  9. Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
  10. Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
  11. Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm’s sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
  12. Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
  13. Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
  14. Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
  15. Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
  16. Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
  17. Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
  18. Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
  19. Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
  20. Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
  21. Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
  22. Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).

Play Video

Cite This Article
Khalil, R., Levitt, J. B. Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain. J. Vis. Exp. (128), e56547, doi:10.3791/56547 (2017).

View Video