Summary
אנחנו מציגים של ויוו הדמיה השיטה באמצעות שני צבעי פלורסנט שונים כדי לעקוב אחר שינויים דינמיים בעמוד השדרה כלי הדם בעקבות פגיעה בחוט השדרה contusive בחולדות ספראג-Dawley למבוגרים.
Abstract
פגיעה בחוט השדרה (SCI) גורם הפרעה וסקולרית משמעותי באתר של פציעה. פתולוגיה וסקולרית יתרחש מיד אחרי SCI וממשיך לאורך כל השלב פגיעה חריפה. למעשה, תאי אנדותל להיראות הראשון למות לאחר הפוליטיקה contusive האירועים כלי דם מוקדם, כולל חדירות מוגברת של המכשול דם-עמוד השדרה (BSCB), זירוז vasogenic בצקת ולתרום פוגעת פגיעה משנית אירועים הנגרם על ידי מנגנוני פגיעה מורכבים. פילוח של הפרעה וסקולרית, לכן, יכול להיות אסטרטגיה המפתח לצמצום פגיעה משנית cascades שתורמים ליקויי היסטולוגית ופונקציונליים לאחר לביוטכנולוגיה מחקרים קודמים שבוצעו בעיקר על דגימות לאחר המוות, הצליחו ללכוד את השינויים הדינמיים של רשת כלי הדם. במחקר זה, פיתחנו ויוו דואו-צבע שני הפוטונים הדמיה שיטה כדי לעקוב אחר השינויים דינמי כלי דם אקוטי בעקבות לביוטכנולוגיה contusive גישה זו מאפשרת זיהוי זרימת הדם קוטר הכלי, אחרים כלי הדם פתולוגיות באתרים שונים של העכברוש אותו מראש, לאחר פציעה. בסך הכל, שיטה זו מספקת מקום מצוין עבור חוקרים dynamics כלי הדם.
Introduction
פגיעה בחוט השדרה טראומטי (SCI) היא פגיעה נפוצה המוביל ליקוי של הפונקציה מוטורית, חושית, אוטונומיות. על פי נבחרת חוט השדרה פציעה סטטיסטי מרכז (NSCISC) 2016, כ 282,000 אנשים נפגעו בזמן 69% מהם היו בעיקר עקב תאונות או נופל1. חולים אלו דורשים טיפול נמרץ; עם זאת, אין טיפול יעיל זמין כעת. לכן, אסטרטגיות אפקטיביות חדשות לקראת SCI נחוצים בדחיפות.
SCI בעיקר מחולק לשני שלבים: ראשי פגיעה ופציעה משנית. הפגיעה העיקרית כוללת את העלבון הפיזי הגורם לנמק hemorrhagic באתר של ההשפעה2, ואחריו סדרה של אירועים פציעות משניות, כגון דלקת, אפופטוזיס תא demyelination של אקסונים הנותרים, שיובילו בהדרגה אל ההרחבה של גירעונות פונקציונלי מורפולוגיים3,4,5,6. דימום הוא סימן נראה לעין הראשונה של פגיעה, המציין של הפרעה וסקולרית מיידית בשלב אקוטי של SCI7,8. אסטרטגיה neuroprotective שמטרתו להפחית את הנזק לכלי הדם מוקדם יכול לשפר את ההתאוששות של חולים, אבל זה דורש הבנה טובה יותר של מנגנון pathophysiological האירועים כלי הדם לאחר פציעה מוקדמת.
למרות שמחקרים קודמים בשיטות שונות כדי ללמוד להערכת חוט השדרה, נותרו מגבלות משמעותיות. החיסרון הכי המשותף הוא לומד רק לאחר המוות דגימות, למשל, מימן סיווג9, autoradiography10, microangiogram8, קורוזיה וסקולרית הטלות11ו אימונוהיסטוכימיה12 ,13. למרות Flowmetry דופלר לייזר מספקת ניטור בזמן אמת לא פולשנית של זרימת הדם חוט השדרה14, הוא מסוגל להבדיל בין מערכות כלי הדם ולגלות שינויים מורפולוגיים כלי הדם. MRI משופרת ניגודיות דינמי (DCE-MRI) היא גם לא פולשנית, אבל זה יוצר תמונות ברזולוציה נמוכה ודורש של תשתית יקר15.
למרות ויוו הדמיה באמצעות 2-פוטון לייזר מיקרוסקופ סריקה (2, P-LSM) פותחה ללמוד vasodynamics בקליפת17,16,, או18, יש מספר מצומצם של מחקרים שינויים בכלי הדם הפגינו בעקבות טאנג לביוטכנולוגיה ואח הראו שינויים בזרימת הדם בקצה האתר הנגע דגם hemisection19, אבל הדמיה לאחר פציעה contusive מאתגרת יותר משתי סיבות. ראשית, חלון זכוכית המסורתית אופטי מעל אתר הפגיעה לא לקיים את ההשפעה מכני, נותרים פונקציונליים עבור הדמיה. שנית, דליפת מעקב אל parenchyma עקב דימום יוצר קושי עם הדמיה לאחר פציעה.
כאן אנו מציגים שיטת הדמיה duo הרומן-צבע, המאפשרת הדמיה אותם כלי-דם בודדים בנקודות זמן מראש, לאחר פציעה. בנוסף, הוא מספק פרופיל זמני מרחבי של כלי הדם שינויים דינמיים בעקבות של הפוליטיקה contusive יש גם את הפוטנציאל עבור הדמיה בנקודות זמן שלאחר פציעות מרובות. פרוטוקול זה ניתן להחיל ישירות לבעלי מהונדס ללמוד נוירו-וסקולריים אינטראקציה.
Protocol
כל ההליכים טיפול כירורגי ובעלי חיים בוצעו כפי שאושר לפי המדריך את הטיפול, השימוש של חיות מעבדה (מועצת המחקר הלאומית), הקווים המנחים של אינדיאנה אוניברסיטת בית הספר של רפואה מוסדיים חיה טיפול והשתמש הוועדה.
1. הכנה כירורגית
- לעקר כל כלי ניתוח כולל מייצב את עמוד השדרה. לנקות את שולחן הניתוחים ואת כל האזור שמסביב עם 70% אתנול. הכנה של ההליך הכירורגי ההישרדות, במקום משטח נקי כירורגית בחלק העליון 37 ° C, כרית חימום.
- השימוש העכבר ספראג Dawley (SD) בשבוע 6 הישן במחקר זה. שוקל, עזים ומתנגד העכברוש עם זריקה בקרום הבטן של קטאמין (87.7 מ"ג/ק"ג), תערובת חריגות השירותים הווטרינריים (12.3 מ"ג/ק"ג). לאשר בשלב הנכון של הרדמה כאשר החיה מפסיקה להגיב לגירוי קמצוץ הבוהן. Subcutaneously להזריק 0.01-0.05 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין ו- 5 מ"ג/ק"ג של Carprofen לפני הניתוח.
- לגלח את החולדה באזורים 2: האזור בעמוד השדרה הצווארי על הגב ובאזור הצוואר בצד השד. לנקות את העור באזורים עם betadine בניתוחים כירורגיים ומנגב אלכוהול 70%. להחיל משחה העין כדי למנוע עין יבשה במהלך הניתוח. מקם את החיה במצב פרקדן על משטח נקי כירורגי.
2. חיצוני ומוחלף צנתור
- לאתר את עורק הצוואר על ידי מציאת נקודת הדופק ליד עצם הבריח, וחותכים בעזרת זוג מספריים מעיין קטן לעשות חתך אנכי על המקום, המהווה נקודת-הצלב של 3 נקודות אנטומיות: ramus סימטרית של הלסת התחתונה נכון, ממרחק של עצם הזרוע, המנובריום (איור 1 א'). לבודד את הספינה באמצעות מספריים האביב ומלקחיים בסדר. לקשור את הקצה הדיסטלי עם תפירה סטריליים 1 שורה (איור 1C)20.
- להכין מזרק 1-mL אחד מלא עם תמיסת מלח ומחובר עם קטטר מיוחד זני מחט 21-מד (איור 1B). עושים חתך קטן בעזרת זוג מספריים מיקרו על הספינה והחלק את הצנתר לתוך הכלי.
- אבטח את המחט על ידי קשירת שני לקרע, הסוף (איור 1C). הקטטר מיוחדים עשויה מחט 21-מד. לטחון את הטיפ שטוח, לרתך עם חתיכת עצה מנותקת עוד מחט בקוטר 21 מ מ 2. זה יכול למנוע את הצנתר מחליק החוצה.
הערה: כמות קטנה של דם זורם לתוך המחט מציין כי המחט נכנס כלי דם בהצלחה.
- אבטח את המחט על ידי קשירת שני לקרע, הסוף (איור 1C). הקטטר מיוחדים עשויה מחט 21-מד. לטחון את הטיפ שטוח, לרתך עם חתיכת עצה מנותקת עוד מחט בקוטר 21 מ מ 2. זה יכול למנוע את הצנתר מחליק החוצה.
3. עמוד השדרה וייצוב Laminectomy C5-C7
- מקם את החיה במצב של שכיבה. לחתוך את העור לאורך הקו האמצעי עם להב סכין מס 15 ברמות בעמוד השדרה הרצוי. לנתח את שכבות שריר מ 5ה 7th בחוליית (C5-C7) דו צדדיים לחשוף את היבטים לרוחב (איור 2 א)21.
הערה: אתר בית החזה החוליה השניה (T2) על ידי מציאת הדקר בין השכם. ספור כלפי מעלה מ החוליה T2 למצוא C7 חוליה21,22,23,24. - לייצב את עמוד השדרה של העכברוש באמצעות מנגנון ייצוב ששונה. לעשות חתך משני צידי העצם בחוליות לרוחב. שקופית הזרועות מפלדת מתחת הצדדים החשופים תהליך רוחבי, והדק את הברגים כדי לאבטח את יציבות (איור 2B).
- הסר בזהירות את C5-C7 שנבזזו (laminectomy, איור 2C).
- מניחים חתיכה קטנה של ספוג תמיסת מלח השאיבה על גבי קרום הדורה חשוף כדי לשמור על לחות (איור דו-ממדי).
4. התקנה של שני הפוטונים (2p) הדמיה חלון
- דברים חתיכות קטנות של השאיבה בפער שבין השרירים והעצמות בחוליות, גם דברים קו דק של השאיבה בין השדרה והעצמות בחוליות ולאחר מכן להשתמש בדבק דבק רקמות כדי לאטום את האזור שמסביב שריר-עצם. המתן 5 דקות על יובש מוחלט (2E איור).
הערה: שלב זה מונע ביעילות בעתיד חודרת החלון ואת leakiness של פתרונות טבילה. - להכין 4% אגר עם ddH2O במיקרוגל. לאחר אגר התפרקה לחלוטין, להמתין עד שזה יחזור לטמפרטורה שניתן לגעת בהם. ממלאים מזרק 1-mL סטרילי עם פתרון אגר, צינור זה אל הקצה של החלון לבנות קיר (איור 2E). הפתרון עפור במהירות, נשאר גמיש כדי לאפשר עדשה או המטרה לנוע בחופשיות.
- כאשר מוכן עבור הדמיה, להסיר את הנוזלים טבילה השאיבה ומקום בתוך החלון עבור P 2 הדמיה (2F איור). העברת החיה התייצב בתוך החדר האפל מיקרוסקופים פוטונים 2, למקם את החלון הדמיה של P 2 ישירות מתחת לעדשה. . תוריד את העדשה בזהירות לתוך חלון הדמיה.
5. הזרקה של הפלורסנט הראשון והדמיה בסיסית
- להכין 0.5 מ של Rhodamine B isothiocyanate-לתוספי (משקל מולקולרי ממוצע 4 מ"ג/מ"ל ~ 70kDa) בתוך תמיסת מלח. ממלאים מזרק 1-mL סטרילי עם הפתרון וחבר את המזרק הקטטר שהותקן בעבר.
הערה: הכנת הפתרון הפלורסנט לפני השימוש מומלץ. - להזריק את הצבע הראשון על ידי מדכא את המזרק לאט מאוד (איור 3B). תחילה, השתמש העיינית של המצלמה כדי לזהות את תחומי עניין. השתמש מצלמה בשילוב התקן (CCD) תשלום לרכישת תמונת שדה בהיר של הדפוסים כלי דם משטח בהגדלה נמוכה כתמונה ציון דרך. כדי לעבור למצב סריקה בלייזר לפתוח את 2, P הדמיה תוכנה לאיסוף גם תמונות וגם קו-סריקת נתונים.
- בחר את נכונה P 2 לייזר עירור אורך גל, כוח ובערוץ פלורסנט (אדום ערוץ לצבע הראשון) כדי להתאים fluorophores בשימוש הרקמה הדמיה, ולאחר מכן לבצע ויוו הדמיה (איור 3E). לשמור את החיה על כרית החימום במהלך כל התהליך.
6. C7 פציעה Contusive באמצעות המכשיר ליסה
- לבצע פגיעת החבורה קו האמצע C7 שימוש בהתקן המנגנון מערכת פגיעה לואיסוויל (ליסה) על פי פרוטוקול שנקבעו קודם25,26.
- בקיצור, במקום החיה על הבמה ליסה בעקבות כיול.
7. הזרקה של הפלורסנט השני והדמיה לאחר פציעה
- להכין 0.5 מ של Fluorescein isothiocyanate-לתוספי (4 מ"ג/מ"ל, משקל מולקולרי ממוצע ~ 70 kDa) בתוך תמיסת מלח אותו כמו 5.1. למלא את הפתרון ב מזרק עקר 1-mL והתחבר עם הצנתר שהותקן בעבר.
- להעביר האחורי חיות התייצב בתוך החדר האפל מיקרוסקופ P 2 ואת להתקין מחדש באותו האזור את הערוץ האדום עבור לצבוע הראשון וערוץ ירוק עבור לצבוע השני (דמויות תלת-ממד & G).
- בסוף הדמיה, לשחרר את החולדה מהמכשיר ייצוב עמוד השדרה ולנקות את הקיר אגר.
8. בעלי חיים
- לאחר דימות, להקריב את החולדה בעקבות פרוטוקול זלוף27transcardial. לאסוף דגימות חוט השדרה ולתקן אותם ב- 4% מחברים.
9. לא מקוונת לנתונים ניתוח: כימות של כלי השיט קטרים
- העבר את קובצי התמונה תחנת עבודה לניתוח במצב לא מקוון.
- פתח ImageJ בחר 'קובץ', בחרו שמרתם נתונים גולמיים ואז לפתוח את הקובץ המשויך תמונה בודדת (איור 4B).
- כיילו את התמונה על-ידי בחירת 'נתח' ואחריו "סולם להגדיר" (איור 4C). הערך ב "מרחק בפיקסלים" מחושבת באמצעות המשוואה המוצגת באיור 4A. הכיול של עדשה אופטית פוטון 2 קובע את ערך ברירת המחדל במשוואה. הערך של "opticalZoom" נמצא ב- Excel Extensible Markup Languagefile (קובץ. XML) המשויכת לקובץ תמונה בודדת (איור 4B).
- למתוח קו בניצב לציר הארוך של כלי השיט (4D איור1 & E1) ובחר 'נתח' ואחריו "מדידה". במדידת קוטר הכלי מוצג בחלון התוצאות (4D איור2 & E2). חזור על 3 פעמים ברחבי הספינה כדי להשיג את הערך הממוצע.
10. מנותק, ניתוח נתונים: תא כימות של הדם האדומות (RBC) מהירות
- להעביר את הקבצים קו-scan לתחנת העבודה לצורך ניתוח.
- להפעיל את התוכנה ImageJ בחר 'קובץ', בחרו שמרתם נתונים גולמיים ואז פתח את כל הקבצים המשויכים קו-scan עם סיומת השם ".ome".
- פתח "תמונה" ובחר "אוספים" ואחריו "תמונות לערום". להמיר קבצים הביתה כל קובץ TIFF מחסנית תמונה בודדת.
- הפעלת תוכנת Matlab, לחץ על 'פתח', בחר קובץ קוד "LSPIV_parallel.m". הערה: קוד Matlab LS-PIV ניתן להוריד בכתובת https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18
- בחר הצווים הבאים: "לרוץ" > "שינוי תיקיית" > "עורק". בחר קובץ TIFF מחסנית התמונה המופקים 10.3.
- הקלד "Y" והקש Enter.
- מקם את הסמן בצד ימין וגם בצד ימין של התמונה בהתאמה, ולאחר הפעלת התוכנית לעבד את הנתונים.
- בסוף התוכנית, הזן ערכים 2 כדי לחשב קרא הסופי: "ערך המרה של pixel_meter", "ערך סריקה-זמן ההמרה". שניהם ניתן למצוא בקובץ XML המשויכת נתוני קו-הסריקה. הערך הסופי מבוטאת את וסטיית של מהירות ביחידות של מילימטר בשניה (מ מ/s).
Representative Results
השיטה זו מסוגלת לנטר ויוו בעמוד השדרה וסקולרית שינויים דינמיים בכלי בודדים לביוטכנולוגיה קדם, פוסט-טראומטי ראשית, קטטר מותקן באמצעות ומוחלף על חיצוני כדי לספק גישה לזריקות הפלורסנט עוקבות (איור 1 א'-C, איור 3). בשלב השני, משמש מנגנון מיוחד לייצוב חשוף C5-C7 (איור 1D-F, איור 2A-B). שלב זה מייצב יכול לחסל את הנשימה חפצים ומספקים הדמיה יציב. בעקבות laminectomy (איור 2C), השלב הבא הוא ההתקנה של 2, P הדמיה החלון מעל C5-C7 (איור דו-ממדי-F). מזעור רקמות היקפיים דימום סביב החלון הדמיה בעמוד השדרה הוא קריטי עבור הדמיה וסקולרית מוצלחת. השלב הבא הוא להזריק את rhodamine-לתוספי הפלורסנט (אדום) דרך הקטטר הנ ל כדי ציון דרך ומפת הרשת וסקולרית כקו הבסיס (איור 3 א-B, E). לאחר C7 פגיעה contusive קו האמצע בחומרה בינונית, FITC-לתוספי (ירוק) הוא הציג בנקודות הזמן לאחר פציעה הרצויים (איור 3 א & D). היופי של השיטה דואו-צבע הוא שזה עדיין ניתן לזהות את המבנה כלי הדם באמצעות לצבוע השני כאשר הראשון לצבוע שהודלף כבר אל parenchyma בעקבות פציעה (איור 3G).
במהלך הפגישה הדמיה, מומלץ לשמור את החיה על כרית החימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף לאחר הרדמה אינדוקציה.
בשיטה שלנו דואו-צבע, קוטר, תאי הדם האדומים המהירות (מהירות RBC) של כלי שיט פרטניים ולהשוואה מחושב. עבור קוטר, אחד יכול להשתמש ImageJ כדי למדוד את הכלי על קוטרו הגדול ביותר עבור 3 חזרה לאחר כיול (איור 4). על מהירות, קו-לסרוק תמונות נמדדים באמצעות תוכנית Matlab (MATLAB R2013a) כדי לחשב את מהירות (איור 5) RBC18. בהתבסס על מורפולוגיה, מהירות זרימת הדם, קוטר כלי, כלי ניתן לסווג לשתי קטגוריות: עורק, וריד (ראה טבלה 1).
איור 1 . ומוחלף מייצב צנתור ועמוד השדרה.
(א) סכימטי ציור לאיתור עורק הצוואר. (B) הצנתר מיוחדים העשויים מחט 21-מד. העצה הייתה הקרקע מרותכת עם חתיכת עצה 2 מילימטר מנותקת עוד מחט בקוטר 21 ושטוח. (ג) תרשים כללי של צנתור. בקצה הדיסטלי מאתרים ראשון, ואחריו קטטר proximal ייצוב, המסתיימים והידק את המחט יחד עם הכלי (כלי מצדו, ראשי חץ כחול). (ד) תמונה של המיצב ששונה עמוד השדרה. יוצג חלון C5-C7 לפני laminectomy (E) ואחרי laminectomy מדע contusive (נ) . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . תרשים סכמטי של מיצב בחלון אופטיים צעד אחר צעד.
(א) שלב 1: לחשוף את החוליה על ידי חיתוך העור והשריר לאורך הקו האמצעי. (B) שלב 2: ייצוב עמוד השדרה. (ג) שלב 3: laminectomy. (ד) בשלב 4: לשמור על הלחות של חוט השדרה על ידי הצבת חתיכת ספוג תמיסת מלח השאיבה. (ה) בשלב 5: לסגור את הפערים עם השאיבה סטרילי, vetbond. לאחר הייבוש, שכבה של אגר קיר בנוי בקצה של החלון. (נ) לשלב 6: כאשר מוכן עבור הדמיה, להסיר את הנוזלים טבילה השאיבה ומקום בתוך 2, P הדמיה חלון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . ויוו duo-צבע שיטה הליך שלב אחר שלב.
כל הליך מורכב 5 צעדים (א). אחרי שלב 1 ואת שלב 2, זוג לתוספי המשדרים בגודל של 70 משוער KDa מופיעים מוזרק ברצף כדי לתייג את חוט השדרה להערכת לפני (B ו- C) ואחרי SCI contusive (D). (E)-(G) להחליפן בתמונות P 2 להציג את חוט השדרה להערכת בכל שלב 3-בשלב 5. החצים הלבנים הצבע על צבע אדום הראשון-גל דולף אזורים (F ו- G), ראשי חץ בצבע טורקיז להציג צבע ירוק הגל השני דליפה (G). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . רכישה, כימות של קטרים כלי בעמוד השדרה.
בעקבות הכנה, קבצי תמונה בודדת נרכשים תחת מיקרוסקופ P 2, יחד עם קבצי XML של ערכים מכויל (B). (א) המשוואה מציג את החישוב של "פיקסלים למיקרון" בהתבסס על ערכי זום אופטי. לאחר כיול ב- ImageJ (ג), כלי קטרים נמדדים ב- 3 נקודות על פני ציר האורך לפני (D1) ואחרי (E1) פציעה. (D2) , (E2) להציג את הערכים נמדד. כימות (F) של כלי השיט קטרים בסיסית ו 30 דקות לאחר פציעה. בקנה מידה בר = 50 מיקרומטר. נתונים מוצגות כפי מתכוון ± SD, * * * p < 0.0001, מבחן דו-זנבי t מזווג.אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . רכישה, כימות של מהירות כלי בעמוד השדרה.
קבצי תמונות קו-scan נרכשים תחת מיקרוסקופ P 2 לחישוב המהירויות לכלי. (א) דוגמה של הכלי הנבחר ואת השיטה כדי להעריך את מהירות כלי דם RBC. (B) דוגמה עורקי של קו-סריקת התמונה וקובץ עלילה המתאימה עבור חישוב של מהירות, כמו גם דוגמה של וריד (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| עורק | וריד | |
| מורפולוגיה | קיר הספינה ישר, חלק, סמיך | ענפים, קצוות |
| מהירות זרימת הדם | מהר | אבל איטי משתנה |
| קוטר | 30-80 מיקרומטר | 100-250 מיקרומטר |
טבלה 1: קריטריונים לזיהוי סוגי כלי השיט
Discussion
אתגר אחד ללימודי כלי הדם בעקבות SCI היא המגבלה הטכנית בטכניקות מסורתיות מוגבלים בעיקר שינויים במבנה כלי הדם בדגימות לאחר המוות. רומן זה ויוו הדמיה השיטה המתוארת לעיל מאפשר מדידה דינאמית של זרימת הדם ופרמטרים הקשורים (מהירות, כלי קוטר) באמצעות 2, P-LSM בחולדות בשידור חי. זה גם מאפשר בדיקה חוזרת ונשנית בערכות באותו כלי בנקודות זמן שונות בעקבות לביוטכנולוגיה contusive טכניקות הדמיה 2-פוטון מיקרוסקופ הקודם הצליחו ללכוד פוסט-טראומה מבנים כלי הדם עקב דליפת מכשיר מעקב יחיד. העיצוב שלנו דואו-צבע מאפשר דימות כלי הדם דינמי לדגמי טראומטי. בנוסף, הגמישות של שיטה זו מספקת הזדמנות ליצור פרופיל המרחבית-טמפורלית מהשינויים כלי דם אקוטי בעקבות לביוטכנולוגיה
ישנם מספר שלבים קריטיים בשיטה שלנו ב- vivo דואו-צבע דימות. קודם כל, זה היסוד כדי להבטיח את יציבות עמוד השדרה לפני זמן לשגות דימות, ובמיוחד צמצום נשימה תנועה החפץ הפיזי. תיכננו את צורת מלחציים בעמוד השדרה כדי להעלות את הגובה של חוליית עמוד השדרה קלות במהלך מייצב. וכך התנועה של חוט השדרה מתאם לחיה נשימה יכולה להיות הקטנו (איור 1D-F, 2B). מומלץ לבדוק את יציבות עמוד השדרה לפני תחילתו של כל מפגש הדמיה. אם חוט השדרה לא מצליח להשיג יציבות, ההתאמה צריכה להיעשות יישור ו ההידוק של חוט השדרה מלחציים. השני, היקפי רקמה (עצם, שכבת השריר והעור) דימום לתוך חלון הדמיה עלולות לסכן. זיהום של התצוגה. עבור הפעלת הדמיה חלקה, השאיבה ורקמות דבק דבק צריך להיות מוחל על הרקמה שמסביב למניעת יעיל. שלישית, צבעי פלורסנט שאנו בוחרים להיות בגודל דומה אלבומין (66 kDa), אשר הוא החלבון העיקרי משקל מולקולרי גבוה פלזמה דם. בתנאים homeostatic, הצבעים נשמרו במידה רבה בתוך הכלי דומה כמו אלבומין28. אחרי הפציעה, הצבעים עבר המבנה אנדותל קטועים, דלף אל parenchyma, גורם בעוצמה משמעותית של פלורסנט מוגברת באזור הפריפריה להערכת (איור 3F-G). בנוסף, ישנן שתי סיבות למה בחרנו צנתור עורק הצוואר. קודם כל, זה יכול לספק מסלול נגיש באופן עקבי של משלוח בכל עת של הניסוי. שנית, זה יכול לשמש מסלול להזרקה טיפול בעתיד.
למרות ויוו דואו-צבע השיטה שלנו מסוגל לספק מקום הרומן ללימודי טראומטי דימות כלי דם, כמה אזהרות לגבי טכניקה זו יש להתייחס. כיום, טכניקה זו נועד להעריך שינויים בכלי הדם 2 נקודות זמן (בסיסית ו- 1 נקודה זמן לאחר פציעה), אבל זה אפשרי לעבור מספר נקודות זמן אם צבעי פלורסנט נוספים וערוצים זמינים. למרות שיש מספר מחקרים באמצעות חלון זכוכית מושתל עבור הדמיה intravital כרונית, אף אחד מהם לא יכול לספק מידע בסיסי על אותו כלי השיט לאחר פציעה טראומטית19,29,30, 31,32. בניגוד מחקרים אלו, החלון הוא חלון זכוכית-לא. זה נוח עבור הדמיה מראש, לאחר פציעה, אבל זה יכול להיות מאתגר להקמת מחדש את החלון להשגחה לטווח ארוך. המחקר העתידי שלנו עובד על שיפור טכני עבור הדמיה כרונית. מערכת כלי הדם מורכב של מספר סוגים של כלי השיט (עורק, וריד ונים) וכל אחד שונה בהיבטים של מורפולוגיה ותפקוד. הבחנה בין סוגי כלי השיט במהלך ההדמיה יכולה לעזור להתגרות דפוס ברור של שינויים בכלי הדם. הפרוטוקול הנ ל תלוי המתבונן זיהוי כלי מבוסס על מורפולוגיה והמהירות; עם זאת, צבע ספציפי עורק ניתן להוסיף בקלות לתת סיווג מוחלטים יותר בין סוגי כלי השיט33.
טכניקה זו היא לא רק מוגבלת כדי הערכות על contusive, מודלים טראומטיים אחרים, כגון פציעה למחוץ ופציעה קרינה, אבל גם על לימודי התמקדות שיבוש BSCB, חדירות באותה מידה כמו כלי הדם משתנה. מלבד SCI, זה יכול לשמש כדי לחקור את השינויים בכלי הדם בעקבות מחלות ניווניות אחרות כגון נוירודגנרטיביות (ALS), טרשת נפוצה (MS). יתר על כן, יתכן להעברה למודל בעלי חיים הטרנסגניים את האינטראקציה דינמי נוירו-וסקולריים. ככלי מיון רב עוצמה, מחקרים עתידיים יכול לנצל את טכניקת דימות המתוארים כאן כדי להעריך את היעילות של הטיפול עבור פגיעה בחוט השדרה.
לסיכום, אין ויוו דואו-צבע שיטה הוא כלי הגישה אמין, בזמן אמת, אין ויוו הערכת דינמי שינויים בכלי הדם, אשר הינו אידיאלי עבור אפיון פרופיל וסקולרית מרחבית-טמפורלית, הקרנת עבור טיפולים לצמצם נזקים משניים בעקבות לביוטכנולוגיה
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמך בחלקה על ידי NIH NS059622, NS073636, משרד ההגנה CDMRP W81XWH-12-1-0562, ערך סקירה פרס I01 BX002356 מן ארה ב המחלקה לענייני חיילים משוחררים, קרייג H Neilsen קרן 296749, חוט השדרה אינדיאנה (קרן מחקר פגיעה במוח ISCBIRF) של מחלקת המדינה אינדיאנה הבריאות (019919), מארי. ג'ורג ' Hulman הקרן כספים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purdue Products Betadine Surgical Scrub | Fisher Scientific | 19-027132 | Skin sterilization |
| Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) | Patterson Veterinary | 07-881-9413, 07-890-5745 | Anesthetic agent |
| Buprenorphine(0.03 mg/mL) | Patterson Veterinary | 07-891-9756 | Pain relief agent |
| Carprofen | Patterson Veterinary | 07-844-7425 | Non-steroidal anti-inflammatory drug |
| Dukal Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-490 | Skin sterilization |
| Decon Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | 04-355-450 | Skin sterilization |
| Artificial Tears Eye Ointment | Webster Veterinary | 07-870-5261 | Prevent drying eyes |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 1006015 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average mol wt 70kDa |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | Average mol wt 70kDa |
| Instrument Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | for sterilizing surgery tool |
| Spine stabilizer set | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
| Vetbond | 3M Animal Care Products | 1469SB | Tissue adhesive Glue |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | Stop bleeding |
| Noyes Spring Scissors | F.S.T | 15013-12 | |
| Fine Forceps- Dumont #5 | F.S.T | 11254-20 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | laminectomy |
| Surgical Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | skin cut |
| Scalpel Blade #15 | Royal-Tek | BS2982 | skin cut |
| micro angled scissors | World Precision Instruments | 500260 | Can be from any vendor |
| 3-0 vicryl sutures | Ethicon | J393H | Can be from any vendor |
| Silk Black Braided Non-Absorbable Suture, 3-0, C-7, Reverse Cutting, 18" | LOOK | 786 | Can be from any vendor |
| 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200.V0 | Can be from any vendor |
| 21 gauge needle | BD | 305165 | Can be from any vendor |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Can be from any vendor |
| Two-photon Laser Scanning Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | ||
| LISA device | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Corporation | Imaging software | |
| PrairieView | Prairie Technologies/Bruker | Two-photon imaging software | |
| ImageJ | Image analysis software | ||
| Matlab statistics toolbox | The MathWorks, Inc. | https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle | Image analysis software |
References
- National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet 2016. , (2016).
- Dumont, R. J., et al. Acute spinal cord injury, part I: pathophysiologic mechanisms. Clin Neuropharmacol. 24 (5), 254-264 (2001).
- Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
- Liu, N. K., et al. A novel role of phospholipase A2 in mediating spinal cord secondary injury. Ann Neurol. 59 (4), 606-619 (2006).
- Wu, X., Xu, X. M. RhoA/Rho kinase in spinal cord injury. Neural Regen Res. 11 (1), 23-27 (2016).
- Li, X. G., et al. Combination of methylprednisolone and rosiglitazone promotes recovery of neurological function after spinal cord injury. Neural Regen Res. 11 (10), 1678-1684 (2016).
- Kulkarni, M. V., et al. Acute spinal cord injury: MR imaging at 1.5. T. Radiology. 164 (3), 837-843 (1987).
- Tator, C. H., Koyanagi, I. Vascular mechanisms in the pathophysiology of human spinal cord injury. J Neurosurg. 86 (3), 483-492 (1997).
- Kobrine, A. I., Doyle, T. F., Martins, A. N. Spinal cord blood flow in the rhesus monkey by the hydrogen clearance method. Surg Neurol. 2 (3), 197-200 (1974).
- Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J Neurosurg. 49 (6), 844-853 (1978).
- Koyanagi, I., Tator, C. H., Theriault, E. Silicone rubber microangiography of acute spinal cord injury in the rat. Neurosurgery. 32 (2), 260-268 (1993).
- Noble, L. J., Wrathall, J. R. Correlative analyses of lesion development and functional status after graded spinal cord contusive injuries in the rat. Exp Neurol. 103 (1), 34-40 (1989).
- Maikos, J. T., Shreiber, D. I. Immediate damage to the blood-spinal cord barrier due to mechanical trauma. J Neurotrauma. 24 (3), 492-507 (2007).
- Tei, R., Kaido, T., Nakase, H., Sakaki, T. Secondary spinal cord hypoperfusion of circumscribed areas after injury in rats. Neurol Res. 27 (4), 403-408 (2005).
- Cohen, D. M., et al. Blood-spinal cord barrier permeability in experimental spinal cord injury: dynamic contrast-enhanced MRI. NMR Biomed. 22 (3), 332-341 (2009).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (20), 8473-8478 (2011).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biol. 4 (2), e22 (2006).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), e38590 (2012).
- Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Sci Rep. 5, 9691 (2015).
- Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Res Brain Res Protoc. 10 (2), 84-94 (2002).
- Walker, M. J., et al. A novel vertebral stabilization method for producing contusive spinal cord injury. J Vis Exp. (95), e50149 (2015).
- Anderson, K. D., Sharp, K. G., Steward, O. Bilateral cervical contusion spinal cord injury in rats. Exp Neurol. 220 (1), 9-22 (2009).
- Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Zhang, Y. P., et al. Spinal cord contusion based on precise vertebral stabilization and tissue displacement measured by combined assessment to discriminate small functional differences. J Neurotrauma. 25 (10), 1227-1240 (2008).
- Wu, X., et al. A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice. J Vis Exp. (124), (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, 1932 (2013).
- Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
- Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. Intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury. J Vis Exp. (93), e52228 (2014).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), e2760 (2012).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
