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Neuroscience

Eine In Vivo Duo-Farbe-Methode für Imaging-vaskuläre Dynamik nach Contusive Spinal Cord Injury

Published: December 31, 2017 doi: 10.3791/56565
Automatic Translation
1,2, 3, 1,4, 1, 3, 3,5, 1, 1
1Spinal Cord and Brain Injury Research Group, Stark Neurosciences Research Institute, and Department of Neurological Surgery, Indiana University School of Medicine, 2Program in Medical Neuroscience, Stark Neurosciences Research Institute, Indiana University School of Medicine, 3Norton Neuroscience Institute, Norton Healthcare, 4Department of Human Anatomy & Histoembryology, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, 5Department of Neurological Surgery, University of Louisville School of Medicine

Summary

Wir stellen eine in-Vivo imaging-Verfahren unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen, um dynamische Wirbelsäule Gefäßveränderungen nach contusive Rückenmarksverletzungen bei Erwachsenen Sprague-Dawley Ratten zu verfolgen.

Abstract

Verletzungen des Rückenmarks (SCI) verursacht erhebliche vaskuläre Störungen auf dem Gelände der Verletzung. Vaskuläre Pathologie tritt unmittelbar nach dem SCI und setzt sich während der Phase der akuten Verletzung. In der Tat erscheinen Endothelzellen, die erste zu sterben nach einer contusive Sci. Die frühen vaskuläre Ereignisse, einschließlich erhöhten Durchlässigkeit der Blut-Rückenmark-Schranke (BSCB), induzieren Vasogenic Ödem und dazu beitragen, schädliche sekundäre Verletzungen Ereignisse durch komplexe Verletzungen Mechanismen verursacht. Ausrichtung auf die vaskuläre Störung könnte daher eine Schlüsselstrategie, sekundäre Verletzungen Kaskaden zu reduzieren, die dazu, histologische und funktionelle Beeinträchtigungen nach Sci beitragen. Frühere Studien wurden meist an Post-mortem Proben durchgeführt und waren nicht in der Lage, die dynamischen Veränderungen des vaskulären Netzwerks zu erfassen. In dieser Studie entwickelten wir ein in Vivo Duo-Farbe zwei-Photon bildgebendes Verfahren zur Überwachung der akuten dynamische Gefäßveränderungen nach contusive Sci. Dieser Ansatz ermöglicht die Erkennung von Blutfluss, Schiffs Durchmesser und anderen vaskulären Erkrankungen an verschiedenen Standorten der gleichen Ratte vor und nach der Verletzung. Insgesamt stellt diese Methode einen ausgezeichneten Ort für die Untersuchung von vaskulären Dynamik.

Introduction

Traumatischer Querschnittlähmung (SCI) ist eine häufige Verletzung führt zu einer Beeinträchtigung der motorischen, sensorischen und autonome Funktion. Nach der nationalen Rückenmark Verletzungen statistischer Center (NSCISC) im Jahr 2016, ca. 282.000 Personen betroffen waren, während 69 % von ihnen vor allem aufgrund von Verkehrsunfällen waren oder1fällt. Diese Patienten benötigen häufig Intensive Pflege; keine wirksame Behandlung ist jedoch derzeit verfügbar. Neue Strategien in Richtung SCI sind daher dringend erforderlich.

SCI ist hauptsächlich in zwei Phasen unterteilt: Verletzungen primäre und sekundäre Verletzungen. Die primäre Schädigung umfasst die körperliche Beleidigung verursacht hämorrhagische Nekrose am Ort der Wirkung2, gefolgt von einer Reihe von sekundären Verletzungen Veranstaltungen wie Entzündung, Apoptose der Zelle und Demyelinisierung der verbleibenden Axone, die schrittweise führen für den Ausbau der morphologischen und funktionellen Defizite3,4,5,6. Blutung ist das ersten sichtbaren Zeichen der Verletzung, zeigt eine sofortige vaskuläre Störungen in der akuten Phase der SCI7,8. Eine neuroprotektive Strategie zur Verringerung der frühen vaskulären Schäden könnten Patienten Erholung verbessern, aber dies erfordert ein besseres Verständnis der pathophysiologischen Mechanismus der frühen posttraumatischen vaskuläre Ereignisse.

Trotz der früheren Studien mit verschiedenen Methoden, um Rückenmark Gefäßsystem zu studieren bleiben erhebliche Einschränkungen. Die meisten gemeinsame Nachteil studiert nur Post-mortem Muster, z. B. Wasserstoff Abstand9, Autoradiographie10, Microangiogram8, vaskuläre Korrosion wirft11und Immunohistochemistry12 ,13. Obwohl Laser Doppler Flowmetry nicht-invasive Echtzeit-Überwachung von Rückenmark Blut fließen14 bietet, ist es nicht in der Lage zu differenzieren zwischen Gefäßsysteme und morphologische Gefäßveränderungen zu erkennen. Dynamische Kontrast-verstärkte MRI (DCE-MRT) ist auch nicht-invasive, aber es erzeugt Bilder mit niedriger Auflösung und erfordert eine teure Infrastruktur15.

Obwohl in Vivo imaging mit 2-Photonen-laser-scanning-Mikroskopie (2P-LSM) entwickelt wurde, für das Studium der Vasodynamics in der Hirnrinde16,17,18, eine begrenzte Anzahl von Studien haben nachgewiesene Gefäßveränderungen nach einem Sci Tang Et Al. haben Änderungen Blutflusses am Rand der Läsion Website in einer Hemisektion Modell19, sondern Bildgebung angezeigt, nachdem eine contusive Verletzung ist schwieriger, aus zwei Gründen. Erstens würde eine herkömmliche optische Glasfenster über Verletzung Aufstellungsort nicht unterstützen die mechanische Wirkung und bleiben funktionsfähig für die Bildgebung. Zweitens, das Austreten von Tracer in das Parenchym wegen Blutung schafft Schwierigkeiten mit posttraumatischen Bildgebung.

Hier präsentieren wir ein neuartige Duo-Farbe bildgebende Verfahren, wodurch imaging der gleichen einzelner Schiffe zu Zeitpunkten vor und nach der Verletzung. Darüber hinaus bietet es eine zeitlich-räumlichen Profil der vaskulären dynamischen Veränderungen, die nach einem contusive Sci. Es hat auch das Potenzial für die Bildgebung zu mehreren Zeitpunkten nach der Verletzung. Dieses Protokoll kann transgene Tiere, neurovaskuläre Interaktion zu studieren direkt zugewiesen werden.

Protocol

Alle chirurgischen und Tier Handhabung wurden durchgeführt, als unter der Führung für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Research Council) und die Leitlinien der Indiana Universität Schule von Medizin institutionelle Animal Care und Nutzung genehmigt Ausschuss.

(1) chirurgische Vorbereitung

  1. Sterilisieren Sie alle chirurgische Instrumente einschließlich des Wirbelsäule-Stabilisators. Reinigen Sie den OP-Tisch und der näheren Umgebung mit 70 % Ethanol. Legen Sie für die Vorbereitung des chirurgischen Eingriffs nicht überleben eine saubere OP Pad auf der Oberseite eine 37 ° C Heizkissen.
  2. Verwenden Sie sechs Wochen alten Sprague-Dawley (SD) Ratte für diese Studie. Wiegen und die Ratte mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (87,7 mg/kg) und Xylazin (12,3 mg/kg) Gemisch zu betäuben. Bestätigen Sie richtige Stadium der Narkose, wenn das Tier nicht mehr auf einen Zeh Prise Reiz reagieren. Subkutan injizieren 0,01-0,05 mg/kg Buprenorphin und 5mg/kg Carprofen vor der Operation.
  3. Rasieren Sie die Ratte in 2 Bereiche: die Halswirbelsäule-Region auf dem Rücken und Hals-Bereich auf der Brustseite. Wischen Sie die Hautareale mit Betadine chirurgische Peeling und wischt sich 70 % Alkohol. Gelten Sie Augensalbe um trockenen Auges während der Operation zu verhindern. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf dem sauberen OP Pad.

2. externe Halsschlagader Katheterisierung

  1. Suchen Sie die äußere Halsschlagader von der Suche nach dem Puls-Punkt in der Nähe des Schlüsselbeins, und schneiden Sie mit einer kleinen Feder Schere, einen vertikalen Schnitt vor Ort zu machen, die Kreuz-Punkt 3 anatomische Punkte: kaudalen Ramus des rechten Unterkiefer, größere Tuberkel von Humerus und Manubrium (Abbildung 1A). Isolieren Sie das Schiff mit Feder Schere und feine Pinzette. Binden Sie das distale Ende mit 1 steriles chirurgisches Nahtmaterial Linie (Abbildung 1)20.
  2. Bereiten Sie eine 1-mL-Spritze mit Kochsalzlösung gefüllt und mit einem speziellen Katheter hergestellt aus einem 21-Gauge-Nadel (Abbildung 1 b) angeschlossen. Machen Sie einen kleinen Schnitt mit einem Mikro Schere auf dem Schiff zu und schieben Sie den Katheter in das Gefäß.
    1. Sichern Sie die Nadel durch das Binden der proximalen und distalen Ende (Abbildung 1). Der spezielle Katheter besteht aus einem 21-Gauge-Nadel. Die flache Spitze Schleifen und Schweißen mit einem 2 mm Stück Spitze abgeschnitten von anderen 21-Gauge-Nadel. Dadurch kann verhindert werden, dass den Katheter außerhalb rutschen.
      Hinweis: Eine kleine Menge Blut fließt in die Nadel zeigt, dass die Nadel ein Blutgefäß erfolgreich abgeschlossen hat.

(3) Wirbelsäule Stabilisierung und C5-C7 Laminektomie

  1. Legen Sie das Tier in Bauchlage. Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie mit einer Skalpellklinge Nr. 15 auf gewünschte spinaler Ebene. Sezieren Sie die Muskelschichten aus der 5th , 7th Halswirbel (C5-C7) bilateral, die seitlichen Facetten (Abbildung 2A)21verfügbar zu machen.
    Hinweis: Suchen Sie den zweiten Brustwirbel (T2) von der Suche nach der Spitze zwischen die Schulterblätter. Zählen Sie nach oben aus dem T2-Wirbel C7 Wirbel21,22,23,24zu finden.
  2. Stabilisierung der Wirbelsäule der Ratte mit einem modifizierten stabilisierende Apparat. Machen Sie einen Schlitz auf beiden Seiten des lateralen Wirbelkörper Knochens. Schieben Sie die Edelstahl-Arme unter den exponierten Querfortsatz Facetten und ziehen Sie die Schrauben um Stabilität (Abb. 2 b) zu sichern.
  3. Entfernen Sie vorsichtig die C5-C7-Schichten (Laminektomie, Abbildung 2).
  4. Legen Sie ein kleines Stück von Kochsalzlösung getränkten Gelfoam auf exponierten Dura Mater mit Feuchtigkeit versorgt (Abb. 2D) zu halten.

4. Installation der zwei-Photonen (2P) Bildgebung Fenster

  1. Sachen kleine Stücke von Gelfoam in den Spalt zwischen Muskeln und Knochen Wirbelkörper, auch eine dünne Linie von Gelfoam zwischen Rückenmark und Wirbelsäule Knochen stopfen, dann Gewebe Klebstoff Leim verwenden, um die Muskel-Knochen-Umgebung zu versiegeln. Warten Sie 5 Minuten für vollständige Trockenheit (Abb. 2E).
    Hinweis: Dieser Schritt verhindert wirksam die zukünftige Blutungen in die Fenster und die Undichtigkeit der Immersion Lösungen.
  2. 4 % Agar mit DdH2O in der Mikrowelle zubereiten. Nachdem der Agar vollständig aufgelöst ist, warten Sie, bis es auf eine berührbare Temperatur abgekühlt. Füllen Sie eine 1-mL sterile Spritze mit Agar Lösung und auf den Rand des Fensters, eine Mauer (Abbildung 2E) Rohr. Die Lösung erstarrt schnell und bleibt flexibel, das Objektiv oder Ziel frei bewegen können.
  3. Wenn Sie bereit sind für die Bildgebung, entfernen Sie die Gelfoam und Ort eintauchen Flüssigkeit innerhalb des Fensters für 2P imaging (Abb. 2F). Das stabilisierte Tier innerhalb der dunklen Kammer 2-Photonen-Mikroskop und 2P bildgebenden Fenster direkt unter dem Objektiv. Senken Sie die Linse sorgfältig in der bildgebenden Fenster.

5. Injektion des ersten Fluoreszenzfarbstoff und Baseline-Imaging

  1. 0,5 mL Rhodamin B erfolgt-Dextran vorbereiten (4 mg/mL mittleres Molekulargewicht ~ 70kDa) in Kochsalzlösung. Füllen Sie eine 1-mL sterile Spritze mit der Lösung und verbinden Sie die Spritze mit der zuvor installierten Katheter.
    Hinweis: Vorbereitung der Fluoreszenzfarbstoff-Lösung vor Gebrauch empfohlen.
  2. Den erste Farbstoff durch Niederdrücken der Spritze sehr langsam injizieren (Abb. 3 b). Verwenden Sie zuerst das Okular, um den gewünschten Bereich zu identifizieren. Verwenden Sie eine kostenlos gekoppelten Gerät (CCD) Kamera ein Hellfeld Bild der Oberfläche Blutgefäß Muster bei niedriger Vergrößerung als Wahrzeichen Bild zu erwerben. Zur Laser-Scan-Modus wechseln Sie und dann öffnen Sie die imaging-Software für beide Sammelbilder 2P und Line-Scan Daten.
  3. Wählen Sie die richtige 2P Erregung Laserwellenlänge, macht und fluoreszierende Kanal (rot für erste Farbstoff), mit der Fluorophore verwendet im abgebildeten Gewebe übereinstimmen, und führen Sie dann in Vivo Bildgebung (Abbildung 3E). Halten Sie das Tier auf ein Heizkissen während des gesamten Prozesses.

(6) C7 Contusive Verletzungen mit LISA Gerät

  1. Führen Sie ein C7 Mittellinie Quetschgefahr mit einem Louisville Verletzungen System Apparat (LISA) Gerät nach einem vorher festgelegten Protokoll25,26.
    1. Kurz gesagt, legen Sie das Tier auf die LISA-Bühne nach Kalibrierung.
Nach dem Auswählen einer Nullpunkt-Einstellung und Anpassung der Gewebe Verschiebung (0,800 mm in diesem Fall), klicken Sie auf "Run-Experiment" der Software auslösen der Impaktor-Veröffentlichung und die Verletzung zu schaffen.
  • Legen Sie nach der Verletzung ein weiteres kleines Stück Kochsalzlösung getränkten Gelfoam auf exponierten Dura Mater mit Feuchtigkeit zu halten.
  • Wiederholen Sie Schritt 4.3 und führen Sie erneut in-Vivo Bildgebung auf der gleichen Fläche mit den zuvor eingefügten roten Farbstoff sichtbar (Abbildung 3 & F).
  • Übertragen Sie das Tier zurück auf den OP-Tisch und halten Sie das Tier mit entsprechenden Narkose nach der IACUC-IUSM-Protokolls sediert.

    • (7) Injektion von zweiten Fluoreszenzfarbstoff und posttraumatischen Imaging

    1. 0,5 mL Fluorescein erfolgt-Dextran (4 mg/mL, mittleres Molekulargewicht ~ 70 kDa) in Kochsalzlösung vorbereiten wie in 5.1. Füllen Sie die Lösung in einer 1-mL sterile Spritze und verbinden mit dem zuvor installierten Katheter.
    2. Übertragen die stabilisierte Tiere Rückseite innen 2P Mikroskop dunkle Kammer und wieder den gleichen Bildbereich mit den Rot-Kanal für die erste Färbung und der grüne Kanal für den zweiten Farbstoff (3D Figuren & G).
    3. Am Ende der Bildgebung die Ratte aus dem spinalen Stabilisierung Gerät lösen und Reinigen der Agar-Wand.

    (8) Tieropfer

    1. Nach dem Imaging, Opfern Sie die Ratte nach Transcardial Perfusion Protokoll27. Die Rückenmark Proben sammeln und befestigen Sie sie in 4 % PFA.

    (9) offline-Daten-Analyse: Quantifizierung des Schiffs Durchmesser

    1. Übertragen Sie die Bilddateien an einer Arbeitsstation für Offline-Analyse.
    2. Öffnen Sie ImageJ zu und wählen Sie "Datei" und dann wählen Sie zuvor gespeicherten Rohdaten und öffnen Sie die zugehörigen einzelne Bilddatei (Abbildung 4 b).
    3. Kalibrieren Sie das Bild durch die Auswahl "Analyze" gefolgt von "Set Scale" (Abbildung 4). Der Wert in "Abstand in Pixel" wird anhand der Gleichung dargestellt in Abbildung 4A. Die Kalibrierung der optischen Linse 2-Photonen bestimmt den Standardwert in der Gleichung. Der Wert von "OpticalZoom" findet sich in Excel Extensible Markup Sprachdatei (XML-Datei) der Bild-Datei (Abbildung 4 b) zugeordnet.
    4. Zeichnen Sie eine Linie senkrecht zur Längsachse des Schiffes (Abbildung 41 & E1) und wählen Sie "Analyze" gefolgt von "Maßnahme". Die Messung des Schiffs Durchmesser wird im Ergebnisfenster angezeigt (Abbildung 42 & E2). Wiederholen Sie 3-Mal über das Schiff, den durchschnittlichen Wert zu erwerben.

    10. Offline Datenanalyse: Quantifizierung der roten Blutkörperchen cell (RBC) Geschwindigkeit

    1. Übertragen Sie die Line-Scan-Dateien auf der Arbeitsstation für die Analyse.
    2. Starten Sie die ImageJ-Software und wählen Sie "Datei" wählen Sie zuvor gespeicherten Rohdaten und öffnen Sie alle damit verbundenen Line-Scan-Dateien mit der Erweiterung namens ".ome" zu.
    3. Öffnen Sie "Bild" und wählen Sie "Stapel" gefolgt von "Bilder stapeln". Konvertieren Sie alle OME-Dateien in eine einzelne Bilddatei Stack TIFF.
    4. Starten Sie Matlab Software und klicken Sie auf "Öffnen", wählen Sie "LSPIV_parallel.m"-Code-Datei. Hinweis: Matlab-Code für LS-PIV abrufbar bei https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18
    5. Wählen Sie folgende Aufträge: "Run" > "Ordner wechseln" > "Arterie". Wählen Sie die Stapel TIFF-Bilddatei in 10.3erzeugt.
    6. Geben Sie "Y" und drücken Sie die Eingabetaste.
    7. Einen Cursor jeweils auf der linken und rechten Seite des Bildes zu platzieren, und das Programm startet, die Daten zu verarbeiten.
    8. Am Ende des Programms, geben Sie 2 Werte zur Berechnung der endgültigen lesen: "Pixel_meter-Conversion-Wert", und "Scan-Zeit Conversion-Wert". Beide finden Sie in der XML-Datei mit Line-Scan-Daten verknüpft. Der endgültige Wert ist als der Mittelwert und die Standardabweichung der Geschwindigkeit in den Maßeinheiten von Millimeter pro Sekunde (mm/s) ausgedrückt.

    Representative Results

    Die Methode ist in der Lage, in Vivo dynamische Wirbelsäule Gefäßveränderungen in den einzelnen Behältern überwachen Pre- und Post-traumatische Sci. Zunächst wird ein Katheter über die externe Halsschlagader Zugang für nachfolgende Fluoreszenzfarbstoff Injektionen (Abb. 1A-C, Abbildung 3) installiert. Im zweiten Schritt wird eine spezielle Vorrichtung verwendet, um die exponierten C5-C7 (Abbildung 1-F, Abb. 2A-B) zu stabilisieren. Diese Stabilisierung Schritt kann beseitigen Atmung Artefakte und stetigen Bildgebung. Nach Laminektomie (Abbildung 2) ist der nächste Schritt die Installation von 2P imaging Fenster über C5-C7 (Abb. 2D-F). Minimierung der peripheren Gewebe um das spinale Bildgebung Fenster Blutungen ist entscheidend für erfolgreiche vaskuläre Bildgebung. Der folgende Schritt ist, fluoreszierenden Farbstoff Rhodamin-Dextran (rot) über die oben genannten Katheter, Wahrzeichen und Karte der vaskulären Netzwerk als Grundlinie (Abbildung 3A-B, E) zu injizieren. Nach C7 Mittellinie contusive Verletzung mit mittelschwer, FITC-Dextran (grün) wird eingeführt, zu gewünschten Zeitpunkten nach der Verletzung (Abbildung 3A & D). Die Schönheit der Duo-Farbe-Methode ist, dass man noch erkennen kann, die vaskuläre Struktur mit der zweiten Farbstoff, wenn der erste Farbstoff ins Parenchym verletzungsbedingt (Abbildung 3) bereits durchgesickert hat.

    Während der Bildgebung Sitzung empfiehlt es sich, das Tier auf ein Heizkissen zu Kern Körpertemperatur nach Induktion der Anästhesie zu halten.

    Mit unserem Duo-Farbe-Methode kann die Durchmesser und roten Blutkörperchen Geschwindigkeit (RBC Velocity) der einzelnen Schiffe gemessen und berechnet werden. Für Durchmesser können eine ImageJ verwenden, um das Schiff bei seiner größten Durchmesser für 3 Wiederholungen nach der Kalibrierung (Abbildung 4) zu messen. Für Geschwindigkeit sind Line-Scan-Bilder mit Matlab-Programm (MATLAB R2013a) zur Berechnung der RBC Geschwindigkeit (Abbildung 5)18gemessen. Basierend auf der Morphologie, Blut Strömungsgeschwindigkeit und Schiffs Durchmesser, die Gefäße können in 2 Kategorien eingeteilt werden: Arterie und Vene (siehe Tabelle1).

    Figure 1
    Abbildung 1 . Halsschlagader Katheterisierung und Wirbelsäule Stabilisierung.
    (A)     eine schematische Zeichnung zur Ortung der äußeren Halsschlagader. (B) der spezialisierten Katheter aus einem 21-Gauge-Nadel gemacht. Die Spitze war flach und mit einem Stück 2 mm Spitze abgeschnitten von anderen 21-Gauge-Nadel geschweißt. (C) eine schematische Darstellung der Katheterisierung. Erstens ist das distale Ende ligiert gefolgt von proximalen Katheter-Stabilisierung, endend mit der Befestigung der Nadelöhrs zusammen mit dem Schiff (Schiff Ligation, blaue Pfeilspitzen). (D) ein Bild von der veränderten Wirbelsäule Stabilisator. Eine C5-C7 vor Laminektomie (E) und nach Laminektomie und contusive SCI (F) wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 2
    Abbildung 2 . Schematische Darstellung der optischen Fenster Installation Schritt für Schritt.
    (A)     Schritt 1: setzen Sie den Wirbel durch Schneiden Haut und Muskel entlang der Mittellinie. (B) Schritt2: Stabilisierung der Wirbelsäule. (C) Schritt 3: Laminektomie. (D) Schritt 4: die Feuchtigkeit des Rückenmarks zu erhalten, indem ein Stück von Kochsalzlösung getränkten Gelfoam. (E) Schritt 5: die Lücken mit sterilen Gelfoam und Vetbond zu versiegeln. Nach dem Trocknen ist eine Schicht von Agar Wand am Rande des Fensters gebaut. (F) Schritt 6: Wenn Sie bereit sind für die Bildgebung, die Gelfoam und Ort eintauchen Flüssigkeit innen 2P imaging-Fenster zu entfernen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 3
    Abbildung 3 . Die in Vivo Duo-Farbe Methode Verfahren schrittweise.
    Die ganze Prozedur besteht aus 5 Schritten (A). Nach Schritt 1 und Schritt2, ein paar von Dextran Tracer mit einer Größe von ca. 70 KDa sind in der Folge zu beschriften Sie das Rückenmark Gefäßsystem vor () injiziert,B und C) und nach contusive SCI (D). (E)-(G) repräsentative 2P Bildanzeige das Rückenmark Gefäßsystem bei Schritt 3 bis Schritt 5. Weiße Pfeile zeigen auf der ersten Runde rote Farbstoff undichte Flächen (F und G), türkise Pfeilspitzen zeigen zweit-wellenartig bewegen grünen Farbstoff Leckage (G). Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 4
    Abbildung 4 . Erfassung und Quantifizierung der spinalen Schiffs Durchmesser.
    Nach Vorbereitung sind einzelne Bilddateien unter 2 P-Mikroskopie, zusammen mit XML-Dateien der kalibrierten Werte (B)erworben. (A) die Gleichung zeigt die Berechnung der "Pixel pro Mikron" basierend auf optischen Zoom-Werte. Nach der Kalibrierung in ImageJ (C)Schiffs Durchmesser sind gemessen an 3 Punkten in der Längsachse vor (D1( ) und nach (E1( ) Verletzungen. (D2( ) und (E2( ) zeigen die gemessenen Werte. (F) Quantifizierung des Schiffs Durchmesser bei Baseline und 30 min nach der Verletzung. Maßstabsleiste = 50 µm. Daten werden angezeigt, wie ± SD bedeuten *** p < 0,0001, zweiseitigen gepaarten t-Test.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.

    Figure 5
    Abbildung 5 . Erfassung und Quantifizierung der spinalen Schiff Geschwindigkeit.
    Line-Scan Image-Dateien sind unter 2 P-Mikroskopie zur einzigen Behälter Geschwindigkeiten berechnen erworben. (A) ein Beispiel für einen ausgewählten Schiff und Methode, um Blutgefäße RBC Geschwindigkeit zu beurteilen. (B) beispielhaft arteriellen Linie-Bild und entsprechenden Plot-Datei für die Berechnung der Geschwindigkeit, als auch ein Beispiel für eine Vene (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Arterie Vene
    Morphologie Gerade, glatte, Dicke Gefäßwand Zweige, Ecken und Kanten
    Blut-Strömungsgeschwindigkeit Schnell Langsam aber variiert
    Durchmesser 30-80 µm 100-250 µm

    Tabelle 1: Kriterien für die Ermittlung der Schiffstypen

    Discussion

    Eine Herausforderung für vaskuläre Studien nach SCI ist die technische Einschränkung, weil traditionelle Techniken weitgehend auf vaskuläre Strukturänderungen in Post-mortem Proben beschränkt sind. Dieses neuartige in Vivo imaging oben beschriebene Methode ermöglicht dynamische Messung von Blutfluss und die zugehörigen Parameter (Geschwindigkeit und Schiffs Durchmesser) mit 2 P-LSM in live Ratten. Es kann auch wiederholte Prüfung in den gleichen Sets von Schiffen zu verschiedenen Zeitpunkten nach contusive Sci. Vorherigen 2-Photonen-Mikroskopie bildgebende Verfahren konnten posttraumatischen vaskuläre Strukturen durch das Auslaufen von einem einzigen Tracer zu erfassen. Unser Duo-Color-Design ermöglicht dynamische vaskuläre Bildgebung für traumatische Modelle. Darüber hinaus bietet die Flexibilität dieser Methode die Möglichkeit, eine zeitlich-räumlichen Profil der akuten vaskulären Veränderungen nach Sci generieren

    In unserem in Vivo Duo-Farbe bildgebende Verfahren gibt es mehrere wichtige Schritte. Erstens ist es grundlegend, die physikalische Stabilität des Rückenmarks vor Zeitraffer Bildgebung, insbesondere Verringerung der Atmung Bewegung Artefakt zu gewährleisten. Wir entwarfen die Form der Wirbelsäule Klammern die Höhe der Wirbelsäule Wirbel während Stabilisierung leicht anheben. So kann die Bewegung des Rückenmarks korrelieren die Atmung Tier sein stark reduziert (Abbildung 1-F, 2 b). Es empfiehlt sich, die Stabilität des Rückenmarks vor Beginn jeder bildgebenden Sitzung zu überprüfen. Wenn das Rückenmark nicht Stabilität zu erreichen, sollte die Ausrichtung und Dichtigkeit des Rückenmarks Klemmen berichtigt werden. Zweite, periphere Gewebe (Knochen, Muskulatur und Haut) Blutungen in der bildgebenden Fenster Kontamination der Ansicht riskieren konnte. Für eine reibungslose bildgebenden Sitzung sollte Gelfoam und Gewebe Klebstoff Leim auf das umliegende Gewebe für eine effektive Prävention angewendet werden. Drittens haben Fluoreszenzfarbstoffen wählen wir eine ähnliche Größe wie Albumin (66 kDa), die die wichtigsten hochmolekularen Blutplasma Protein ist. Homöostatische Bedingungen wurden die Farbstoffe im Innern des Behälters ähnlich wie Albumin28weitgehend beibehalten. Nach der Verletzung die Farbstoffe durch die gestörten Endothelfunktion Struktur übergeben und in das Parenchym, verursacht eine deutliche erhöhte fluoreszente Intensität im peripheren Bereich des Gefäßsystems (Abbildung 3F-g) ausgelaufen. Darüber hinaus gibt es zwei Gründe, warum wir äußere Halsschlagader Katheterisierung. Geben Sie zuerst es konsequent zugängliche Route der Lieferung zu jeder Zeit des Experiments. Zweitens kann es als eine Route für die zukünftige Behandlung Injektion verwendet werden.

    Obwohl unsere in-Vivo -Duo-Farbe-Methode einen neuartigen Treffpunkt für traumatische vaskulären bildgebenden bieten kann, müssen einige Vorsichtsmaßnahmen bezüglich dieser Technik angesprochen werden. Derzeit, diese Technik soll Gefäßveränderungen zu 2 Zeitpunkten (Grundlinie und 1 nach der Verletzung Zeitpunkt), aber es ist möglich, zu mehreren Zeitpunkten wechseln, wenn zusätzliche Fluoreszenzfarbstoffen und Kanäle zur Verfügung stehen. Zwar gibt es mehrere Studien mit implantierten Glasfenster für chronische intravitalen Bildgebung, kann keiner von ihnen Basisinformationen auf dem gleichen Schiff nach traumatischen Verletzungen19,29,30bieten, 31,32. Im Gegensatz zu diesen Studien ist unser Fenster ein keine-Glasfenster. Dies ist praktisch für Pre- und Post-Verletzung Bildgebung, aber es kann eine Herausforderung für die Wiederherstellung des Fensters zur Dauerbeobachtung sein. Unsere zukünftige Forschung arbeitet an der technischen Verbesserung für chronische Belichtung. Das Kreislaufsystem besteht aus verschiedenen Schiffstypen (Arterie, Vene und Kapillare) und jeder ist anders in Aspekte der Morphologie und Funktion. Differenzierung zwischen Schiffstypen während der Bildgebung könnte dazu beitragen, ein klares Muster der vaskulären Veränderungen herauskitzeln. Das obige Protokoll hängt davon ab, auf den Betrachter, die Identifizierung der Schiffe, die anhand der Morphologie und Geschwindigkeit; Allerdings kann eine Arterie-spezifischen Farbstoff einfach hinzugefügt werden, eine genauere Klassifizierung zwischen Schiff Arten33geben.

    Diese Technik ist nicht nur beschränkt auf Bewertungen auf contusive und anderen traumatischen Modelle wie Quetschverletzung und Strahlung Verletzungen, aber auch auf Studien mit Schwerpunkt auf Störungen des BSCB, sowie vaskulären Permeabilität ändert. Neben SCI es ließe sich die vaskulären Veränderungen nach anderen neurodegenerativen Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und Multiple Sklerose (MS) zu studieren. Darüber hinaus könnte es übertragbar auf einem transgenen Tiermodell, die dynamische neurovaskuläre Interaktion zu studieren. Als leistungsfähiges Screening-Instrument könnten zukünftige Studien der bildgebende Verfahren zur Beurteilung der Wirksamkeit der Behandlung von Verletzungen des Rückenmarks hier beschriebenen nutzen.

    Abschließend dient in Vivo Duo-Farbe-Methode zuverlässig, in Echtzeit und in Vivo Ansatz für die Bewertung von dynamischen Gefäßveränderungen, ist ideal für die Charakterisierung der zeitlich-räumlichen vaskulären Profil und screening für Behandlungen reduzieren Sie Folgeschäden nach Sci.

    Disclosures

    Die Autoren haben nichts preisgeben.

    Acknowledgments

    Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt von NIH NS059622, Merit Review Award I01 BX002356 vom US-Department of Veterans Affairs, Craig H Neilsen Stiftung 296749, Indiana Rückenmark und Gehirn Verletzungen Research Foundation (NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562 ISCBIRF) der Indiana State Department of Health (019919) und Mari Hulman George Stiftungsfonds.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Purdue Products Betadine Surgical Scrub Fisher Scientific 19-027132 Skin sterilization
    Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) Patterson Veterinary  07-881-9413, 07-890-5745 Anesthetic agent
    Buprenorphine(0.03 mg/mL)  Patterson Veterinary  07-891-9756 Pain relief agent
    Carprofen Patterson Veterinary 07-844-7425 Non-steroidal anti-inflammatory drug
    Dukal Gauze Sponges  Fisher Scientific 22-415-490 Skin sterilization
    Decon Ethanol 200 Proof Fisher Scientific 04-355-450 Skin sterilization
    Artificial Tears Eye Ointment Webster Veterinary 07-870-5261  Prevent drying eyes 
    Cotton Tipped Applicators Fisher Scientific  1006015
    Rhodamine B isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich R9379 Average mol wt 70kDa
    Fluorescein isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich 46945 Average mol wt 70kDa
    Instrument Sterilizer Fine Science Tools 18000-50 for sterilizing surgery tool
    Spine stabilizer set Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute Contact Y. Ping Zhang for details.
    (yipingzhang50@gmail.com)
    Vetbond 3M Animal Care Products 1469SB Tissue adhesive Glue
    Gelfoam Henry Schein 9083300 Stop bleeding
    Noyes Spring Scissors F.S.T 15013-12
    Fine Forceps- Dumont #5 F.S.T 11254-20
    Rongeur Fine Science Tools 16021-14 laminectomy
    Surgical Retractor Fine Science Tools 17005-04
    Scalpel Fine Science Tools 10003-12  skin cut
    Scalpel Blade #15 Royal-Tek BS2982 skin cut
    micro angled scissors World Precision Instruments 500260 Can be from any vendor
    3-0 vicryl sutures Ethicon J393H Can be from any vendor
    Silk Black Braided Non-Absorbable Suture, 3-0, C-7, Reverse Cutting, 18" LOOK 786 Can be from any vendor
    1 ml syringe Henke Sass Wolf 4010.200.V0 Can be from any vendor
    21 gauge needle BD 305165 Can be from any vendor
    Agar Sigma-Aldrich A1296 Can be from any vendor
    Two-photon Laser Scanning Microscope Bruker Fluorescence Microscopy
    LISA device Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute Contact Y. Ping Zhang for details.
    (yipingzhang50@gmail.com)
    Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
    HCImage Live Hamamatsu Corporation Imaging software
    PrairieView Prairie Technologies/Bruker Two-photon imaging software
    ImageJ Image analysis software
    Matlab statistics toolbox The MathWorks, Inc. https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle Image analysis software

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Chen, C., Zhang, Y. P., Sun, Y., Xiong, W., Shields, L. B. E., Shields, C. B., Jin, X., Xu, X. M. An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (130), e56565, doi:10.3791/56565 (2017).

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