Summary
यहां हम थूक प्रेरण की तकनीक का वर्णन । यह प्रोटोकॉल भी एक अवकलन सेल गिनती करने के लिए और अधिक विश्लेषण के लिए थूक supernatant और कोशिकाओं को इकट्ठा करने के थूक प्रसंस्करण बताते हैं ।
Abstract
थूक प्रेरण और प्रसंस्करण की तकनीक एक मांयता प्राप्त गैर इनवेसिव विधि संग्रह और वायुमार्ग, जो अस्थमा की तरह विभिंन श्वसन रोगों में दिलचस्प है से कोशिकाओं के विश्लेषण की अनुमति है, जीर्ण प्रतिरोधी फुफ्फुसीय रोग (सीओपीडी), पुरानी खांसी, या अज्ञातहेतुक फेफड़े की फाइब्रोसिस । इस तकनीक को अच्छी तरह से सहन, सुरक्षित और गैर इनवेसिव है, लेकिन वर्तमान में अनुसंधान सेवाओं और नैदानिक अभ्यास में विशेष केंद्रों के लिए सीमित है, क्योंकि यह तकनीकी तौर पर मांग, समय लेने वाली है, और प्रशिक्षित कर्मचारियों की आवश्यकता है । थूक प्रेरण और विश्लेषण की सफलता की दर के बारे में ८०% है ।
यहां, हम प्रेरण और थूक नमूनों की प्रयोगशाला प्रसंस्करण का वर्णन । थूक salbutamol के साथ hypertonic या isotonic खारा की साँस लेना द्वारा प्रेरित है । प्रसंस्करण के लिए, हम पूरे थूक तकनीक का उपयोग करें । Dithiothreitol (डीटीटी) थूक नमूने के mucolysis की अनुमति के लिए प्रयोग किया जाता है । थूक प्रसंस्करण के प्राथमिक उद्देश्य airway लुमेन में मौजूद कोशिका प्रकार का अध्ययन करने के लिए एक अवकलन सेल गिनती प्राप्त करने के लिए है. अतिरिक्त विश्लेषण भी थूक supernatant और थूक कोशिकाओं है, जो भड़काऊ प्रक्रियाओं और प्रतिरक्षा तंत्र में आगे की जांच की अनुमति दे सकता है पर किया जा सकता है । उदाहरण supernatant थूक में मध्यस्थों का अध्ययन और ऐसे प्रवाह cytometry, जीनोमिक्स, या प्रोटियोमिक् के रूप में थूक कोशिकाओं पर विश्लेषण का एक बड़ा स्पेक्ट्रम प्रदर्शन शामिल हैं.
अंत में, स्वस्थ नियंत्रण, दमा, और सीओपीडी रोगियों में थूक विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत कर रहे हैं ।
Introduction
कई तरीकों airway सूजन की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है: प्रत्यक्ष माप (जैसे बायोप्सी या bronchoalveolar lavages) और अप्रत्यक्ष तरीके (लक्षण आकलन की तरह, रक्त नमूना विश्लेषण और फेफड़ों समारोह परीक्षण)1। प्रत्यक्ष तकनीक का लाभ है मज़बूती से airway सूजन का आकलन है, लेकिन वे आक्रामक और व्यावहारिक नहीं है क्योंकि रोगी असुविधा और जोखिम के बड़े पैमाने पर1खर्च । अप्रत्यक्ष तरीकों के लिए के रूप में, वे खराब airway सूजन के प्रत्यक्ष मूल्यांकन के साथ सहसंबंधी1।
थूक संग्रह एयरवेज से कोशिकाओं के नमूने के लिए एक और तरीका है और airway सूजन के प्रत्यक्ष आकलन की अनुमति देता है । फिर भी, सहज थूक उत्पादन गरीब गुणवत्ता के नमूनों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और सभी रोगियों के लिए संभव नहीं है2. इस समस्या का उपयोग करके अल्ट्रासोनिक nebulized hypertonic खारा थूक उत्पादन2प्रेरित करने के लिए दूर किया गया है । इस विधि शुरू में Pneumocystis carinii निमोनिया के निदान के लिए मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) से संक्रमित रोगियों में इस्तेमाल किया गया था3 और १९९२4में स्वस्थ विषयों और दमा के लिए अनुकूलित किया गया था । थूक प्रेरण isotonic खारा5का उपयोग करके और अधिक गंभीर रोगियों में भी संभव है । हालांकि आम तौर पर अच्छी तरह से सहन, खारा की साँस लेना hyperresponsive एयरवेज के साथ रोगियों में आकर्ष कारण हो सकता है5. इसलिए, यह प्रक्रिया1से पहले एक लघु-कार्य बीटा एगोनिस्ट व्यवस्थापित करने के लिए अनुशंसित है । इसके अलावा, हम पहले से पता चला है कि अल्ट्रासोनिक छिटकानेवाला में खारा समाधान करने के लिए salbutamol जोड़ने आगे इस जोखिम को कम6। थूक प्रेरण के लाभ यह है कि यह गैर इनवेसिव2 और सुरक्षित है जब उचित सावधानियों5लिया जाता है ।
थूक नमूने के प्रसंस्करण के लिए, दो तरीकों वर्तमान में साहित्य में इस्तेमाल कर रहे हैं: पूरे थूक तकनीक और प्लग चयन7। हमारी प्रयोगशाला में, पूरे थूक तकनीक का प्रदर्शन किया है । थूक प्रसंस्करण के प्राथमिक उद्देश्य airway लुमेन में मौजूद सूजन के प्रकार का अध्ययन करने के लिए एक अंतर कोशिका गिनती प्राप्त करने के लिए है । हालांकि, कई अतिरिक्त विश्लेषण भी आगे भड़काऊ प्रक्रियाओं और प्रतिरक्षा तंत्र की जांच करने के लिए संभव हैं, या तो थूक supernatant में मध्यस्थों का अध्ययन करके8 या थूक कोशिकाओं पर विस्तृत जांच प्रदर्शन (उदा. , प्रवाह cytometry9, सेल संस्कृतियों10, जीनोमिक्स10, प्रोटियोमिक्10, immunocytochemistry7, में सीटू संकरण7, आदि)
थूक प्रेरण और विश्लेषण की तकनीक वर्तमान में नैदानिक अभ्यास में अनुसंधान सेवाओं और विशेष केंद्रों तक ही सीमित है, क्योंकि यह तकनीकी रूप से मांग, समय लेने वाली है, और प्रशिक्षित स्टाफ1की आवश्यकता है । Airway सूजन अस्थमा जैसे विभिन्न श्वसन रोगों, जीर्ण प्रतिरोधी फुफ्फुसीय रोग (सीओपीडी), क्रोनिक खांसी, या अज्ञातहेतुक फेफड़े फाइब्रोसिस11के लिए इस विधि के साथ जांच की जा सकती है ।
Protocol
इस खंड में वर्णित सभी विधियों को लिएआगे के विश्वविद्यालय अस्पताल की एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित कर दिया गया है और सभी स्वस्थ विषयों की भागीदारी के लिए लिखित सूचित सहमति दे दी है.
1. थूक प्रेरण
- प्री और पोस्ट-ब्रांकोडायलेटर स्पाइरोमीटरी
- अमेरिकी वक्ष समाज (एटीएस)/European श्वसन सोसायटी (नेताओं) मानक मानदंड 12के अनुसार एक स्पाइरोमीटरी (1 सेकंड [फेव1] और मजबूर महत्वपूर्ण क्षमता [FVC] पैंतरेबाज़ी) में मजबूर expiratory मात्रा प्रदर्शन ।
- प्रशासन ४०० एक मीटर्ड खुराक इनहेलर (MDI) से सांस salbutamol के µ जी एक स्पेसर डिवाइस के माध्यम से ।
नोट: वयस्कों में, साँस salbutamol की प्रतिकूल घटनाओं कंपन और क्षिप्रहृदयता13शामिल हैं । - दोहराएं स्पाइरोमीटरी (फेव1 और FVC पैंतरेबाज़ी) 15 मिनट बाद में, एटीएस के अनुसार/नेताओं मानक मानदंड12।
- अल्ट्रासोनिक छिटकानेवाला की तैयारी
नोट: छिटकानेवाला को निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रत्येक उपयोग से पहले अच्छी तरह साफ और संक्रमित किया जाना चाहिए ।- आसुत जल के साथ छिटकानेवाला चैंबर की सिफारिश की स्तर तक भरें ।
- छिटकानेवाला चैंबर में एक साफ कप रखें ।
- उचित ढक्कन के साथ कप कवर ।
- hypertonic खारा के ५० मिलीलीटर के साथ कप भरें (पोस्ट के साथ एक रोगी के लिए 5%)-ब्रांकोडायलेटर फेव1 & #62; ६५% की भविष्यवाणी की या ५० isotonic खारा (०.९%) के बाद के साथ एक मरीज के लिए-ब्रांकोडायलेटर फेव1≤ ६५% की भविष्यवाणी की ।
- कप के लिए salbutamol सल्फेट समाधान (5 मिलीग्राम/एमएल) की १.७५ मिलीलीटर जोड़ें ।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार ट्यूबों और वाल्व कनेक्ट ।
- Nebulization और थूक संग्रह
नोट: चिकित्सा पर्यवेक्षण के तहत तकनीक का प्रदर्शन ।- रोगी को प्रक्रिया समझाओ ।
- रोगी को नाक क्लिप का उपयोग करने के लिए कहें ।
- पर छिटकानेवाला बारी और एयरोसोल और प्रशंसक सेटिंग्स के निंनतम स्तर का चयन करें ।
- रोगी से पूछो 5 मिनट के लिए ज्वार श्वास के साथ मुंह टुकड़ा के माध्यम से एयरोसोल श्वास ।
नोट: रोगी की सहनशीलता के आधार पर एयरोसोल और पंखे की सेटिंग बढ़ाई जा सकती है ।- असहनीय खांसी या मतली के मामले में, प्रक्रिया को बंद और कदम 1.3.5 के लिए जाना ।
- सीने में जकड़न या सांस की तकलीफ की स्थिति में, कदम 1.3.8 के लिए जाओ ।
- छिटकानेवाला बंद कर दें ।
- नाक क्लिप को हटाने के लिए रोगी से पूछो, पानी के साथ उसका मुंह कुल्ला, और सिंक में इसे खारिज करने से पहले दो बार कुल्ला ।
नोट: लार कोशिकाओं थूक नमूना दूषित और एक अनुपयोगी नमूने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । - रोगी को एक प्लास्टिक कंटेनर में थूक खांसी के लिए पूछो ।
- फेव1को मापने के लिए एक स्पाइरोमीटरी (मजबूर expiratory पैंतरेबाज़ी) निष्पादित करें ।
- फेव1 गिरावट का मूल्यांकन निंनानुसार है: (फेव1 मापा चरण ३.८ [एमएल] पर)-(पोस्ट-ब्रांकोडायलेटर फेव1 कदम पर मापा १.३ [एमएल])/(पोस्ट-ब्रांकोडायलेटर फेव1 मापा चरण १.३ [एमएल] पर) * 100 ।
- यदि फेव1 से 20% या उससे अधिक के बाद ब्रांकोडायलेटर मूल्य से गिर जाता है, प्रक्रिया को बंद । उपाय फेव1 फिर 10 मिनट बाद में । यदि फेव1 20% या अधिक हो जाता है, चिकित्सक से पूछो nebulized ipratropium ब्रोमाइड (०.२५ मिलीग्राम/2 मिलीलीटर) और चिकित्सा निरीक्षण के तहत रोगी रखने के लिए । चरण 1.3.10 पर जाएं ।
- यदि फेव1 को 20% या उससे अधिक पोस्ट-ब्रांकोडायलेटर मान से नहीं गिरता है, तो 10 से 20 मिनट के कुल nebulization समय तक पहुंचने के लिए चरण ३.२ से ३.९ एक से तीन बार दोहराएं ।
नोट: कुल nebulization समय (प्लग या चिपचिपा भागों की उपस्थिति) गुणवत्ता और थूक नमूने की मात्रा पर निर्भर करेगा । यदि नमूना गुणवत्ता और/या मात्रा nebulization के 10 मिनट के बाद खराब है, तो प्रक्रिया 15 से 20 मिनट के कुल nebulization समय तक पहुंचने के लिए विस्तारित किया जाना चाहिए ।
- थूक नमूना प्रसंस्करण तक प्रशीतित रखें ।
2. थूक प्रसंस्करण
नोट: इष्टतम सेल व्यवहार्यता के लिए नमूने के 3 घंटे के भीतर थूक प्रक्रिया ।
चेतावनी: एक प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक दस्ताने पहनते हैं, और काले चश्मे ।
- प्रारंभिक तैयारी
- एक 10-बाँझ आसुत पानी के साथ केंद्रित dithiothreitol समाधान (mucolytic एजेंट) के कमजोर पड़ने से एक ६.५ mM समाधान के 10 मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार ।
नोट: परिवेशी वायु के साथ मिश्रण केंद्रित dithiothreitol समाधान को रोकने के लिए, एक बाँझ सिरिंज और सुई के साथ शीशी से समाधान को वापस ले. एक बार खोला, केंद्रित समाधान शीशी कमरे के तापमान पर रखा जाना चाहिए और 5 दिनों के भीतर इस्तेमाल किया । पतला समाधान दैनिक तैयार है ।
सावधानी: क्योंकि आंख और त्वचा जलन का खतरा, सुरक्षा उपकरण पहनते है (कपड़े, दस्ताने, और काले चश्मे) । - एक 5-trypan नीले समाधान के कमजोर पड़ने से (०.४%) Dulbecco फॉस्फेट के साथ-बफर खारा (DPBS) एक ०.०८% समाधान प्राप्त करने के लिए बनाओ । कमरे के तापमान पर इस पतला समाधान रखें और 2 सप्ताह के भीतर का उपयोग करें ।
चेतावनी: यलो खतरों की वजह से, सुरक्षात्मक उपकरण पहनना (कपड़े, दस्ताने और काले चश्मे).
- एक 10-बाँझ आसुत पानी के साथ केंद्रित dithiothreitol समाधान (mucolytic एजेंट) के कमजोर पड़ने से एक ६.५ mM समाधान के 10 मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार ।
- थूक Supernatant का संग्रह
- एक ५० मिलीलीटर शंकु नीचे प्लास्टिक ट्यूब में पूरे थूक हस्तांतरण और नमूना वजन ।
- DPBS समाधान के 3 गुना वजन जोड़ें ।
- धीरे से भंवर 30 एस के लिए नमूने ।
- 10 मिनट के लिए ८०० x g और 4 ° c पर केंद्रापसारक ।
- बाँझ धुंध की 2 एकल परतों के माध्यम से नमूना फ़िल्टर और एक ५० मिलीलीटर शंकु नीचे प्लास्टिक ट्यूब में supernatant इकट्ठा ।
- 2 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों में supernatant Aliquot और उन्हें-८० ° c पर स्टोर करें ।
नोट: Supernatant नमूनों परख थूक द्रव चरण घटकों के लिए उपयोगी होते हैं ।
- थूक Mucolysis
- यदि आवश्यक हो, सेल गोली करने के लिए DPBS जोड़ें 5 मिलीलीटर के सेल निलंबन की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए ।
- ६.५ mM dithiothreitol के 1 वॉल्यूम के साथ सेल सस्पेंशन को पतला कर दीजिये । एक बेंच झूली कुरसी का प्रयोग कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेल निलंबन रॉक ।
- दोहराएं कम से DPBS के साथ 3 बार ।
- ५५० x g और 4 ° c 10 मिनट के लिए पर पतला सेल निलंबन केंद्रापसारक ।
- का आकलन करें और सेल निलंबन की सटीक मात्रा रिकॉर्ड ।
- सेल सस्पेंशन के ५० µ l को ०.०८% trypan ब्लू सॉल्यूशन और homogenize के ५० µ l में जोड़ें ।
- एक hemocytometer (Thoma चैंबर) के coverslip के तहत नमूना रखो और यह ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप (400X) के तहत जगह है ।
- स्क्वैमस कोशिकाओं, रहने वाले गैर-स्क्वैमस कोशिकाओं (अनरंगों कोशिकाओं), और मृत गैर स्क्वैमस कोशिकाओं (नीले रंग की कोशिकाओं) गिनती.
नोट: बहुत कम या बहुत उच्च कोशिका घनत्व के मामले में, ध्यान केंद्रित करने या सेल निलंबन और दोहराने कदम 2.4.1-2.4.3 । - निलंबन की कोशिका एकाग्रता का आकलन, स्क्वैमस कोशिकाओं का प्रतिशत, और गैर स्क्वैमस कोशिकाओं की व्यवहार्यता का प्रतिशत.
नोट: थूक के कुल गैर स्क्वैमस सेल गणना/जी की गणना: निलंबन की कोशिका एकाग्रता (चरण ५.४) * सेल निलंबन की मात्रा (चरण ४.८) *% गैर-स्क्वैमस कोशिकाओं के थूक नमूना (कदम 2.2.1) के वजन/
नोट: यदि कक्ष निलंबन में ८०% से अधिक स्क्वैमस कक्ष हैं, तो नमूना खराब गुणवत्ता और किसी cytospin स्लाइड14के लिए अनुपयुक्त माना जाता है । उस स्थिति में, प्रक्रिया को बंद करें और इस नमूने पर विचार असफल ।
- DPBS के साथ सेल निलंबन के एक aliquot को पतला करने के लिए ५००,००० कोशिकाओं/एमएल में एक सेल निलंबन के कम से ३५० µ एल प्राप्त करने के लिए ।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार कक्ष संकेंद्रक को इकट्ठा करना ।
- इस सेल के निलंबन के १०० µ l के साथ सेल के संकेन्द्रण के 3 डिब्बों में से प्रत्येक को भरें ।
- एक cytocentrifuge में, १५० x जी और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए स्पिन । supernatants को त्यागें ।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार कक्ष संकेंद्रक को विभक्त करे ।
- स्लाइड को शुष्क हवा की अनुमति दें ।
नोट: इस स्तर पर, अवशिष्ट कोशिकाओं को एक पर्याप्त बफर में संग्रहीत किया जा सकता है अगर आगे प्रयोगों के लिए आवश्यक है । - एक वाणिज्यिक धुंधला किट के साथ स्लाइड दाग ( सामग्री की तालिकादेखें), निर्माता के निर्देशों के अनुसार ।
- एक उपयुक्त बढ़ते मध्यम और एक कवर पर्ची के साथ स्लाइड माउंट ।
- स्लाइड को तेल विसर्जन के साथ ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप (600X) के नीचे रखें ।
- न्यूनतम ५०० गैर-स्क्वैमस कक्षों की गणना करें: न्यूट्रोफिल, इयोस्नोफिल्स, मैक्रोफेज, लिम्फोसाइटों और उपकला कोशिकाएँ.
नोट: विभेदक सेल गिनती आमतौर पर केवल एक या दो समर्पित और प्रशिक्षित पर्यवेक्षकों द्वारा पर्यवेक्षकीय विसंगतियों को सीमित करने के लिए किया जाता है । - प्रत्येक कक्ष प्रकार के निरपेक्ष मान और प्रतिशत रिकॉर्ड करें ।
Representative Results
Hemocytometer
एक ठेठ छवि चित्रा 1 है कि hemocytometer का उपयोग माइक्रोस्कोप के साथ कल्पना की है में दिखाया गया है । स्क्वैमस कोशिकाओं को आसानी से पहचान कर रहे हैं, के रूप में वे बहुत गैर स्क्वैमस कोशिकाओं से बड़े हैं । ये स्क्वैमस कोशिकाएँ मुँह से आने वाली उपकला कोशिकाएँ होती हैं. कोशिकाओं के दोनों प्रकार के Trypan नीले रंग से दाग रहे है जब मृत । सावधानी खमीर, बैक्टीरिया, और स्क्रैप गिनती से बचने के लिए लिया जाना चाहिए ।
चित्र 1 : Hemocytometer चित्र दिखा (a) एक लिविंग नॉन-स्क्वैमस सेल, (B) एक डेड नॉन-स्क्वैमस सेल, और (C) a स्क्वैमस cell. स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Cytospin स्लाइड: चित्रा 2 थूक प्रसंस्करण के बाद प्राप्त एक Cytospin स्लाइड की एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है । विभिन्न कोशिका प्रकार (न्यूट्रोफिल, इयोस्नोफिल्स, मैक्रोफेज, लिम्फोसाइटों, और उपकला कोशिकाओं) उनकी आकृति विज्ञान और रंगाई के माध्यम से विभेदित किया जा सकता है. कुछ मामलों में, स्क्वैमस कोशिकाओं द्वारा संदूषण महत्वपूर्ण हो सकता है और, यदि स्क्वैमस कक्षों का प्रतिशत ८०% से अधिक है, तो नमूना असफल माना जाता है (आरेख 3) ।
चित्र 2 : Cytospin स्लाइड चित्र दिखा रहा है (a) एक न्युट्रोफिल, (B) a macrophage, (C) एक eosinophil, (D) a लिम्फोसाइट, and (E) एक उपकला कोशिका. स्केल बार = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 3 : & #62 के साथ एक खराब गुणवत्ता cytospin स्लाइड का उदाहरण, स्क्वैमस कोशिकाओं का ८०%. स्केल बार = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
सफलता दर
हमारे विभाग में, प्रक्रिया की सफलता की दर (एक सफल प्रेरण और एक पठनीय cytospin के संयोजन), १,१२९ रोगियों (स्वस्थ विषयों, दमा, या सीओपीडी रोगियों) के एक नमूने के आधार पर, ८२% है (924/1129) । रोगियों के प्रकार के अनुसार एक उप विश्लेषण में, सफलता की दर ७५% (57/76) स्वस्थ विषयों में, दमा में ८२% (827/1004), और सीओपीडी रोगियों में ८२% (40/49) है ।
स्वस्थ विषयों में परिणाम
हमारे विभाग से २८९ स्वस्थ विषयों की एक श्रृंखला के पूर्वव्यापी विश्लेषण में, औसत (interquartile रेंज) थूक वजन ३.७२ ग्राम (२.४६ जी के interquartile रेंज-५.५४ जी) और औसत कुल गैर स्क्वैमस सेल गणना/थूक के जी था ०.५९ x 106 ( ०.३७ x 106 -१.२९ x 106) के interquartile रेंज ।
उन स्वस्थ विषयों में, स्क्वैमस कोशिकाओं का अनुपात कम है 19% (10%-३४%) और व्यवहार्यता पर उच्च है ६६% (54-78%) । विभिन्न सेल प्रकार के प्रतिशत के बारे में, परिणाम चित्रा 4aमें संक्षेप हैं. हम गौर कर सकते हैं कि मैक्रोफेज का प्रतिशत (४९% [31-68%]) न्यूट्रोफिल के प्रतिशत से अधिक है (३४% [14%-६०%]), जबकि लिम्फोसाइटों का प्रतिशत (2% [1-3%]), इयोस्नोफिल्स (0% [0%-0%]) और उपकला कोशिकाएं (4% [2-11%]) कम हैं । ये परिणाम समान है जब डेटा निरपेक्ष मान (आरेख 4B) में व्यक्त किए जाते हैं ।
चित्र 4 : अंतर कोशिका गिनती के प्रतिनिधि परिणाम स्वस्थ विषयों में मनाया (एक) प्रतिशत या (ख) निरपेक्ष मूल्यों के रूप में व्यक्त की है । परिणाम माध्य (interquartile श्रेणी) के रूप में दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
मरीजों की उम्र को ध्यान में रखना भी जरूरी है । वास्तव में, एक मजबूत संबंध एक रोगी की उम्र और थूक के नमूनों में न्यूट्रोफिल के अनुपात के बीच मौजूद है (चित्रा 5). इसी तरह, जब 10 वर्ष आयु समूहों (चित्रा 6) के अनुसार रोगियों वर्गीकृत, हम बढ़ती आयु समूह के साथ न्युट्रोफिल प्रतिशत में एक उल्लेखनीय वृद्धि मनाया । इसलिए, विभिंन समानताएं से परिणाम की तुलना करते समय इस चर पर विचार किया जाना चाहिए, और सावधानी विषयों के मिलान में लिया जाना चाहिए ।
चित्र 5: उम्र और थूक न्युट्रोफिल प्रतिशत के बीच सहसंबंध. सहसंबंध स्पीमरन परीक्षण के साथ परिकलित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 6: आयु वर्ग के अनुसार न्युट्रोफिल प्रतिशत का विकास । ANOVA के पी-मान ने आयु वर्ग के बीच न्युट्रोफिल प्रतिशत की तुलना के लिए & #60; ०.०००१ कई तुलना डन के कई तुलना परीक्षण के साथ किए गए थे । p-मान निम्नानुसार दर्शाए गए हैं: * p & #60; ०.०५, * * p & #60; ०.०१, और * * * p & #60; ०.००१. परिणाम माध्य (interquartile श्रेणी) के रूप में दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
सांस की बीमारियों से पीड़ित मरीजों में परिणाम
प्रेरित थूक की तकनीक सामांयतः दमा रोगियों में भड़काऊ सेल प्रोफ़ाइल का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।इस तकनीक को भी सीओपीडी, एक और भड़काऊ श्वसन रोग से पीड़ित रोगियों को लागू किया जा सकता है । जब स्वस्थ विषयों की तुलना, दमा, और सीओपीडी रोगियों (3 समूहों उंर, लिंग, और तंबाकू की आदतों के लिए मिलान किया जा रहा है), हमने देखा है कि भड़काऊ सेल प्रोफ़ाइल इन साथियों के बीच काफी अलग है (चित्रा 7) । दरअसल, दमा रोगियों आमतौर पर उठाया थूक इयोस्नोफिल्स की विशेषता है, जबकि न्यूट्रोफिल थूक के अनुपात आमतौर पर स्वस्थ नियंत्रण है, जो रोग गंभीरता से जुड़ा हुआ है की तुलना में सीओपीडी रोगियों में अधिक है ।
चित्र 7 : स्वस्थ विषयों (n = ४५), दमा रोगियों (n = १०८) के भड़काऊ सेल प्रोफ़ाइल थूक, और सीओपीडी रोगियों (n = ५४) । तीन समूहों लिंग, आयु, और तंबाकू की आदतों के लिए मिलान किया गया । ANOVA के p मान थे & #60; ०.०५, & #60; ०.०००१, और & #60; ०.०००१ समूहों के बीच क्रमश: न्यूट्रोफिल, इयोस्नोफिल्स, और मैक्रोफेज की तुलना के लिए । कई तुलना डन के कई तुलना परीक्षण के साथ किए गए थे । p-मान निम्नानुसार दर्शाए गए हैं: * p & #60; ०.०५ और * * * p & #60; ०.००१. परिणाम माध्य (interquartile श्रेणी) के रूप में दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
प्रेरित थूक विधि airway डिब्बे का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है । इस तकनीक के कई संभावित आवेदन कर रहे हैं । सबसे पहले, यह प्रतिरक्षा कोशिकाओं और विभिंन श्वसन रोगों में शामिल तंत्र के बारे में ज्ञान में सुधार हो सकता है । उदाहरण के लिए, इस तकनीक रोगियों के बड़े साथियों में airway सूजन की जांच की अनुमति दी है, और यह दिखाया गया है कि दमा रोगियों के बारे में आधा एक असामांय airway इओसिनोफिलिक सूजन की विशेषता है15, 16 , 17, जबकि सीओपीडी रोगियों आमतौर पर एक उठाया थूक प्रदर्शन न्युट्रोफिल18गिनती । इस तकनीक भी अज्ञातहेतुक फेफड़े फाइब्रोसिस के साथ रोगियों में airway सूजन के बेहतर लक्षण वर्णन करने के लिए योगदान दिया है और सबूत मध्यस्थों कि इस रोग के लिए योगदान कर सकते हैं19। दूसरा, प्रेरित थूक की तकनीक उपचार के लिए प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए उपयोगी हो सकता है । उदाहरण के लिए, थूक इयोस्नोफिल्स की एक असामान्य प्रतिशत की उपस्थिति corticosteroid जवाबदेही11,18के एक पूर्वानुमान मार्कर होने के लिए दिखाया गया है. अस्थमा और सीओपीडी में थूक इयोस्नोफिल्स के प्रतिशत को सामान्य करने के लिए corticosteroids की खुराक सिलाई, वर्तमान नैदानिक दिशा निर्देशों के अनुसार उपचार के समायोजन से अधिक तीव्रता की संख्या को कम करने में अधिक प्रभावी होना दिखाया गया था11 ,20,21. तीसरा, थूक विश्लेषण लक्षित चिकित्सा विकसित करने में मदद कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, सीओपीडी और कुछ दमा रोगियों में थूक न्यूट्रोफिल की एक असामान्य संख्या की उपस्थिति antineutrophilic उपचार के विकास के लिए नेतृत्व किया गया है11. चौथा, तकनीक निदान में एक भूमिका निभा सकता है । उदाहरण के लिए, थूक eosinophilia की उपस्थिति गैर-दमा इओसिनोफिलिक ब्रोंकाइटिस11का निदान करने के लिए आवश्यक है ।
एक अंतर कोशिका गिनती प्राप्त करने के अलावा, थूक उत्प्रेरण की तकनीक भी थूक supernatant या थूक कोशिकाओं का अध्ययन करके, कई अतिरिक्त विश्लेषण के प्रदर्शन की अनुमति देता है. थूक supernatant के साथ उदाहरण मध्यस्थों का विश्लेषण8,19,22 और इयोस्नोफिल्स22के लिए नमूने के chemotactic गतिविधि का आकलन शामिल हैं । थूक कोशिकाओं से, आरएनए निकाला जा सकता है और microRNA या जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया19,23 . थूक कोशिकाओं को भी प्रवाह द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है cytometry9,23 जो अनुमति देता है, दूसरों के बीच में, immunophenotyping और छंटाई कोशिकाओं । इसके अलावा, थूक कोशिकाओं को10प्रसंस्कृत किया जा सकता है, और उनके मध्यस्थ उत्पादन इन विट्रो24में मापा जा सकता है । यह ध्यान देने योग्य बात है कि इस मामले में, मध्यस्थ सामग्री क्या थूक supernatant में पाया जा सकता से अलग है लायक है । दरअसल, थूक supernatant में मध्यस्थों airway निवासी कोशिकाओं से स्राव से प्रभावित हो सकता है और प्लाज्मा इंग्लैण्ड द्वारा, थूक सेल संस्कृति के विपरीत24मॉडल. अंत में, immunocytochemistry और सीटू संकरण में भी थूक कोशिकाओं7का उपयोग कर किया जा सकता है ।
प्रेरित थूक तकनीक कुछ सीमाएं हैं । प्रेरण चिकित्सा पर्यवेक्षण के तहत किया जाना चाहिए । इसके लिए मरीजों को गहन निर्देश देना भी संचालक के लिए जरूरी है । अंय सीमाओं के रोगियों के सहयोग और चिकित्सा शर्त शामिल हैं, के रूप में श्वसन प्रयासों की जरूरत है । बच्चों में इस तकनीक की व्यवहार्यता के बारे में, कई अध्ययनों ने बताया है कि यह 6 वर्ष से अधिक उम्र के बच्चों में सफल और सुरक्षित था25. & #60 के बच्चों पर डाटा; 6 वर्ष की आयु की कमी है25, लेकिन यह संभावना है कि थूक प्रेरण उन बच्चों में प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है14। तकनीक वर्तमान में अनुसंधान सेवाओं और विशेष केंद्रों के लिए प्रतिबंधित है क्योंकि यह तकनीकी तौर पर मांग, समय लेने वाली है, और यह प्रशिक्षित स्टाफ1की आवश्यकता है । एक और सीमा है कि थूक प्रेरण और विश्लेषण की तकनीक हमेशा सफल नहीं है, जिसका अर्थ है कि एक पठनीय cytospin हमेशा26प्राप्त नहीं है । हालांकि, सफलता की दर आमतौर पर रोगियों के विभिंन साथियों में ८०% के आसपास है4,26,27,28,29। अंत में, सावधानी जब उम्र के मिलान के बारे में रोगियों के विभिन्न साथियों की तुलना के रूप में यह थूक सेल गिनती30,31को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया था लिया जाना चाहिए. इसी तरह, लिंग और तंबाकू की आदतों के रूप में अंय मानकों के रूप में वे भी थूक सेल गिनती29,३२के साथ हस्तक्षेप कर सकते है मिलान किया जाना है । जब रोगी मिलान संभव नहीं है, एक और तरीका है खाते में उंर, लिंग या धूंरपान की स्थिति लेने के लिए इन विशेषताओं के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण समायोजित है ।
बायोप्सी और bronchoalveolar lavages की तरह एयरवेज से कोशिकाओं को इकट्ठा करने की अनुमति है कि अन्य तकनीकों की तुलना में, प्रेरित थूक विधि सरल, अच्छी तरह से सहन, सुरक्षित, प्रतिलिपि, लागत प्रभावी, और गैर इनवेसिव होने का लाभ है । ये लाभ प्रेरित थूक तकनीक एक बड़े पैमाने पर प्रदर्शन किया जा करने के लिए और बार-बार के साथ की अनुमति है, और यह airway नमूना के लिए पसंद का एक विकल्प बना. Bronchosorption एक और airway मध्यस्थों का आकलन करने के क्रम में द्रव अस्तर श्लैष्मिक के संग्रह की अनुमति तकनीक है३३। हालांकि इस तकनीक (ब्रोंकोस्कोपी की आवश्यकता होती है) अधिक प्रेरित थूक से अधिक आक्रामक है, यह लार के साथ किसी भी संक्रमण से बचने और bronchoalveolar लेवेज३३में से मध्यस्थों के उच्च सांद्रता प्राप्त करने के फायदे हैं ।
महत्वपूर्ण कदम प्रोटोकॉल में ध्यान देने की जरूरत है । सबसे पहले, सावधानी खारा एकाग्रता और प्रेरण के समय के विषय में लिया जाना चाहिए, क्योंकि इन दो मापदंडों परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं और इसलिए मानकीकृत३४,३५होना चाहिए. दूसरा, डीटीटी के साथ mucolysis प्रसंस्करण का एक महत्वपूर्ण कदम है । के रूप में पंजाबियों की तुलना में, डीटीटी बेहतर थूक कोशिकाओं को फैलाने के लिए दिखाया गया था7, जो cytopsin स्लाइड गुणवत्ता में सुधार करता है और एक प्रतिलिपि सेल गिनती2के लिए आवश्यक है । हालांकि, mucolytic एजेंट जैव रासायनिक घटकों की माप के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं ।Spiking प्रयोगों तो प्रदर्शन किया जाना चाहिए जब एक नया जैव रासायनिक यौगिक३६को मापने । अंत में, प्रक्रिया का एक और महत्वपूर्ण कदम सेल गिनती कदम है, जो एक प्रशिक्षित तकनीशियन द्वारा किया जाना चाहिए विश्वसनीय और व्याख्यात्मक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए है ।
थूक प्लग (विशसीड़ या सघन भागों) का उपयोग कर एक वैकल्पिक विधि, पूरे थूक के बजाय, यह भी साहित्य7में वर्णित है । दोनों तकनीकों फायदे और नुकसान है । पूरे थूक तकनीक और अधिक तेजी से प्रसंस्करण7की अनुमति देता है, लेकिन अक्सर लार, जो नमूना पतला और cytospins2,7की गुणवत्ता को कम कर सकते हैं के साथ दूषित है । प्लग चयन तकनीक के साथ, लार संदूषण कम है, जिसका मतलब है कि नमूनों अक्सर द्रव चरण मध्यस्थों की खुराक के लिए बेहतर गुणवत्ता के होते हैं और cytospin स्लाइड के लिए7. प्रसंस्करण हालांकि अब7 है और चयनित प्लग पूरे नमूना३७के प्रतिनिधि नहीं हो सकता है । यह भी ध्यान देने योग्य बात है कि नहीं सभी नमूनों प्लग है, जो सीमित किया जा सकता है लायक है । दोनों विधियां मांय और प्रतिलिपि हैं, और वर्तमान में कोई प्रमाण नहीं है कि अवकलन कक्ष इन दोनों विधियों से प्राप्त गणनाएं भिंन है14,३८।
भविष्य में, प्रेरित थूक जांच, निदान, और भड़काऊ श्वसन रोगों के सभी प्रकार के प्रबंधन के लिए एक नैदानिक उपकरण प्रदान करने के लिए के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल ऑफ लिएआगे (चू लिएआगे) ने सपोर्ट किया था. हम वीडियो उत्पादन के लिए "इंस्टेंट प्रोडक्शंस" स्वीकार करते हैं । हम भी सिडरिक फ़्रांस्वा, जो रोगी फिल्म में छपी स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spirometer - Spirobank | MIR France | ||
| Salbutamol MDI - Ventolin | GLAXOSMITHKLINE | CNK: 0135-913 | See drug available in the country |
| Nebulizer UltraNeb | DeVilbiss Healthcare USA | UltraNeb U3000 | |
| Devilbiss UltraNeb Disposable Cups & Lids | DeVilbiss Healthcare USA | 100HD-647 | |
| DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers | DeVilbiss Healthcare USA | 1001005879 | |
| One-way Valves | Hudson RCI USA | 41664 | |
| One-way Valves | Hudson RCI USA | 41665 | |
| Aerosol T-connector | Hudson RCI USA | 41077 | |
| Ventilation circuit monobranch corrugated | Int'Air Medical France | TA30A | |
| NaCl 5 % | / | / | Produced by our hospital pharmacy |
| Mini-Plasco NaCl 0.9% | B.Braun Medical Diegem Belgium | ||
| Salbutamol sulfate 5 mg/mL - Ventolin | GLAXOSMITHKLINE | CNK: 0094-987 | See drug available in the country |
| Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL - Atrovent | Boehringer Ingelheim Germany | CNK: 1543-305 | See drug available in the country |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | LONZA Belgium | BE17512F | |
| Sputolysin reagent | Calbiochem | 56000 | |
| Trypan blue 0.4% solution 100 mL | LONZA Bio Whittaker Belgium | 17-942E | |
| Hemocytometer - Thoma chamber | Labor Optik Lancing UK | 1500000 | |
| Hemacolor Stainig set | Merck Belgium | 1116610001 | Alternative product : Diff Quik Staining Set Medion Diagnostic |
| Mounting medium - Entellan | Merck Belgium | 107960 | |
| Statspin Cytofuge 12 | Beckman Coulter Belgium | X00-003066-001 |
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