Summary
Här beskriver vi tekniken av sputum induktion. Detta protokoll förklarar också sputum bearbetning att utföra en differential cell sammanräkning och samla sputum supernatanten och celler för vidare analys.
Abstract
Tekniken att sputum induktion och bearbetning är en erkänd icke-invasiv metod som möjliggör insamling och analys av celler från luftvägarna, vilket är intressant i olika luftvägssjukdomar som astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom (kol), kronisk hosta, eller idiopatisk lungfibros. Denna teknik är väl tolererad, säker och icke-invasiv, men är för närvarande begränsad till forskningstjänster och specialiserade centra i klinisk praxis eftersom det är tekniskt krävande, tidskrävande och kräver utbildad personal. Andelen framgångsrika sputum induktion och analys är ca 80%.
Här beskriver vi induktion och laboratorium bearbetning av sputum prover. Sputum induceras genom inhalation av hyperton eller isoton koksaltlösning med salbutamol. För bearbetning använder vi hela sputum tekniken. Ditiotreitol (DTT) används för att tillåta mucolysis av sputum prover. Det primära syftet med sputum bearbetning är att erhålla en differential cell sammanräkning för att studera celltyper som finns i luftvägarna lumen. Ytterligare analyser kan också utföras på sputum supernatanten och sputum celler, som kan tillåta ytterligare utredning inflammatoriska processer och immunologiska mekanismer. Till exempel studerar mediatorer i sputum supernatanten och utför ett stort spektrum av analys på sputum celler såsom flödescytometri, genomik och proteomik.
Slutligen presenteras representativa resultat av sputum analys i friska kontroller, astmatiker och KOL-patienter.
Introduction
Flera metoder används för att undersöka luftvägsinflammationer: direkta mätningar (som bronkial biopsier eller bronkoalveolär lavages) och indirekta metoder (som symptom bedömning, blod prov analys och lung funktionstester)1. De direkta teknikerna har fördelen av att på ett tillförlitligt sätt bedöma inflammationen i luftvägarna, men de är invasiva och inte genomförbart i stor skala på grund av patientens obehag och risk uppkommer1. När det gäller de indirekta metoderna korrelerar de dåligt med direkt bedömning av luftvägarna inflammation1.
Sputum collection är ett annat sätt att provet celler från luftvägarna och tillåter direkt bedömning av inflammation i luftvägarna. Dock producera sputum spontant kan leda till prover av dålig kvalitet och är inte möjligt för alla patienter2. Denna fråga har övervunnits med hjälp av ultraljud nebulized hyperton koksaltlösning för att framkalla den slem produktion2. Denna metod användes initialt till patienter infekterade med humant immunbristvirus (HIV) för diagnos av Pneumocystis carinii pneumoni3 och anpassades för friska och astmatiker i 19924. Sputum induktion är också möjligt i allvarligare patienter med isoton koksaltlösning5. Även om det är i allmänhet tolereras väl, kan inandning av saltlösning orsaka bronkospasm hos patienter med hyperreaktivitet airways5. Därför är det rekommenderat att administrera en kortverkande beta agonist före förfarande1. Dessutom har vi tidigare visat att lägga till salbutamol i saltlösning i ultraljud nebulisatorn ytterligare minskat denna risk6. Fördelarna med sputum induktion är att det är icke-invasiv2 och säkra när de lämpliga försiktighetsåtgärder vidtas5.
För bearbetning av sputum prover, två metoder används för närvarande i litteraturen: hela sputum tekniken och plugg urval7. I vårt laboratorium utförs hela sputum tekniken. Det primära syftet med sputum bearbetning är att erhålla en differential cell sammanräkning för att studera vilken typ av inflammation i luftvägarna lumen. Många ytterligare analyser är dock också möjligt att ytterligare utreda inflammatoriska processer och immunologiska mekanismer, antingen genom att studera medlare i sputum supernatant8 eller genom att utföra detaljerade undersökningen på sputum celler (t.ex. , flow flödescytometri9, cell kulturer10, genomik10, proteomik10, immuncytokemi7, i situ hybridisering7, etc.)
Tekniken att sputum induktion och analys är för närvarande begränsad till forskning tjänster och specialiserade centra i klinisk praxis eftersom det är tekniskt krävande, tidskrävande och kräver utbildad personal1. Inflammation i luftvägarna kan undersökas med denna metod för olika luftvägssjukdomar som astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom (kol), kronisk hosta eller idiopatisk lungfibros11.
Protocol
Alla metoder som beskrivs i detta avsnitt har godkänts av den etiska kommittén av Lièges universitet sjukhus och alla friska försökspersoner gav skriftligt informerat samtycke för deltagande.
1. sputum induktion
- Före och efter bronkdilaterare spirometri
- Utföra en spirometri (forcerad exspiratorisk volym på 1 sekund [FEV1] och forcerad vitalkapacitet [FVC] manöver) enligt den American Thoracic Society (ATS) / Europeiska Respiratory Society (ERS) standardkriterier12.
- Administrera 400 µg av inhalerad salbutamol från en uppmätt dos inhalator (MDI) genom en spacer enhet.
Obs: Hos vuxna, biverkningar av inhalerad salbutamol inkludera tremor och takykardi13. - Upprepa spirometri (FEV1 och FVC manöver) 15 min senare, enligt de ATS/ERS standardkriterier12.
- Beredning av ultraljud nebulisatorn
Obs: Nebulisatorn måste noggrant rengöras och desinfekteras före varje användning, i enlighet med tillverkarens anvisningar.- Fyll i nebulisatorn kammaren med destillerat vatten upp till den rekommenderade nivån.
- Placera en ren kopp i nebulisatorn kammaren.
- Täck bägaren med lämpliga locket.
- Fyll koppen med antingen 50 mL hyperton saltlösning (5%) för en patient med efter bronkdilaterare FEV1 > 65% förutspådde eller 50 mL isoton saltlösning (0,9%) för en patient med efter bronkdilaterare FEV1≤65% förutspådde.
- Lägga till 1.75 mL av salbutamol sulfat lösning (5 mg/mL) i koppen.
- Anslut rören och ventiler i enlighet med tillverkarens anvisningar.
- Nebulisering och sputum samling
Obs: Utföra tekniken under medicinsk övervakning.- Förklara proceduren för patienten.
- Be patienten att näsa klipp.
- Aktivera nebulisatorn och välj den lägsta nivån av aerosol och fläkt inställningar.
- Be patienten att andas in Aerosolen genom munnen lappa med tidvatten andning för 5 min.
Obs: Aerosol och fläkt inställningar kan ökas beroende på patientens tolerans.- Vid outhärdlig hosta eller illamående, avbryta förfarandet och gå till steg 1.3.5.
- Vid bröstet eller respiratoriska obehag, gå till steg 1.3.8.
- Stänga av nebulisatorn.
- Be patienten att ta bort näsklämman, skölja munnen med vatten och gurgla två gånger innan kasta den i diskhon.
Obs: Saliv celler kan förorena sputum provet och leda till en oanvändbar provet. - Be patienten att hosta upp slem i en plastbehållare.
- Utföra en spirometri (forcerad exspiratorisk manöver) för att mäta FEV1.
- Utvärdera FEV1 hösten enligt följande: (FEV1 mätt vid steg 3,8 [mL]) - (efter bronkdilaterare FEV1 mätt vid steg 1.3 [mL]) / (efter bronkdilaterare FEV1 mätt vid steg 1.3 [mL]) * 100.
- Om FEV1 sjunker med 20% eller mer från värdet efter bronkdilaterare, avbryta förfarandet. Mäter FEV1 igen 10 min senare. Om FEV1 faller 20% eller mer, be läkaren att administrera nebulized ipratropium banalitet (0,25 mg/2 mL) och hålla patienten under medicinsk övervakning. Gå till steg 1.3.10.
- Om FEV1 inte faller av 20% eller mer från värdet efter bronkdilaterare, upprepa steg 3,2-3,9 en till tre gånger att nå en total nebulisering tid på 10 till 20 min.
Obs: Den totala nebulisering tid beror på kvalitet (förekomst av pluggar eller trögflytande delar) och mängd av sputum provet. Om det provet kvalitet eller kvantitet är dålig efter 10 min av nebulisering, bör förfarandet utvidgas för att nå en total nebulisering tid 15-20 min.
- Hålla sputum provet i kylskåp fram till bearbetning.
2. sputum bearbetning
Obs: Bearbeta sputum inom 3 timmar efter provtagning för optimal cellernas viabilitet.
Försiktighet: Bär en labbrock, skyddshandskar och skyddsglasögon.
- Preliminära preparat
- Göra en 10-faldig utspädning av koncentrerad Ditiotreitol lösningen (mucolytic agent) med sterilt destillerat vatten för att erhålla 10 mL av en 6,5 mM lösning, i enlighet med tillverkarens anvisningar.
Obs: För att förhindra koncentrerad Ditiotreitol lösning blandas med luften, återkalla lösningen från injektionsflaskan med en steril spruta och nål. Öppnad injektionsflaskan med koncentrerad lösning måste vara vid rumstemperatur och används inom 5 dagar. Varje morgon serveras utspädd lösning.
Varning: På grund av fara för irritation av ögon och hud, Använd skyddsutrustning (kläder, handskar och skyddsglasögon). - Göra en 5-faldig utspädning av trypan blå lösningen (0,4%) med Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) att erhålla en 0,08% lösning. Förvara denna utspädda lösningen i rumstemperatur och Använd inom 2 veckor.
Varning: På grund av cancerogena risker, skyddsutrustning (kläder, handskar och skyddsglasögon).
- Göra en 10-faldig utspädning av koncentrerad Ditiotreitol lösningen (mucolytic agent) med sterilt destillerat vatten för att erhålla 10 mL av en 6,5 mM lösning, i enlighet med tillverkarens anvisningar.
- Samling av Sputum supernatanten
- Överför hela sputum i en 50 mL konisk botten plaströr och väger provet.
- Lägga till en 3-faldig vikt på DPBS lösning.
- Långsamt vortex provet för 30 s.
- Centrifugera vid 800 x g och 4 ° C i 10 min.
- Filtrera urvalet genom 2 enda lager av steril gasbinda och samla supernatanten i en 50 mL konisk botten plaströr.
- Alikvotens supernatanten i 2 mL plast rör och lagra dem vid-80 ° C.
Obs: Supernatant prover är användbara till assay sputum vätska fas komponenter.
- Sputum Mucolysis
- Om det behövs, lägga till cellpelleten att nå en total volym av cellsuspension av 5 mL DPBS.
- Späd cellsuspension med 1 volymdel 6,5 mM Ditiotreitol. Använd en bänk rocker till rock cellsuspensionen i 20 min i rumstemperatur.
- Upprepa minst 3 gånger med DPBS.
- Centrifugera utspädda cellsuspension på 550 x g och 4 ° C i 10 min.
- Bedöma och registrera den exakta volymen av cellsuspensionen.
- Tillsätt 50 µL cellsuspension i 50 µL av 0,08% trypan blå lösningen och homogenisera.
- Placera provet under täckglas av en hemocytometer (Thoma avdelningen) och placera det under det optiska mikroskopet (X 400).
- Räkna de skivepitelcancer cellerna, de levande icke-skivepiteltyp cellerna (ofärgade celler) och de döda icke-skivepitelcancer cellerna (blå färgade celler).
Obs: Vid för låg eller för hög cell densiteten, koncentrera sig eller späd cellsuspensionen och upprepa steg 2.4.1-2.4.3. - Bedöma cellkoncentrationen suspensionen, procentandelen av skivepitelcancer celler och procentandelen av icke-skivepiteltyp celler lönsamhet.
Obs: Beräkna den totala icke-skivepitelcancer cell count/g av sputum: cell koncentration av upphängning (steg 5,4) * volym av cellsuspensionen (steg 4,8) * % av icke-skivepiteltyp celler / vikt av sputum provet (steg 2.2.1).
Obs: Om cellsuspensionen innehåller mer än 80% Skivepitelcancer celler, provet anses dålig kvalitet och olämpligt för en cytospin bild14. I så fall, avbryta behandlingen och överväga detta prov misslyckade.
- Späd en alikvot av cellsuspensionen med DPBS att få minst 350 μl av en cellsuspension på 500 000 celler/mL.
- Montera cell anrikningsverket i enlighet med tillverkarens anvisningar.
- Fyll varje av de 3 fack av Platskoncentratorn cell med 100 µL av denna cellsuspension.
- I en cytocentrifuge, snurra för 2 min på 150 x g och rumstemperatur. Kassera supernatanterna.
- Demontera cell anrikningsverket i enlighet med tillverkarens anvisningar.
- Låt bilden luft torka.
Obs: I detta skede, kvarstående celler kan lagras i en tillräcklig buffert vid behov för ytterligare experiment. - Fläck i bilden med en kommersiell färgning kit (se Tabell för material), i enlighet med tillverkarens anvisningar.
- Montera bilden med en lämplig monteringsmedium och ett täckglas.
- Placera bilden under det optiska mikroskopet (600 X) med oljeimmersion.
- Räkna minst 500 icke-Skivepitelcancer celler: neutrofiler, eosinofiler, makrofager, lymfocyter och epitelceller.
Obs: Differential cell sammanräkning utförs vanligtvis av endast ett eller två dedikerade och tränade observatörer att begränsa interobserver avvikelser. - Spela in absoluta värden och procentsatser av varje celltyp.
Representative Results
Hemocytometer
En typisk bild visas i figur 1 som visualiseras med mikroskopet med hjälp av hemocytometer. Skivepitelcancer celler är lätt identifieras, eftersom de är mycket större än de icke-skivepitelcancer cellerna. Dessa Skivepitelcancer celler är epitelceller som kommer från munnen. Båda typerna av cellerna färgas av Trypan blå när döda. Försiktighet måste iakttas för att undvika räknar jäst, bakterier och skrot.
Figur 1 : Hemocytometer bilden visar (A), en levande icke-skivepitelcancer, (B) en döda icke-skivepitelcancer cell och (C) en skivepitelcancer cell. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Cytospin bild: figur 2 visar en representativ bild av en cytospin bild som erhållits efter sputum bearbetning. De olika celltyper (neutrofiler, eosinofiler, makrofager, lymfocyter och epitelceller) kan skiljas åt genom deras morfologi och färgning. I vissa fall förorening av skivepitelcancer celler kan vara viktigt och, om procentandelen av skivepitelcancer celler är större än 80%, provet anses misslyckad (figur 3).
Figur 2 : Cytospin bild bild visar (A) neutrofiler, (B) en makrofag, (C) en eosinofila, (D) en lymfocyter, och (E), en epitelial cell. Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Exempel på en dålig kvalitet cytospin bild med > 80% av skivepitelcancer celler. Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Framgång
I vår avdelning, andelen framgångsrika förfarandet (kombinera en framgångsrik induktion och en läsbar cytospin), baserad på ett urval av 1 129 patienter (friska försökspersoner, astmatiker eller KOL-patienter), är 82% (924/1 129). I en sub analys enligt vilken typ av patienter är framgång 75% (57/76) hos friska försökspersoner, 82% (827/1,004) hos astmatiker och 82% (40/49) hos KOL-patienter.
Resultaten hos friska
I en retrospektiv analys av en rad 289 friska försökspersoner från vår avdelning, medianen (interkvartilintervall) sputum vikt var 3.72 g (interkvartilintervall av 2.46 g - 5,54 g) och median total icke-skivepitelcancer cell count/g av sputum var 0,59 x 10 ()6 interkvartilintervall 0,37 x 106 - 1,29 x 106).
De friska, andelen Skivepitelcancer celler är låg på 19% (10% - 34%) och lönsamheten är hög på 66% (54-78%). Angående procentandelen av de olika celltyper, resultaten sammanfattas i figur 4A. Vi kan konstatera att andelen av makrofager (49% [31-68%]) är högre än andelen neutrofiler (34% [14% - 60%]), medan andelen lymfocyter (2% [1-3%]), eosinofiler (0% [0-0%]) och epitelceller (4% [2-11%]) är låga. Dessa resultat är liknande när data uttrycks i absoluta värden (figur 4B).
Figur 4 : Representativa resultat av differential cell räkningen observerades hos friska försökspersoner uttryckt som procentsatser som (A) eller (B) absoluta värden. Resultaten redovisas som median (interkvartilintervall). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Det är också viktigt att beakta åldern av patienter. Det är finns en stark korrelation mellan patientens ålder och andelen neutrofiler i sputum prover (figur 5). Likaså när klassificera patienter enligt åldersgruppar för 10 år (figur 6), observerat vi en betydande ökning av neutrofila procentsatsen med ökande ålder. Därför denna variabel måste beaktas när jämföra resultat från olika kohorter, och försiktighet måste iakttas i matchningen av ämnen.
Figur 5: Korrelation mellan ålder och sputum neutrofila procentsats. Korrelationen beräknades med Spearman test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Utvecklingen av neutrofila procentsatsen enligt ålderskategorin. P-värdet av ANOVA var < 0,0001 för jämförelse av neutrofila andel mellan klasser. Flera jämförelser har gjorts med Dunns flera jämförelser test. P-värdena representeras som följer: * p < 0,05, ** p < 0,01, och *** p < 0,001. Resultaten redovisas som median (interkvartilintervall). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Resultat hos patienter som lider av sjukdomar i andningsorganen
Tekniken med inducerad sputum är vanligaste att bedöma inflammatoriska celler profilen hos astmatiska patienter.Denna teknik kan också tillämpas på patienter som lider av kol, en annan inflammatorisk luftvägssjukdom. När man jämför friska försökspersoner, astmatiker och KOL-patienter (de 3 grupperna att vara matchade för ålder, kön och tobak vanor), observerade vi att inflammatoriska celler profilen är helt olika mellan dessa kohorter (figur 7). Faktiskt, astmatiska patienter kännetecknas vanligtvis av upphöjda sputum eosinofiler, medan andelen sputum neutrofiler är vanligtvis högre hos KOL-patienter jämfört med friska kontroller, som är kopplat till sjukdomens svårighetsgrad.
Figur 7 : Sputum inflammatoriska celler profil hos friska försökspersoner (n = 45), astmatiska patienter (n = 108), och KOL-patienter (n = 54). De tre grupperna var matchade för ålder, och tobak vanor. P-värdena för ANOVA var < 0,05, < 0,0001, och < 0,0001 för jämförelse av neutrofiler, eosinofiler och makrofager mellan grupper, respektive. Flera jämförelser har gjorts med Dunns flera jämförelser test. P-värdena representeras som följer: * p < 0,05 och *** p < 0,001. Resultaten redovisas som median (interkvartilintervall). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Metoden inducerad sputum är ett användbart verktyg att studera luftvägarna facket. I området i närheten finns det flera möjliga tillämpningar av denna teknik. Det första kan förbättra kunskapen om immunceller och mekanismer som är involverade i olika luftvägssjukdomar. Exempelvis denna teknik har tillåtit utredningen av inflammation i luftvägarna i stora kohorter av patienter, och det har visat att ungefär hälften av astmatiska patienter kännetecknas av en onormal luftvägarna eosinofil inflammation15, 16 , 17, medan KOL-patienter uppvisar vanligen upphöjda sputum neutrofiler räkna18. Denna teknik har också bidragit till bättre karakterisering av luftvägsinflammationer hos patienter med idiopatisk lungfibros och bevis medlare som kan bidra till denna sjukdom19. Andra kan tekniken med inducerad sputum vara användbart för att förutsäga behandlingssvaret. Förekomsten av en onormal andel av sputum eosinofiler har till exempel visat sig vara en prediktiv markör kortikosteroid lyhördhet11,18. I astma och kol visade skräddarsy dosen av kortikosteroider att normalisera procentandelen av sputum eosinofiler sig vara mer effektiva för att minska antalet exacerbationer än justera behandling enligt de aktuella kliniska riktlinjerna11 ,20,21. För det tredje, sputum analys kan hjälpa till att utveckla riktade terapier. Exempelvis har förekomsten av ett abnormt antal sputum neutrofiler i kol och vissa astmatiska patienter lett till utvecklingen av antineutrophilic behandlingar11. Fjärde, tekniken kan spela en roll i diagnos. Förekomsten av sputum eosinofili är exempelvis nödvändigt att göra en diagnos av icke-astmatiska eosinofil bronkit11.
Utöver att få en differential cell sammanräkning, gör tekniken inducera sputum också utförandet av många ytterligare analyser, genom att studera antingen sputum supernatant eller sputum celler. Med sputum supernatant exempel analys av medlare8,19,22 och bedömningen av provet för eosinofiler22kemotaktisk verksamhet. Från sputum celler, RNA kan extraheras och används för mikroRNA eller genuttrycket analyseras19,23 . Sputum cellerna kan också analyseras genom flödet flödescytometri9,23 som tillåter, bland andra immunophenotyping och sortering celler. Dessutom sputum celler kan vara odlade10, och deras medlare produktion kan vara mätt in vitro-24. Är det värt att notera att i detta fall är medlare innehållet skiljer sig från vad som kan hittas i sputum supernatant. Medlare i sputum supernatant kan faktiskt vara influerad av sekret från luftvägarna bosatt celler och plasma exsudation, tvärtemot den sputum cell kultur modell24. Immuncytokemi och i situ hybridisering kan slutligen också utföras med sputum celler7.
Inducerad sputum tekniken har vissa begränsningar. Induktionen måste utföras under medicinsk övervakning. Det är också viktigt för operatören att ge noggranna instruktioner till patienter. Andra begränsningar är samarbetet och medicinska tillståndet hos patienter, eftersom luftvägarna insatser behövs. När det gäller genomförbarheten av denna teknik i barn, flera studier har rapporterat att det var framgångsrik och trygg hos barn äldre än 6 år gammal25. Uppgifter om barn i < 6 år saknas25, men det är troligt att sputum induktion är svårt att utföra i dessa barn14. Tekniken är för närvarande begränsad forskning tjänster och specialiserade centra eftersom det är tekniskt krävande, tidskrävande och kräver utbildad personal1. En annan begränsning är att tekniken av sputum induktion och analys inte är alltid lyckas, vilket innebär att en läsbar cytospin inte alltid erhålls26. Framgång är dock vanligtvis runt 80% i olika kohorter av patienter4,26,27,28,29. Slutligen måste vara försiktig när man jämför olika kohorter av patienter avseende den matchande ålder som det visades att påverka sputum cell count30,31. Likaså har andra parametrar såsom kön och tobak vanor matchas som de kan också störa den sputum cell count29,32. När patienten matchningen inte är möjligt, är ett annat sätt att ta hänsyn till ålder, kön eller rökstatus att justera den statistiska analysen för dessa egenskaper.
Metoden inducerad sputum jämfört med andra tekniker som gör att samla celler från luftvägarna, som biopsier och bronkoalveolär lavages, och har fördelar av att vara enkel, väl tolererad, säker, reproducerbara, kostnadseffektiva och icke-invasiv. Dessa fördelar kan inducerad sputum tekniken ska utföras i stor skala och upprepade gånger över tid och göra det ett alternativ i valet för luftvägarna provtagning. Bronchosorption är en annan teknik som möjliggör insamling av slemhinna slemhinnan vätskan för att bedöma luftväg medlare33. Även denna teknik (kräver bronkoskopi) är mer invasiv än inducerad sputum, har fördelarna med att undvika någon kontamination med saliv och att erhålla högre koncentrationer av mediatorer än i bronkoalveolär lavage33.
Kritiska steg behöver uppmärksamhet i protokollet. Först, måste försiktighet iakttas om saline koncentrationen och induktion, eftersom dessa två parametrar kan påverka resultaten och måste därför vara standardiserade34,35. Andra är mucolysis med DTT ett viktigt steg för behandlingen. Jämfört med PBS visades DTT att bättre skingra slem celler7, vilket förbättrar cytopsin bild kvaliteten och är viktigt att ha en reproducerbar cell count2. Mucolytic agenten kan dock störa mätningen av biokemiska komponenter.Tillsatta experiment bör då utföras vid mätning en ny biokemiska sammansatta36. Slutligen är ett annat viktigt steg av förfarandet cellen räknar steg som måste utföras av en utbildad tekniker att säkerställa tillförlitlig och tolkningsbara resultat.
En alternativ metod med slem pluggar (klibbig eller tätare delar), i stället för hela sputum, beskrivs också i den litteratur7. Båda teknikerna har fördelar och nackdelar. Hela sputum tekniken tillåter snabbare bearbetning7, men är ofta förorenade med saliv, vilket späder ut provet och kan minska kvaliteten på cytospins2,7. Med plug urval teknik reduceras saliv föroreningen, vilket innebär att prover är ofta av bättre kvalitet för dosering av vätska fas mediatorer och cytospin bilder7. Behandlingen är dock längre7 och markerade kontakter kan inte är representativa för hela provet37. Det är också värt att notera att inte alla prover som innehåller pluggar, som kan vara begränsande. Båda metoderna har validerats och reproducerbara, och det finns för närvarande inga bevis att differential cell räkningarna från båda dessa metoder är olika14,38.
I framtiden, skulle inducerad sputum kunna användas som ett kliniskt verktyg för att ge biomarkörer för utredning, diagnos och hantering av alla typer av inflammatoriska luftvägssjukdomar.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av universitet sjukhus Lièges (CHU Liege). Vi erkänner ”ögonblickar productions” för video produktion. Vi erkänner också Cedric François, patienten som dök upp i filmen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spirometer - Spirobank | MIR France | ||
| Salbutamol MDI - Ventolin | GLAXOSMITHKLINE | CNK: 0135-913 | See drug available in the country |
| Nebulizer UltraNeb | DeVilbiss Healthcare USA | UltraNeb U3000 | |
| Devilbiss UltraNeb Disposable Cups & Lids | DeVilbiss Healthcare USA | 100HD-647 | |
| DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers | DeVilbiss Healthcare USA | 1001005879 | |
| One-way Valves | Hudson RCI USA | 41664 | |
| One-way Valves | Hudson RCI USA | 41665 | |
| Aerosol T-connector | Hudson RCI USA | 41077 | |
| Ventilation circuit monobranch corrugated | Int'Air Medical France | TA30A | |
| NaCl 5 % | / | / | Produced by our hospital pharmacy |
| Mini-Plasco NaCl 0.9% | B.Braun Medical Diegem Belgium | ||
| Salbutamol sulfate 5 mg/mL - Ventolin | GLAXOSMITHKLINE | CNK: 0094-987 | See drug available in the country |
| Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL - Atrovent | Boehringer Ingelheim Germany | CNK: 1543-305 | See drug available in the country |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | LONZA Belgium | BE17512F | |
| Sputolysin reagent | Calbiochem | 56000 | |
| Trypan blue 0.4% solution 100 mL | LONZA Bio Whittaker Belgium | 17-942E | |
| Hemocytometer - Thoma chamber | Labor Optik Lancing UK | 1500000 | |
| Hemacolor Stainig set | Merck Belgium | 1116610001 | Alternative product : Diff Quik Staining Set Medion Diagnostic |
| Mounting medium - Entellan | Merck Belgium | 107960 | |
| Statspin Cytofuge 12 | Beckman Coulter Belgium | X00-003066-001 |
References
- Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice. European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).
- Pavord, I. D., Pizzichini, M. M., Pizzichini, E., Hargreave, F. E. The use of induced sputum to investigate airway inflammation. Thorax. 52 (6), 498-501 (1997).
- Leigh, T. R., et al. Sputum induction for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. The Lancet. 334 (8656), 205-206 (1989).
- Pin, I., et al. Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma. Thorax. 47 (1), 25-29 (1992).
- Pizzichini, M. M. M., Leigh, R., Djukanović, R., Sterk, P. J.
- Delvaux, M., et al. Nebulised salbutamol administered during sputum induction improves bronchoprotection in patients with asthma. Thorax. 59 (2), 111-115 (2004).
- Efthimiadis, A., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 19s-23s (2002).
- Kelly, M., et al. Analysis of fluid-phase mediators. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 24s-39s (2002).
- Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
- Vignola, A. M., et al.
- Brightling, C. E. Clinical applications of induced sputum. Chest. 129 (5), 1344-1348 (2006).
- Miller, M. R. Standardisation of spirometry. European Respiratory Journal. 26 (2), 319-338 (2005).
- Global Initiative for Asthma (GINA) Global Strategy for Asthma Management and Prevention. , http://www.ginasthma.org/ (2017).
- Szefler, S. J., et al. Asthma outcomes: biomarkers. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3 Suppl), S9-S23 (2012).
- Douwes, J., Gibson, P., Pekkanen, J., Pearce, N. Non-eosinophilic asthma: importance and possible mechanisms. Thorax. 57 (7), 643-648 (2002).
- Schleich, F. N., et al. Importance of concomitant local and systemic eosinophilia in uncontrolled asthma. The European Respiratory Journal. 44 (1), 97-108 (2014).
- Demarche, S., et al. Detailed analysis of sputum and systemic inflammation in asthma phenotypes: are paucigranulocytic asthmatics really non-inflammatory? BMC pulmonary medicine. 16, 46 (2016).
- Pavord, I. D., et al. Clinical applications of assessment of airway inflammation using induced sputum. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 40s (2002).
- Guiot, J., Henket, M., Corhay, J. L., Moermans, C., Louis, R. Sputum biomarkers in IPF: Evidence for raised gene expression and protein level of IGFBP-2, IL-8 and MMP-7. PLOS ONE. 12 (2), e0171344 (2017).
- Green, R. H., et al. Asthma exacerbations and sputum eosinophil counts: a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9347), 1715-1721 (2002).
- Siva, R., et al. Eosinophilic airway inflammation and exacerbations of COPD: a randomised controlled trial. European Respiratory Journal. 29 (5), 906-913 (2007).
- Louis, R., et al. Cell infiltration, ICAM-1 expression, and eosinophil chemotactic activity in asthmatic sputum. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 466-472 (1997).
- Maes, T., et al. Asthma inflammatory phenotypes show differential microRNA expression in sputum. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1433-1446 (2016).
- Moermans, C., et al. Local and systemic cellular inflammation and cytokine release in chronic obstructive pulmonary disease. Cytokine. 56 (2), 298-304 (2011).
- Gibson, P. G., et al. Sputum induction in children. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 44s-46s (2002).
- Reddel, H. K., et al. An Official American Thoracic Society/European Respiratory Society Statement: Asthma Control and Exacerbations: Standardizing Endpoints for Clinical Asthma Trials and Clinical Practice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 180 (1), 59-99 (2009).
- Duncan, C. J. A., Lawrie, A., Blaylock, M. G., Douglas, J. G., Walsh, G. M. Reduced eosinophil apoptosis in induced sputum correlates with asthma severity. The European Respiratory Journal. 22 (3), 484-490 (2003).
- Demarche, S. F., et al. Asthma Control and Sputum Eosinophils: A Longitudinal Study in Daily Practice. The Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 5 (5), 1335-1343 (2017).
- Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2 Pt 1), 475-478 (2000).
- Brooks, C. R., Gibson, P. G., Douwes, J., Dalen, C. J. V., Simpson, J. L. Relationship between airway neutrophilia and ageing in asthmatics and non-asthmatics: Airway neutrophilia and ageing. Respirology. 18 (5), 857-865 (2013).
- Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
- Chalmers, G. W., et al. Smoking and airway inflammation in patients with mild asthma. Chest. 120 (6), 1917-1922 (2001).
- Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma: Increased Interferons (IFN-γ and IFN-λ) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. 19, 128-138 (2017).
- Popov, T. A., et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis). European Respiratory Journal. 8 (4), 559-565 (1995).
- Holz, O., et al. Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days. Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).
- Louis, R., et al. The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum. European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).
- Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects. American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
- Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination. The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).
