Summary
有一个要求, 使临床前测试的一个新的类 "孤儿" 药物称为药理伴侣可再生, 快速, 高效。我们开发了一个简单, 高度标准化, 多功能细胞文化检测, 以筛选合格的病人以及新的药理陪护药物。
Abstract
使用个性化药物治疗罕见的基因疾病, 如溶酶体存储紊乱 (LSDs) 是挑战的复杂的临床试验设计, 高成本, 和低的病人人数。在大多数的 LSDs 中, 有数百个变种等位基因被牵连。根据病情轻重, 这些疾病通常分为2到3种不同的临床类型。此外, 基因型的分子特性可以帮助预测临床结果和告知病人护理。因此, 我们开发了一个简单的细胞培养方法的基础上 HEK293H 细胞 heterologously 发酵的突变发现的法布里和庞贝氏病。最近还引入了类似的检测方法作为临床前检查, 以确定在法布里病中药物陪护治疗 (PCT) 的易变异。这份手稿描述了一个修订的细胞培养法, 使位变异的快速表型评估, 以确定符合标准的患者, 并可能有助于发展新的 pharmacochaperones。
Introduction
有十几个溶酶体存储紊乱 (LSDs) 与糖苷功能障碍相关的主要基因突变的结果。在法布里 (OMIM #301500) 和庞贝氏病 (OMIM #232300) 疾病, 超过500和200义突变1,2,3分别报告, 这相当于大约60% 的总变异计数。许多新的基因变种仍在被识别, 其中很多是未知的意义。广泛的生物化学研究表明, 某些基因型不会导致一个完整的功能的玻璃基因 (OMIM * 300644) 在法布里病, 但导致相应的酶未能达到一个热力青睐的折叠状态 4.这导致 ER 保留和过早退化, 否则功能酶。类似的结论也在其他 LSDs 包括庞贝氏病5中得出。此外, 分子特性的酶变体可以促进临床解释的突变在诊断时的6, 这表明 LSD 进展是一个个体的过程中, 基于突变的性质。因此, 为了简化临床咨询和治疗决策, 应重新评估传统的2到3种不同临床类型的分类。
两种疾病都有酶替代疗法。然而, 在受影响的组织/器官, 如大脑和骨骼肌肉的功效有限。此外, 专家审评可以引起免疫的反应, 危及其治疗效益。药理陪护 (PCs) 是一种有吸引力的治疗方案, so-called 反应性突变患者。pc 作为正确的蛋白质折叠和稳定的分子支架, 从而防止内质网 (er) 保留和 er 相关的酶降解。此外, 个人电脑可以口服和潜在的能够跨越血脑屏障。因此, PCT 可能是一个更可行的选择, 以治疗患者的某些基因型。有关 LSDs 中 PC 应用程序的广泛审查, 请参阅 Parenti7的优秀评审。
发现数以百计的疾病, 导致突变等位基因挑战前临床药物测试, 并要求一个简单, 快速, 和高度标准化的评估, 以适合病人的个性化药物的方法。为了评估 LSD 基因突变的不利影响, 并测试候选突变, 以预测适合的患者 PCT, 一个高度标准化的表达系统的 HEK293H 细胞, 允许快速和可靠的酶活性测量开发.类似的表达系统曾被描述为法布里和庞贝氏病, 使用 COS-78,9,10,11, HeLa 细胞12, 或 HEK29313 ,14,15,16糖苷基因的单元格。
一个非常类似的方法甚至被授予专利作为 "预测反应的方法, 药理陪护治疗疾病"17表明的相关性, 细胞培养系统能够融入临床实践。
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Protocol
1. 制备突变 pcDNA3.1/pcDNA3.1/GAA 结构
注意: 玻璃和GAA编码序列 (cd) 的克隆策略已在较早的15、18中报告。
- 用定点诱变的定点诱变
- 分别使用参照序列 NM_000169.2 和 NM_000152.4 作为玻璃化和 GAA基因突变的模板。有一套高纯度无盐底漆 (25-37-市面) 由一个商业供应商合成, 与意义和反义引物运载其中一个各自序列修改中央对他们的长度单独地介绍变异。使用免费入门设计工具支持入门设计19。
- 对于反应混合物, 使用制造商提供的反应溶液和 PCR 条件的标准条件。
- 混合5µL 10x 反应缓冲器, 10 ng 双模板质粒 DNA (pcDNA3.1/pcDNA3.1/GAA), 每个底漆 125 ng, 1 µL 提供 dNTP 混合物, 3 µL 的亚甲基亚砜试剂在适当量的去离子水 (最终反应量:50 µL)。最后, 添加 2.5 U 的 DNA 聚合酶和混合由移上下。作为一个负控制, 随身携带一个 no-primer 样本。
- 使用以下程序启动 PCR: 步骤 1:95 ° c 为1分钟, 步 2:95 ° c 为五十年代, 步 3:60 ° c 为五十年代, 步 4:68 ° c 为 8 min, 重复步骤 2-4 18 次, 并且步骤 5:68 ° c 为 10 min。
- 以下 PCR, 添加1µL 的DpnI 限制性酶 (10 U/µL) 和进一步孵化反应瓶在37° c 为 1 h。
- 所需克隆的转换和筛选
- 根据制造商的建议, 转换分的 ultracompetent 细胞。使用 SOC 介质 (胰 2% (w/v), 酵母提取物 0.5% (w/v), 氯化钠10毫米, 氯化钾2.5 毫米, 在121° c 消毒, 然后添加无菌过滤解决方案的氯化镁2和葡萄糖高达最终浓度10和20毫米, 分别) 而不是制造商的中.程序后, 250 µL 的样本突变的 LB 板含有100µg/毫升氨苄西林和孵化在37° c 18 小时。
- 确保转化的数量和 #62; 10 和反应产生至少三倍的殖民地作为 no-primer 控制反应,例如, 使用发光板, 以促进菌落计数。然后选择3殖民地和准备3毫升的隔夜文化在 LB 肉汤培养基。
- 第二天, 用标准的试剂盒进行质粒制备, 并使用 T7 (5ʹ-TAA TAC GG-3ʹ) 和 BGHr (5ʹ-标记 AAG-TCG AGG-3ʹ) 通过标准桑格测序对整个序列进行分析。
- 使用合适的分子生物学工具分析序列。当检测到所需的突变, 并没有进一步的序列异常相比, NM_000169.2 (α-乳糖 A) 或 NM_000152.4 (酸α-酶), 选择克隆的转染级质粒纯化。
- 通过测量分光光度计的吸收度来确定 DNA 的纯度。
注: 只允许生产质粒纯度与 #62 的260/280 吸光度比的制剂; 1.8 用于细胞培养实验。
2. HEK293H 细胞的培养
- 维持 HEK293H 细胞在高葡萄糖 (4.5 克/升) Dulbecco´s 改良鹰培养基 (DMEM) 补充10% 胎牛血清 (FBS) 和1% 青霉素/链霉素。将细胞保持在37° c 以下 5% CO2大气压下的套培养箱中。
- 培养细胞到密度为 80-90%。
- 在没有 Ca2 +和 Mg2 +的情况下, 使用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 吸入培养基并进行洗涤。
- 通过加入0.05% 胰蛋白酶-EDTA 和孵育5分钟在37° c 和 5% CO2。
- 将新培养基和种子中的1:15 细胞分裂成一种新型的 T75 烧瓶, 以维持永久的文化。不要使用超过25通道的细胞。
3. pcDNA3.1/pcDNA3.1/GAA 质粒转染治疗 HEK293H
- 在转染前24小时, 用 PBS2 +、Mg2 +将 T75 细胞培养瓶中的 HEK293H 细胞洗涤一次。收获的细胞与0.05% 胰蛋白酶-EDTA 如上所述, 种子 1.5 x 105细胞在24井培养板的洞使用500µL DMEM 培养基补充 10% FBS 没有抗生素。
- 根据制造商手册执行转染协议。通常, 使用1µg 质粒 DNA 和2.5 µL 转染试剂的混合物在100µL 无血清 DMEM。在室温下孵育20分钟, 随后以 drop-wise 的方式添加到细胞中。
- 在37° c/5% CO2的4小时后, 取出含有转染试剂的培养基, 并加入 500 FBS/10% µL 的新鲜 DMEM。
注: 在此步骤中, 可将 1-Deoxygalactonojirimycin 盐酸盐 (DGJ) 或 1-素盐酸盐 (DNJ) 添加到培养基中 (使用10毫米的水溶液, 以获得20µM DGJ 和 DNJ 的最终浓度。).新的 DGJ 或 DNJ 在质粒转染后增加42小时。
4. 细胞收获和α-乳糖 A 或酸α-酶活动测量
- 细胞收获
- 在收割的当天, 从孵化箱中取出细胞, 并吸入培养基。使用带有 Ca2 +和 Mg2 +的 PBS 仔细清洗单元格2次。
注意: 这一步是至关重要的, 因为 DGJ 和 DNJ 分别是α-乳糖和α-酶的强力抑制剂, 任何残留物都将使测试无效。 - 在细胞顶部直接添加200µL 的去离子水。从盘子里冲洗细胞, 然后将它们转移到1.5 毫升的反应管。
- 在收割的当天, 从孵化箱中取出细胞, 并吸入培养基。使用带有 Ca2 +和 Mg2 +的 PBS 仔细清洗单元格2次。
- 冻融均匀化
- 将样品放入适当的泡沫机架和涡流中5秒, 使裂解更加有效。在十年代和室温水浴中, 将样品交替放入液氮中, 直到解冻完成 (5 分钟)。
- 重复此步骤5次, 然后旋转样本5分钟, 在 1万 x g。
- 为每个样品准备一个新的管, 其中包含40µL 的去离子 H2O, 并添加10µL 的样品。混合溶液由涡流简要地和转移10µL 入一个96井板的洞 (每个样品三份)。在去离子 H2O 中稀释2毫克/毫升牛血清白蛋白 (bsa) 的储存液, 如下所示获取标准曲线:50 µL H2O/50 µL BSA;60µL H2O/40 µL BSA;70µL H2O/30 µL BSA;80µL H2O/20 µL BSA;90µL H2O/10 µL BSA;100µL H2O。
- 开始反应, 加入200µL 的综合分析试剂 (试剂 a 和试剂 B 混合在一个50:1 的比率) 和孵化1小时在黑暗中, 在37° c 下轻微搅拌在一个轨道振动筛 (300 rpm)。在平板阅读器中测量 560 nm 的吸光度。
注: 样品通常包含每µL 1 至1.5 µg 蛋白。
- 稀释每个样品的计算量和吸管到新鲜的1.5 毫升反应管获得 0.05 (α-乳糖 A) 或 0.5 (对于酸性α-酶) µg 蛋白/µL 溶液。漩涡样品为 5 s 再和吸管10µL 这稀释入96井板 (每个样品在一重复)。
- 开始反应, 加入20µL 各自的基板解决方案:
α-乳糖甲: 2 毫米 4-甲基-α-d-乳糖 (4-亩-加仑) 在0.06 米磷酸盐柠檬酸盐缓冲, pH 4.7。
酸性α-酶: 2 毫米 4-甲基α-d-喃 (4-亩-谷氨酸) 在0.025 米醋酸钠, pH 4.0。 - 在37° c 下, 在轨道振动筛 (300 rpm) 的轻微搅动下, 在黑暗中孵育 1 h 的酶反应。终止反应由增加200µL 1.0 M, pH 10.5 被调整的甘氨酸-氢氧化钠缓冲。
- 从0.01 毫克/毫升的库存中制备 4-伞形 (4-亩) 的标准曲线, 如下所示:
100µL H2O/4-亩;80µL H2O/20 µL 4-亩;60µL H2O/40 µL 4-亩;40µL H2O/60 µL 4-亩;20µL H2O/80 µL 4-亩;没有 H2O/100 µL 4-亩, 吸管10µL 每稀释入96井板 (在重复) 和增加200米甘氨酸氢氧化钠缓冲液每井为了调整容量和 pH 值。 - 在装有适当过滤器设置的荧光阅读器中测量酶活性, 并使用合适的软件对荧光读写器进行数据分析。
注: 在接触α-乳糖 A 或酸性α-酶的过程中, 两个4杯基片的衬底都减少到4μ。释放4亩是一个荧光, 可以分别测量为360和 465 nm 的激发和发射波长, 使用微荧光阅读器。
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Representative Results
诱变过程
为了评估玻璃化基因突变的效率, 突变被归类为以下类别之一. 这种产生突变的方法显示, 在第一次尝试中, 大约有66.5% 的玻璃化突变得到了. 另有25% 可在稍加修饰的第二 PCR 后获得。
1类: 突变 PCR 在第一次尝试中是有效的。
类别 2 : 第一诱变 PCR 失败 ( 没有殖民地在板材 , 没有入的变异 ) ;重复使用相同的底漆设置, 增加退火温度高达68° c 是有效的。
类别 3: 必须进行更多的努力才能产生所需的克隆 (例如, 通常设计了一个或多个新的底漆集)。
α-乳糖 A 和酸α-酶酶活性测定
在存在或缺席的情况下, 记录了不同突变酶的酶活性。表 1是指3α-乳糖 A 和3酸α-酶突变的结果。数据显示为 (1) 基板翻转的绝对值 (nmol 4-亩 * 毫克蛋白-1* h-1) 和作为 (2) 相对值归一化为野生型酶。这两种表达式都是有用的, 因为总的底物周转率说明了反应的效率和系统的灵敏度, 而归一化的值可以为突变的恶性肿瘤的可能性提供重要的提示和另一方面应用的个人计算机治疗的效率。在实验阶段, 设置了图 1中描述的工作流, 该流程使用该化合物计划了 60 h 潜伏期 (由于技术原因,如在引入的条件下快速 HEK293H 细胞生长)。尽管已经指出, 10 µM 是 DGJ14的近似最大可达到的等离子体浓度, 但当前的协议使用20µM 作为一个合理的浓度, 以便对 PC 响应进行筛选, 并得到了许多早期工作4,20,21,22,23。此外, 据推测, 较高的等离子体水平可以达到24。
图 1:的工作流体外酶活性测定。(A)实验的时间轴显示了一个90小时的细胞培养工作, 在指定的时间点需要相对较少的 hands-on-time。(B)包含 pcDNA3.1 和 GAA的野生类型 cd 的具有代表性的质粒载体。玻璃化和 GAA狂放类型质粒和质粒包括各自插入的兴趣的变异被使用了瞬时染 HEK293H 细胞镀在24井格式。经过一段时间, 使细胞合成各自的基因产品, 并允许酶处理, 溶体体运输, 和 PC 的行动, 细胞裂解和测量在一个荧光板阅读器和分析使用各自的软件。C: HEK293H 细胞的细胞形态学和生长状态在整个实验过程中都有显示。缩放栏 = 100 µm请单击此处查看此图的较大版本.
| 体外酶活性 | |||||
| gla | 机 | 20µM DGJ | |||
| 突变 (AA) | nmol 4 杯-加仑/毫克/小时 (平均) | % 平均值 (±SD, N) | nmol 4 杯-加仑/毫克/小时 (平均) | % 平均值 (±SD, N) | 意义 |
| p. A143T | 2384。7 | 29.2 (±2.6, 5) | 4223。0 | 52.0 (±4.4, 5) | *** |
| p. A156V | 379。2 | 4.3 (± 8, 5) | 1437。5 | 16.3 (±1.3, 5) | **** |
| p. R301Q | 777。4 | 8.8 (±1.1, 5) | 3002。6 | 44.2 (±3.6, 5) | **** |
| gaa | 机 | 20µM DNJ | |||
| 突变 (AA) | nmol 4 杯-谷氨酸/毫克/小时 (平均) | % 平均值 (±SD, N) | nmol 4 杯-谷氨酸/毫克/小时 (平均) | % 平均值 (±SD, N) | 意义 |
| p. Y455F | 41。1 | 5.4 (± 4, 5) | 246。6 | 31.4 (±2.8, 5) | *** |
| p. P545L | 65。7 | 6.6 (± 4, 5) | 166。5 | 16.7 (±1.5, 5) | ** |
| p. L552P | 0。0 | 0.0 (± 2, 5) | 104。3 | 10.4 (±1.4, 5) | *** |
表 1: α-乳糖 A 和酸性α-酶的酶活性.该表显示了有代表性的结果3α-乳糖和3酸α-酶突变体与和没有 pc DGJ 或 DNJ。对 HEK293H 细胞内源酶活性进行了绝对酶活性数据的校正。为了评价内源酶活性, 细胞转染 pcDNA3.1 空向量。该值分别为α-乳糖 A 和 41.6 nmol 4-慕 * 毫克蛋白-1* h-1为酸性α-酶的 97.5 nmol 4 μ * 镁蛋白-1* h-1 ;从相应的实验中将酶活性值归一化为野生型酶, 解释了不同突变体间的相对值的偏差。在5独立细胞培养实验 (N = 5) 之后, 每一个在技术重复执行, 标准偏差不允许是和 #62; 15% 的平均值。用比值 T 检验法计算了未经处理的与 PC 治疗的酶的差异。
* p & #60; 0.05、** 和 #60; 0.01、*** 和 #60; 0.005、*** 和 #60; 0.001
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Discussion
本文所述的协议为遗传性溶酶体代谢疾病的酵素损伤评估提供了健壮的结果。本手稿是对先前发布的15协议的修正。最关键的修改涉及严格 (即, 在突变体的载体构造准备过程中), 细胞培养协议 (即, HEK293H 细胞维护和转染条件) 的标准化, 以及高实验重复次数 (至少 5), 对结果的重现性有很高的贡献。总之, 两个目标基因都很容易获得诱变和多样性的突变可以并行组装。考虑到在 HEK293H 细胞内内源酶活性是一个微不足道的 1/50 (α-乳糖 a) 和 1/20 (酸α-酶) gif1 野生型基因, 达到了一个相对较高的信噪比。因此, 野生型和突变酶之间有很好的分辨力。应注意的是, 在两种酶 (分别为0.5 和5µg) 的活性测定中, 都采用了不同数量的总蛋白, 因为酸性α-酶活性比α-乳糖 a 的数量级低。
如上所述, 化验参数往往是有争议的, 因为许多实验室已经开发了自己的化验, 以调查溶酶体糖苷。该系统可以不同的细胞类型, 质粒-载体设计, 培养条件, 和期间的药物接触只是命名的众多参数。最近发表的法布里病 meta 分析表明, 转染细胞模型 (如、HEK293、COS-7) 的酶活性记录 (有无 PC) 主要与从患者获得的细胞中得到的结果一致 (主要是淋巴细胞或成纤维细胞) 关于这个问题, 突变是否响应 PC24。早先的报告直接比较患者来源细胞和转染模型表明, 表达系统反映的情况下患者细胞不妥协的结论13,14。因此, 可以得出结论, 无论特定的协议, 不同的作者所获得的结果没有被不同的蜂窝系统所改变, 即使响应者的定义可能是发散的。反应突变的当前定义是20% 相对酵素活动增量和5% 绝对酵素活动增量比狂放的类型酵素在孵育以后与20µM DGJ 为 60 h。一个全面的数据库, FabryCEP, 允许比较不同的实验方法获得的数百个α-乳糖突变体25。
这些标准是否足以预测 DGJ 和 DNJ 的临床益处尚不清楚, 因为预防症状性疾病所需的活动水平是有争议的。前一项研究表明, 10 到15% 的剩余活动可能足以使系统正常工作26。然而, 在最近发表的一份关于 DGJ 的2期临床研究报告中, 当基线活动少于正常的27的1% 时, 1% 的活动增加被认为对患者有潜在的益处。最近的临床结果表明, 患者预测响应 pc 由应答者≥20% 相对增加和≥3% 绝对增加野生型α-乳糖的活动在 HEK293H 细胞孵化后与10µM DGJ 实际衍生临床好处以疾病稳定或甚而改善由肾脏和心脏参量28。尽管 DGJ 已经被 FDA 和欧洲委员会批准为法氏病的单一疗法, 但 DNJ 和在庞倍庞贝病的衍生物 n-丁基 DNJ 的过程似乎是不同的。monotherapeutical 方法与 DNJ 已被终止在第二阶段临床试验, 由于严重不良事件的一些患者29。然而, PC 治疗与批准的专家组的结合显示显着改善的结果与疾病基质 (糖原) 减少相比, 单药组的单一的30。
我们建议, 所提出的方法可以扩展到其他 LSDs 和其他个人电脑, 如戈谢, Krabbe, 泰萨克斯/山德霍夫, 和 GM1 gangliosidosis, 但这可能不会在具体情况下, 例如, 系统的信号/噪声比的不足。应注意选择合适的细胞破坏方法来制备一个细胞裂解酶活性测定, 因为添加洗涤剂到裂解缓冲可能是指示膜结合酶, 如 glucocerebrosidase 在戈谢病, 而类似数量的洗涤剂可能会损害其他酶。对于α-乳糖, 应避免 sonication-based 细胞分裂的方法。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
作者想感谢曼迪 Loebert 和蒂娜 Czajka 的优秀技术支持。我们感谢弗洛拉罗 (哈佛医学院, 波士顿, 马萨诸塞州, 美国) 的语言编辑帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
| Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
| Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
| Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
| Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
| Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
| disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
| Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
| HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
| Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
| Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
| SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
| PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
| 4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
| Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
| 3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
| GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
| Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
| Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
| water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
| Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
| Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
| Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
| CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
| Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
| BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.a. = not applicable |
References
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