Er is een vraag om preklinische testen voor een nieuwe klasse van “Wees” drugs genoemd farmacologische chaperones reproduceerbaar, snel en efficiënt. Voor patiënten die in aanmerking komen, alsmede nieuwe farmacologische chaperone drugs ontwikkelden we een eenvoudige, sterk gestandaardiseerde en veelzijdig cel cultuur gebaseerde bepaling naar het scherm.
Het gebruik van gepersonaliseerde geneeskunde voor de behandeling van zeldzame monogeen ziekten zoals lysosomale opslag aandoeningen (LSDs) wordt uitgedaagd door de complexe klinische proef ontwerpen, hoge kosten en lage aantallen van de patiënt. Honderden mutant allelen zijn betrokken in de meeste van de LSDs. De ziekten zijn meestal ingedeeld in 2 tot 3 verschillende klinische typen volgens Ernst. Moleculaire karakterisering van het genotype kan bovendien helpen klinische resultaten voorspellen en informeren van de patiëntenzorg. Daarom ontwikkelden we een eenvoudige cel cultuur assay op basis van HEK293H-cellen geïnfecteerd uiten over de mutaties in de ziekte van Fabry en Pompe geïdentificeerd. Een soortgelijke bepaling is onlangs geïntroduceerd als een preklinische testen te identificeren vatbaar mutaties voor farmacologische Chaperone therapie (PCT’s) in de ziekte van Fabry. Dit manuscript beschrijft een gewijzigde cel cultuur assay wat mogelijk maakt snelle fenotypische beoordelingvan allèlique varianten in Fabry en Pompe ziekte vast te stellen die in aanmerking komen patiënten voor PCT en kan steun bij de ontwikkeling van nieuwe pharmacochaperones.
Er zijn meer dan een dozijn lysosomale opslag aandoeningen (LSDs) gerelateerd aan glycosidase dysfunctie als gevolg van de primaire genmutaties. In Fabry (OMIM #301500) en de ziekte van Pompe (OMIM #232300), meer dan 500 en 200 missense mutaties1,2,3 zijn gemeld, respectievelijk, hetgeen overeenkomt met ongeveer 60% van de totale mutatie graaf. Worden nog talloze nieuwe varianten van de gen geïdentificeerd, waarvan vele hebben onbekende betekenis. Uitgebreide biochemische studies is gebleken dat bepaalde genotypes niet tot een volledige verlies-van-functie van het GLA -gen leiden (OMIM * 300644) in de ziekte van Fabry, veroorzaken maar het bijbehorende enzym te mislukken om te komen tot een thermodynamisch favoriete opvouwbare4 . Dit resulteert in ER retentie en voortijdige degradatie van het anders functionele enzym. Soortgelijke conclusies hebben getrokken in andere LSDs met inbegrip van Pompe ziekte5. Bovendien, moleculaire karakterisering van enzym varianten kan vergemakkelijken klinische interpretatie van de mutaties ten tijde van de diagnose6, suggereert dat LSD progressie een afzonderlijk proces op basis van de aard van de mutatie is. De traditionele indeling in meestal 2 tot 3 verschillende klinische typen moet dus opnieuw worden beoordeeld om te stroomlijnen klinische counseling en therapeutische besluiten.
Enzym Replacement Therapy (ERT) is beschikbaar voor beide ziekten. ERT, heeft echter beperkte werkzaamheid in de aangetaste weefsels/organen zoals de hersenen en de skeletspieren. Bovendien, ERT kan uitlokken een immunogene reactie dat gevaar vormt voor de therapeutische voordelen. Farmacologische Chaperones (PC’s) zijn een aantrekkelijke behandeling alternatief voor patiënten met zogenaamde responsieve mutaties. PC’s dienen als een moleculaire steiger voor juiste eiwitvouwing en stabilisatie waardoor op zijn beurt endoplasmatisch reticulum (ER) retentie en ER-geassocieerde afbraak van het enzym. Bovendien, PC’s kunnen oraal worden toegediend en kunnen potentieel te steken van de bloed-hersenbarrière. PCT kan dus een meer haalbare optie is voor de behandeling van patiënten met bepaalde genotypes. Voor een uitgebreide review over de PC-toepassing in de LSDs, verwijzen naar de uitstekende beoordeling door Parenti7.
De ontdekking van honderden ziekte veroorzaakt mutant allelen daagt preklinische drug testen en een eenvoudige, snelle en zeer gestandaardiseerde evaluatie van vatbaar patiënten voor een aanpak van gepersonaliseerde geneeskunde noodzakelijk. Teneinde de schadelijke gevolgen van LSD genmutaties en testen van kandidaat-mutaties te voorspellen vatbaar patiënten voor PCT, was een zeer gestandaardiseerde overmaat expressie systeem in de HEK293H cellen die voor snelle en betrouwbare enzym activiteitsmeting zorgt ontwikkeld. Soortgelijke overmatige expressiesystemen eerder zijn beschreven voor Fabry en Pompe ziekte met COS-78,9,10,11, HeLa cellen12, of HEK29313 ,14,15,16 cellen voor het gen glycosidase.
Zelfs een zeer vergelijkbare methode is gepatenteerd als een “methode om te voorspellen response to Chaperone farmacologische behandeling van ziekten”17 dat de relevantie van een cel aangeeft cultuur systeem dat kan worden geïntegreerd in de klinische praktijk.
Het protocol hierin beschreven levert robuuste resultaten voor de raming van de schade van de enzym in erfelijke Lysosomale ziekten van het metabolisme. Dit manuscript is dat een wijziging van het protocol gepubliceerd eerdere15. De meest cruciale wijzigingen betrekken striktheid (dat wil zeggen, in het proces van voorbereiding van mutant vector construct), standaardisatie van de cel-cultuur-protocol (dat wil zeggen, HEK293H cel onderhoud en transfectie voorwaarden) en de hoge aa…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs wil erkennen van Mandy Loebert en Tina Czajka voor uitstekende technische ondersteuning. Wij danken Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) voor taal bewerken help.
Material | |||
QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
Abbreviations | |||
frw = forward; rev = reverse | |||
n.a. = not applicable |