Summary

Vitro Enzim ölçüm Test farmakolojik refakatçi yanıt Fabry ve Pompe hastalığı için

Published: December 20, 2017
doi:

Summary

Önceden klinik test için “yetim” ilaçların farmakolojik chaperones tekrarlanabilir, hızlı ve verimli olarak adlandırılan yeni bir sınıf yapmak için bir talep var. Biz uygun hastalar için hem de roman farmakolojik refakatçi uyuşturucu ekran basit, yüksek standart ve çok yönlü hücre kültür tabanlı tahlil geliştirilmiştir.

Abstract

Lizozomal depo bozuklukları (LSDs) gibi nadir monogenic hastalıkları tedavi etmek için kişiselleştirilmiş ilaç kullanımı karmaşık klinik deneme tasarımları, yüksek maliyetleri ve düşük hasta sayıları tarafından reddedilmiştir. Mutant gen yüzlerce LSDs çoğunda karıştığı. Hastalıklar genellikle 2-3 farklı klinik tipi önem göre sınıflandırılır. Ayrıca, genotip moleküler karakterizasyonu klinik sonuçlar tahmin ve hasta bakımı hakkında bilgi yardımcı olabilir. Bu nedenle, biz heterologously Fabry ve Pompe hastalığı tespit mutasyonlar aşırı ifade HEK293H hücreleri temel alan bir basit hücre kültür tahlil geliştirilmiştir. Benzer bir tahlil son zamanlarda mükellef mutasyonların farmakolojik refakatçi terapi (PCT) Fabry hastalığı tanımlamak için preklinik bir test olarak girmiştir. Bu el yazması hızlı fenotipik değerlendirme Fabry ve Pompe hastalığında uygun hastalar için PCT tanımlamak için allelic versiyonlarının ve roman pharmacochaperones gelişmesinde yardımcı olabilir bu bir değişik hücre kültür tahlil açıklar.

Introduction

Orada glycosidase disfonksiyon birincil gen mutasyonlar sonucu ile ilgili bir düzine Lizozomal depo bozuklukları (LSDs) üzerinde. Fabry (OMIM #301500) ve Pompe (OMIM #232300) hastalığı, fazla 500 ve 200 missense1,2,3 bildirilmiştir, mutasyonlar sırasıyla hangi toplam mutasyon sayısı yaklaşık % 60 karşılık gelir. Çok sayıda yeni gen değişik hala tespit edilmektedir, birçoğu bilinmeyen var önemi. Geniş biyokimyasal araştırmalar ortaya bazı genotip bir tam kaybı-in-işleve GLA gen yol değil (OMIM * 300644) Fabry hastalığı, ama neden thermodynamically tercih katlama devlet4 ulaşmak başarısız olmasına karşılık gelen enzim . Bu ER saklama ve aksi takdirde fonksiyonel enzim erken bozulma ile sonuçlanır. Benzer sonuçlar Pompe hastalığı5de dahil olmak üzere diğer LSDs çizilmiştir. Ayrıca, enzim değişik moleküler karakterizasyonu mutasyonlar klinik yorumlanması tanı6LSD ilerleme mutasyon niteliğine göre bireysel bir süreç olduğunu düşündüren, zamanında kolaylaştırabilir. Bu nedenle, genellikle 2-3 farklı klinik tipi içine Geleneksel sınıflandırma klinik danışmanlık ve tedavi edici kararlar verimlilik düzeyini artırmak amacıyla yeniden değerlendirmeye.

Enzim replasman tedavisi (ERT) her iki hastalık için kullanılabilir. ERT, ancak, etkilenen doku/organ beyin ve kas iskelet gibi etkinlik sınırlıdır. Ayrıca, ERT terapötik yararları tehlikeye atıyor immünojenik bir yanıt temin. Farmakolojik Chaperones (adet) sözde duyarlı mutasyonlar olan hastalar için bir çekici tedavi alternatiftir. Adet doğru protein katlanması ve endoplazmik retikulum (ER) tutma ve ER ilişkili bozulması enzim sırayla önleyen stabilization için moleküler bir iskele olarak hizmet vermektedir. Ayrıca, adet sözlü olarak yönetilebilen ve potansiyel olarak kan beyin bariyerini çapraz edebiliyoruz. Bu nedenle, PCT belirli genotip olan hastalar tedavi için daha uygun bir seçenek olabilir. LSDs uygulamada PC üzerinde kapsamlı bir inceleme için mükemmel inceleme Parenti7tarafından bakın.

Mutant gen neden olan hastalık yüzlerce keşfi önceden klinik uyuşturucu testi zorlukları ve mükellef hastalar kişiselleştirilmiş tıp yaklaşım için bir basit, hızlı ve yüksek standart değerlendirme gerektirir. LSD gen mutasyonlarının zararlı etkilerini değerlendirmek amacıyla ve mükellef hastalar için PCT tahmin etmek için aday mutasyon test etmek için hızlı ve güvenilir enzim aktivitesi ölçümü için sağlayan bir yüksek standart aşırı ifade sistem HEK293H hücrelerdeki oldu geliştirdi. Benzer aşırı ifade sistemleri daha önce tarif edilmiş COS-78,9,10,11, HeLa hücreleri12veya HEK293 kullanarak Fabry ve Pompe hastalığı için13 ,14,15,16 hücreleri glycosidase gen için.

Çok benzer bir yöntem bile hastalıkların farmakolojik refakatçi tedaviye yanıt tahmin etmek için bir “yöntemi” olarak patentli bir hücre uygunluğunu gösteren17 kültür sistemi klinik uygulamaya entegre yeteneğine sahip.

Protocol

1. hazırlık Mutant pcDNA3.1/GLA ve pcDNA3.1/GAA yapıları Not: GLA ve dizileri (CD) kodlama GAA klonlama stratejileri bildirilen önceki15,18olmuştur. Site yönettiği Mutagenesis kullanarak site Yönetmen: Mutagenesis Kullanım başvuru NM_000169.2 ve NM_000152.4 GLA ile GAA gen, mutagenesis için şablonlar olarak sırasıyla diziler. İlgili sıra deği…

Representative Results

Mutagenesis yordamıMutasyonlar GLA gen mutagenesis etkinliğini değerlendirmek için aşağıdaki kategorilerden birine sınıflandırıldı. Mutasyonlar oluşturmak için bu yaklaşım ortaya koydu bu ilk denemede GLA mutasyonların yaklaşık % 66.5 elde edilmiştir. Daha fazla sonra biraz değiştirilmiş bir ikinci PCR elde. Kategori 1: Mutagenesis PCR ilk denemesinde etkili oldu….

Discussion

Burada açıklanan protokol metabolizma kalıtsal lizozomal hastalıklar enzim hasar değerlendirmesi için sağlam sonuçlar sunar. Bu el yazması bir değişiklik Protokolü önceki15Yayınlanan olduğunu. (Yani, mutant vektör yapı hazırlık sürecinde), sıkılık en önemli değişiklikler içeren hücre kültür Protokolü (örneğin, HEK293H hücre bakım ve transfection koşulları) ve yüksek standardizasyonu (en az 5), son derece sonuçları tekrarlanabilirlik için k…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Mandy Loebert ve Tina Czajka için mükemmel teknik destek kabul etmek istiyorum. Flora Luo (Harvard Tıp Okulu, Boston, MA, ABD) dil düzenleme yardım için teşekkür ederiz.

Materials

Material
QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit  Stratagene, La Jolla, CA, USA #200522
Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
Tryptone Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8952.1
Yeast Extract Merck, Darmstadt, Germany 103,753
Sodium chloride Merck, Darmstadt, Germany 1,064,041,000
Potasium chloride Merck, Darmstadt, Germany 1,049,360,500
MgCl2 x 6H2O Merck, Darmstadt, Germany 1,058,330,250
D (+)-Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 1,083,422,500
Sodium Hydroxide Merck, Darmstadt, Germany 1,064,980,500
Glycine Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3908.2
Citric acid Carl Roth, Karlsruhe, Germany X863.3
disodium hydrogen phosphate Merck, Darmstadt, Germany 1,065,860,500
Sodium acetate Merck, Darmstadt, Germany 1,062,640,050
Glacial acetic acid Sigma Aldrich, Munich, Germany A6283
LB Agar Carl Roth, Karlsruhe, Germany X969.2
LB Medium Carl Roth, Karlsruhe, Germany X968.2
Zyppy Plasmid Miniprep Kit ZymoResearch, Freiburg, Germany D4020
QIAfilter Plasmid Midi Kit Qiagen, Hilden, Germany 12245
HEK293H cell line Invitrogen, Karlsruhe, Germany 11631-017 
Dulbecco´s Modified Eagle Medium  Invitrogen, Karlsruhe, Germany 31966-047
HyClone fetal bovine serum  GE Healthcare, South Logan, Utah, USA SV30160.03
Penicillin/streptomycin Invitrogen, Karlsruhe, Germany 15140-122
CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One VWR International GmbH, Hannover, Germany 82050-854
Cell culture plates (24 well) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 831,836
Cellstar 96 well plate Greiner bio one, Frickenhausen, Germany 655185
SafeSeal reaction tubes, 1,5mL  Sarstedt, Nümbrecht, Germany 72,706
Lipofectamine 2000 Invitrogen, Karlsruhe, Germany 11668-019
1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride  Sigma Aldrich, Munich, Germany D9641
1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride  Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada D236500
1-Deoxynojirimycin  Sigma Aldrich, Munich, Germany D9305
PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium Biochrom, Berlin, Germany L 1825
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Scientific, Braunschweig, Germany 25300054
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific, Braunschweig, Germany 23225
4-Methylumbelliferone Sigma Aldrich, Munich, Germany M1381
4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside Sigma Aldrich, Munich, Germany M7633
4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside Sigma Aldrich, Munich, Germany M9766
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
incubator type T6 Heraeus Instruments, Hanau, Germany n.a.
Luminous Plate Gr. 2 E Carl Roth, Karlsruhe, Germany P265.1
3130 xl Genetic Analyzer  Applied Biosystems, Darmstadt, Germany n.a.
GFL-3032 bacterial shaker GFL, Burgwedel, Germany  n.a.
Avanti J-25 centrifuge Beckman/Coulter, Krefeld, Germany n.a.
Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom n.a.
water-jacket incubator  Binder, Tuttlingen, Germany n.a.
Vortex Genie 1 touch mixer Scientific Industries, Bohemia, NY, USA n.a.
Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge Hermle, Tuttlingen, Germany  n.a.
LaboStar ultrapure water device Siemens, Berlin, Germany n.a.
Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker Biosan, Riga, Latvia n.a.
Tecan GENios Reader Tecan, Männedorf, Switzerland n.a.
HI 223 Microprocessor pH Meter HANNA Instruments, Arvore, Portugal n.a.
CASY
Cell Counter + Analyser System
Model TT
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland
Name Company Catalog Number Comments
Software
Magellan data analysis software v6.6 Tecan, Männedorf, Switzerland n.a.
GraphPad Prism 5.04 GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA n.a.
Microsoft Office 2010 Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA n.a.
BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html n.a.
Abbreviations
frw = forward; rev = reverse
n.a. = not applicable

References

  1. Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
  2. Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase&#34. J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
  3. Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
  4. Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
  5. Yasuda, M. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).
  6. Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone. Hum Mutat. 29, 331 (2008).
  7. Andreotti, G., et al. Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet J Rare Dis. 6, 66 (2011).
  8. Khanna, R. The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease. PLoS One. 9, e102092 (2014).
  9. Siekierska, A. α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants. J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).
  10. Parenti, G. Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease. Mol Ther. 15, 508-514 (2007).
  11. Wu, X. A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease. Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).
  12. Lukas, J. Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease. PLoS Genet. 9, e1003632 (2013).
  13. Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).
  14. . Available from: https://www.google.ch/patents/US9095584 (2017)
  15. Lukas, J., et al. Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease. Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).
  16. Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).
  17. Shin, S. H., et al. Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease. Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).
  18. Shin, S. H., et al. Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone. Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).
  19. Filoni, C., et al. Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).
  20. Citro, V. The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations. Int J Mol Sci. 17, (2016).
  21. Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones. Orphanet J Rare Dis. 8, 111 (2013).
  22. Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet. 88, 513-523 (1992).
  23. Germain, D. P. Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies. Orphanet J Rare Dis. 7, 91 (2012).
  24. Hughes, D. A., et al. Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study. J Med Genet. 54, 288-296 (2017).
  25. Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders. Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).
  26. Parenti, G., et al. A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy. Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).

Play Video

Cite This Article
Lukas, J., Knospe, A., Seemann, S., Citro, V., Cubellis, M. V., Rolfs, A. In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease. J. Vis. Exp. (130), e56550, doi:10.3791/56550 (2017).

View Video