Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Methodologie voor Sputum inductie en laboratorium Processing

Published: December 17, 2017 doi: 10.3791/56612
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Respiratory Medicine, CHU Liege, GIGA I3 Research Group, University of Liege, 2Department of Clinical Pharmacy, CIRM (Center for Interdisciplinary Research on Medicines), University of Liege
* These authors contributed equally

Summary

Hier beschrijven we de techniek van sputum inductie. Dit protocol legt ook uit het sputum verwerking voor het uitvoeren van een telling van de differentiële cel en voor het verzamelen van sputum supernatant en cellen voor verdere analyse.

Abstract

De techniek van sputum inductie en verwerking is een erkende niet-invasieve methode waardoor het verzamelen en analyseren van de cellen van de luchtwegen, die interessant is in verschillende respiratoire aandoeningen zoals astma, chronische obstructieve longziekte (COPD), chronische hoest, of idiopathische longfibrose. Deze techniek is goed getolereerd, veilig en niet-invasieve, maar is momenteel beperkt tot onderzoeksservices en gespecialiseerde centra in de klinische praktijk, omdat het technisch veeleisende en tijdrovende, en opgeleid personeel vereist. Het slagingspercentage van sputum inductie en analyse is ongeveer 80%.

Hier beschrijven we de inductie en laboratorium verwerking van sputum monsters. Sputum wordt geïnduceerd door inademing hypertonic of isotone zoutoplossing met salbutamol. Voor de verwerking gebruiken we de hele sputum-techniek. Dithiothreitol (DTT) wordt gebruikt om mucolysis van sputum monsters. Het primaire doel van sputum verwerking is te verkrijgen van een aantal van de differentiële cel om te bestuderen van de celtypes aanwezig in de luchtweg lumen. Aanvullende analyses kunnen ook op sputum supernatant en sputum cellen, die verder onderzoek naar inflammatoire processen en immuun mechanismen kunnen worden uitgevoerd. Voorbeelden van bemiddelaars/mediators in sputum supernatant bestuderen en uitvoeren van een groot spectrum van analyse op sputum cellen zoals stroom cytometry genomics en proteomics.

Ten slotte, representatieve resultaten van sputum analyse in gezonde controles, asthma en COPD patiënten worden gepresenteerd.

Introduction

Verschillende methoden zijn gebruikt om de onderzoeken van de luchtweg ontsteking: directe metingen (zoals bronchiale biopsieën of bronchoalveolar lavages) en indirecte methoden (zoals symptoom evaluatie, bloed monster analyse en Long functie test)1. De directe technieken hebben het voordeel dat het betrouwbare beoordeling van de ontsteking van de luchtwegen, maar ze zijn invasieve en niet haalbaar op grote schaal vanwege patiënt ongemak en het risico gemaakte1. Wat betreft de indirecte methoden correleren zij slecht met de directe beoordeling van de luchtweg ontsteking1.

Sputum-collectie is een andere manier naar monster cellen van de luchtwegen en laat de directe beoordeling van ontsteking van de luchtwegen. Echter het produceren van sputum spontaan kan leiden tot monsters van slechte kwaliteit en is niet mogelijk voor alle patiënten2. Dit probleem is verholpen met behulp van corrosiebestendige nebulized hypertonic saline ertoe het sputum productie2. Deze methode werd aanvankelijk gebruikt bij patiënten besmet met humaan immunodeficiëntie virus (HIV) voor de diagnose van Pneumocystis carinii pneumonie3 en werd aangepast voor gezonde proefpersonen en astmapatiënten in 19924. Sputum-inductie is ook haalbaar in meer ernstige patiënten met behulp van isotone zoutoplossing5. Hoewel over het algemeen goed verdragen, kan het inademen zoutoplossing bronchospasme bij patiënten met hyperresponsive airways5kan veroorzaken. Daarom is het aanbevolen om het beheren van een korte-acteren Bèta agonist vóór de procedure1. Wij hebben bovendien eerder getoond dat salbutamol toe te voegen aan de zoutoplossing in de ultrasone vernevelaar verder dit risico6 daalde. De voordelen van sputum inductie is dat er niet-invasieve2 en veilig wanneer passende voorzorgen zijn genomen5.

Voor de verwerking van sputum monsters, de twee methoden worden momenteel gebruikt in de literatuur: de hele sputum-techniek en de plug selectie7. In ons laboratorium, wordt de hele sputum techniek uitgevoerd. Het primaire doel van sputum verwerking is te verkrijgen van een aantal van de differentiële cel om te bestuderen van het type ontsteking aanwezig in de luchtweg lumen. Veel aanvullende analyses zijn echter ook mogelijk om andere te onderzoeken inflammatoire processen en immuun mechanismen, ofwel door het bestuderen van bemiddelaars/mediators in het sputum supernatant8 of door het uitvoeren van gedetailleerde onderzoek van sputum cellen (bv , stroom cytometry9cel culturen10genomics10, proteomics10, immunocytochemie7, in situ hybridisatie7, enz.)

De techniek van sputum inductie en analyse is momenteel beperkt tot het onderzoek van diensten en gespecialiseerde centra in de klinische praktijk, omdat het technisch veeleisende en tijdrovende, en opgeleid personeel1vereist. Deze methode voor verschillende respiratoire aandoeningen zoals astma, chronische obstructieve longziekte (COPD), chronische hoest of idiopathische longfibrose11kan ontsteking van de luchtwegen worden onderzocht.

Protocol

Alle methoden die worden beschreven in deze sectie zijn goedgekeurd door de ethische commissie van het ziekenhuis van de Universiteit van Luik en alle gezonde proefpersonen gaf schriftelijke geïnformeerde toestemming voor deelname.

1. sputum inductie

  1. Pre-en post bronchodilatator spirometrie
    1. Uitvoeren van een spirometrie (gedwongen expiratoire volume in 1 seconde [FEV1] en Geforceerde vitale capaciteit [FVC] manoeuvre) volgens de American Thoracic Society (ATS) / Europese Respiratory Society (ERS) standaardcriteria12.
    2. Het beheren van 400 µg van geïnhaleerde salbutamol vanaf een dosis inhalator (MDI) via een spacer-apparaat.
      Opmerking: Bij volwassenen, ongewenste voorvallen van geïnhaleerde salbutamol omvatten tremor en tachycardie13.
    3. Spirometrie (FEV1 en FVC-manoeuvre) 15 min later opnieuw, volgens de criteria van de kwaliteitsnorm ATS/ERS12.
  2. Voorbereiding van de ultrasone vernevelaar
    Opmerking: De vernevelaar worden grondig gereinigd en ontsmet vóór elk gebruik, overeenkomstig de instructies van de fabrikant.
    1. Vul de vernevelaar kamer met gedestilleerd water tot op het aanbevolen niveau.
    2. Plaats een schoon kopje in de vernevelaar zaal.
    3. Dekking van de cup met de passende deksel.
    4. Vul de beker met beide 50 mL hypertonic zoutoplossing (5%) voor een patiënt met post bronchodilatator FEV1 > 65% voorspeld of 50 mL isotonische zoutoplossing (0,9%) voor een patiënt met post bronchodilatator FEV1≤65% voorspeld.
    5. Voeg 1,75 mL van salbutamol sulfaat-oplossing (5 mg/mL) toe aan de cup.
    6. Sluit de buizen en kleppen overeenkomstig de instructies van de fabrikant.
  3. Nebulization en sputum collectie
    Opmerking: Voer de techniek onder medisch toezicht.
    1. Leg de procedure uit aan de patiënt.
    2. Vraag de patiënt om een neus-clip gebruikt.
    3. De vernevelaar inschakelen en selecteren van het laagste niveau van aërosol en fan instellingen.
    4. Vraag de patiënt om te ademen van het aërosol via het mondstuk met tidal ademhaling voor 5 min.
      Opmerking: Instellingen Aerosol en ventilator kunnen worden verhoogd afhankelijk van de tolerantie van de patiënt.
      1. In geval van ondraaglijke hoest of misselijkheid, de procedure staken en ga naar stap 1.3.5.
      2. In het geval van benauwdheid of respiratoire ongemak, gaat u naar stap 1.3.8.
    5. De vernevelaar uitschakelen.
    6. Vraag de patiënt de neus clip verwijderen, zijn mond met water spoelen en gorgelen tweemaal voordat het in de gootsteen te verwijderen.
      Opmerking: Speeksel cellen kunnen besmetten het sputum monster en leiden tot een onbruikbaar monster.
    7. Vraag de patiënt te hoesten van sputum in een kunststoffles.
    8. Een spirometrie (geforceerde expiratoire manoeuvre) voor het meten van FEV1uit te voeren.
    9. Evalueren van de FEV1 val als volgt: (FEV1 gemeten bij stap 3.8 [mL]) - (na bronchodilatator FEV1 gemeten bij stap 1.3 [mL]) / (na bronchodilatator FEV1 gemeten bij stap 1.3 [mL]) * 100.
      1. Als de FEV1 door 20% of meer van de waarde na bronchodilatator valt, staken de procedure. Maatregel FEV1 weer 10 min later. Als de FEV1 20% of meer valt, vraag de arts beheren nebulized ipratropium bromide (0,25 mg/2 mL) en houden de patiënt onder medische observatie. Ga naar stap 1.3.10.
      2. Als de FEV1 niet met 20% of meer van de waarde na bronchodilatator valt, herhaalt u stap 3.2 tot en met 3.9 één tot drie keer tot een tijd van de totale nebulization van 10 tot 20 min.
        Opmerking: De tijd van de totale nebulization zal afhangen van kwaliteit (aanwezigheid van stekkers of visceuze delen) en de hoeveelheid van het monster sputum. Als het monster kwaliteit en/of de hoeveelheid slecht is na 10 min van nebulization, moet de procedure worden uitgebreid tot een totale nebulization tijd van 15 tot 20 min te bereiken.
    10. Houd het sputum monster gekoeld tot verwerking.

2. sputum Processing

Opmerking: Verwerken het sputum binnen 3 uur van bemonstering voor de levensvatbaarheid van de optimale cellen.

Let op: Draag een laboratoriumjas, beschermende handschoenen en bril.

  1. Voorlopige preparaten
    1. Maak een 10-fold verdunning van de geconcentreerde dithiothreitol oplossing (slijmoplossende agent) met steriel gedistilleerd water te verkrijgen van 10 mL van de oplossing van een 6.5 mM, overeenkomstig de instructies van de fabrikant.
      Opmerking: Om te voorkomen dat geconcentreerde dithiothreitol oplossing mengen met de buitenlucht, trekken de oplossing uit de flacon met een steriele spuit en naald. Eenmaal geopend, moet de ampul geconcentreerde oplossing worden bewaard bij kamertemperatuur en gebruikt binnen 5 dagen. De verdunde oplossing is dagelijks bereid.
      Let op: Wegens gevaar voor ogen en huid irritatie, Draag beschermende uitrusting (kleding, handschoenen en bril).
    2. Maak een 5-fold verdunning van de oplossing van de trypan blauw (0,4%) met de Dulbecco Phosphate-Buffered zout (DPBS) te verkrijgen van een 0,08% oplossing. Bewaar deze verdunde oplossing bij kamertemperatuur en gebruik binnen 2 weken.
      Let op: Vanwege de gevaren van het kankerverwekkende, Draag beschermende uitrusting (kleding, handschoenen en bril).
  2. Collectie van Sputum Supernatant
    1. Breng de hele sputum in een conische bodem van de kunststof tube van 50 mL en wegen van het monster.
    2. Een 3-voudig gewicht van DPBS oplossing toe te voegen.
    3. Langzaam vortex het monster voor 30 s.
    4. Centrifugeer bij 800 x g en 4 ° C gedurende 10 minuten.
    5. Filteren van het monster door 2 enkele lagen van steriel gaas en het verzamelen van de bovendrijvende substantie in een conische bodem van de kunststof tube van 50 mL.
    6. Aliquot het supernatant in 2 mL kunststof buizen en bewaar ze bij-80 ° C.
      Opmerking: Supernatant monsters zijn handig voor de gehaltebepaling van sputum vloeibare fase onderdelen.
  3. Sputum-Mucolysis
    1. Indien nodig, voegt u DPBS toe aan de cel pellet tot een totaal volume van celsuspensie van 5 mL.
    2. Verdun de celsuspensie met 1 deel 6.5 mM dithiothreitol. Gebruik een bankje rocker Rock van de celsuspensie gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
      1. Ten minste 3 keer herhalen met DPBS.
    3. Centrifugeer het verdunde celsuspensie bij 550 x g- en 4 ° C gedurende 10 minuten.
Verwijder het supernatant.
  • Resuspendeer de pellet cel in ongeveer 1 mL van DPBS.
  • Beoordeling van kwalitatieve eigenschappen van het monster van sputum (cel concentratie squamous cell besmetting en levensvatbaarheid door Trypan Blue uitsluiting methode) door hemocytometer graaf
    1. Beoordelen en vastleggen van het exacte volume van de celsuspensie.
    2. 50 µL celsuspensie toevoegen aan 50 µL van de 0,08% trypan blauwe oplossing en meng.
    3. Zet het monster onder het dekglaasje aan van een hemocytometer (Thoma kamer) en plaats deze onder de optische Microscoop (400 X).
    4. Tellen de squamous cellen, de levende niet-squamous cellen (ongekleurde cellen) en de dood niet-squamous cellen (blauw gekleurde cellen).
      Opmerking: In geval van een te lage of te hoge celdichtheid, concentreren of verdunnen van de celsuspensie en herhaalt u stappen 2.4.1-2.4.3.
    5. De concentratie van de cel van de schorsing, het percentage squamous cellen, en het percentage van de levensvatbaarheid van niet-squamous cellen te beoordelen.
      Opmerking: Berekening van de totale niet-squamous cell count/g van sputum: cel van de concentratie van de ophanging (stap 5.4) * volume van de celsuspensie (stap 4.8) * % van de niet-squamous cellen / gewicht van het monster van sputum (stap 2.2.1).
  • Voorbereiding van een gekleurd cytospin dia met de celsuspensie en opslag van de resterende cellen, indien nodig
    Opmerking: Als de celsuspensie bevat meer dan 80% squamous cellen, het monster wordt beschouwd armen kwaliteit en ongeschikt voor een cytospin dia14. In dat geval stoppen van de verwerking en overwegen dit voorbeeld mislukt.
    1. Verdun een aliquoot gedeelte van de celsuspensie met DPBS te verkrijgen van ten minste 350 µL van een celsuspensie op 500.000 cellen/mL.
    2. Het monteren van de concentrator cel overeenkomstig de instructies van de fabrikant.
    3. Vul elk van de 3 compartimenten van de concentrator cel met 100 µL van deze celsuspensie.
    4. In een cytocentrifuge, spin voor 2 min op 150 x g en kamertemperatuur. Gooi het supernatant.
    5. Demonteren van de concentrator cel overeenkomstig de instructies van de fabrikant.
    6. Laat de dia in de lucht droog.
      Opmerking: In dit stadium, resterende cellen kunnen worden opgeslagen in een voldoende buffer indien nodig voor verdere experimenten.
    7. Vlek de dia met een commerciële kleuring kit (Zie de Tabel van materialen), overeenkomstig de instructies van de fabrikant.
    8. Monteer de dia met een geschikte montage medium en een cover slip.
    9. Plaats de dia onder de optische Microscoop (600 X) met olie-immersie.
    10. Ten minste 500 niet-squamous cellen tellen: neutrofielen, eosinofielen, macrofagen, lymfocyten en epitheliale cellen.
      Opmerking: Differentiële cellen wordt meestal uitgevoerd door slechts één of twee dedicated en opgeleide waarnemers te beperken interobserver verschillen.
    11. Record absolute waarden en percentages van elk celtype.

    • Representative Results

    Hemocytometer
    Een typisch beeld is afgebeeld in Figuur 1 , die is gevisualiseerd met de microscoop met behulp van de hemocytometer. Squamous cellen zijn gemakkelijk geïdentificeerd, zoals ze veel groter dan de niet-squamous cellen zijn. Deze squamous cellen zijn epitheliale cellen komen uit de mond. Beide soorten cellen worden gekleurd door Trypan Blue wanneer dode. Voorzichtigheid moet worden genomen om te voorkomen dat het tellen van de gist, bacteriën en schroot.

    Figure 1
    Figuur 1 : Hemocytometer afbeelding van (A) een levende niet-squamous cell, (B) een dood niet-squamous cell, en (C) een squamous cell. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Cytospin dia: afbeelding 2 ziet u een representatief beeld van een cytospin-dia verkregen na sputum verwerking. De verschillende soorten cellen (neutrofiele granulocyten, eosinofielen, macrofagen, lymfocyten en epitheliale cellen) kunnen worden gedifferentieerd door middel van hun morfologie en kleuring. In sommige gevallen besmetting door squamous cellen van belang kan zijn en, als het percentage squamous cellen groter is dan 80%, het monster wordt beschouwd als een mislukte (Figuur 3).

    Figure 2
    Figuur 2 : Cytospin dia afbeelding van (A) een neutrofiele, (B) een macrofaag, (C) een eosinophil, (D) een lymfocyt, en (E) een epitheliale cellen. Schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Figure 3
    Figuur 3 : Voorbeeld van een slechte kwaliteit cytospin dia met > 80% van squamous cellen. Schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Slagingspercentage
    In onze afdeling, het slagingspercentage van de procedure (combinatie van een succesvolle inductie en een leesbare cytospin), op basis van een steekproef van 1,129 patiënten (gezonde proefpersonen, astmapatiënten of COPD patiënten), 82% (924/1,129). In een sub-analyse volgens het type van patiënten is het slagingspercentage 75% (57/76) bij gezonde proefpersonen, 82% (827/1,004) in astmapatiënten en 82% (40/49) bij COPD patiënten.

    Resultaten in gezonde proefpersonen
    In een retrospectieve analyse van een reeks van 289 gezonde proefpersonen van onze afdeling, de mediaan (interkwartielafstand) sputum woog 3,72 g (interkwartielafstand voor 2,46 g - 5,54 g) en de gemiddelde totale niet-squamous cell count/g van sputum was 0.59 x 10 (van de6 Interkwartielafstand 0.37 x 106 - 1,29 x 106).

    In deze gezonde proefpersonen, het aandeel van squamous cellen is laag op 19% (10% - 34%) en de levensvatbaarheid is hoog op 66% (54-78%). Ten aanzien van het percentage van de verschillende soorten cellen, worden de resultaten samengevat in figuur 4A. We kunnen constateren dat het percentage van de macrofagen (49% [31-68%]) is hoger dan het percentage van neutrofiele granulocyten (34% [14% - 60%]), terwijl de percentages van lymfocyten (2% [1-3%]), eosinofielen (0% [0 tot 0%]) en de epitheliale cellen (4% [2-11%]) zijn laag. Deze resultaten zijn vergelijkbaar wanneer gegevens worden uitgedrukt in absolute waarden (figuur 4B).

    Figure 4
    Figuur 4 : Representatieve resultaten van de telling van de differentiële cel waargenomen bij gezonde proefpersonen uitgedrukt als percentages (A) of (B) absolute waarden. Resultaten worden weergegeven als de mediaan (interkwartielafstand). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Het is ook belangrijk rekening te houden met de leeftijd van de patiënten. Inderdaad, een sterke correlatie bestaat tussen de leeftijd van de patiënt en het aantal neutrofielen in sputum monsters (Figuur 5). Ook bij de indeling van patiënten volgens 10 jaar leeftijdsgroepen (Figuur 6), zien we een aanzienlijke toename van de neutrofiele percentage met toenemende leeftijd groep. Daarom deze variabele moet worden beschouwd wanneer het vergelijken van resultaten uit verschillende cohorten en voorzichtigheid moet worden genomen in de onderlinge afstemming van onderwerpen.

    Figure 5
    Figuur 5: Correlatie tussen leeftijd en sputum neutrofiele percentage. De correlatie is berekend met de Spearman-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Figure 6
    Figuur 6: Evolutie van de neutrofiele percentage volgens de leeftijdscategorie. De p-waarde van ANOVA was < 0,0001 voor het vergelijken van neutrofiele percentage tussen leeftijdsklassen. Meerdere vergelijkingen werden gemaakt met Dunns meerdere vergelijkingen test. De p-waarden zijn als volgt vertegenwoordigd: * p < 0,05, ** p < 0,01, en *** p < 0,001. Resultaten worden weergegeven als de mediaan (interkwartielafstand). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Resultaten in patiënten die lijden aan aandoeningen van de luchtwegen
    De techniek van geïnduceerde sputum wordt vaak gebruikt ter beoordeling van het profiel van de inflammatoire cel bij astmatische patiënten.Deze techniek kan ook worden toegepast op patiënten die lijden aan COPD, een andere inflammatoire respiratoire aandoeningen. Bij het vergelijken van gezonde proefpersonen, asthma en COPD patiënten (de 3 groepen wordt aangepast voor leeftijd, geslacht en gewoonten van de tabak), vastgesteld we hebben dat het profiel van de inflammatoire cel verschilt sterk tussen deze cohorten (Figuur 7). Inderdaad, astmatische patiënten worden meestal gekenmerkt door verhoogde sputum eosinofielen, terwijl het aandeel van sputum neutrofielen meestal hoger bij COPD patiënten in vergelijking met gezonde controles is, die is gekoppeld aan de ernst van de ziekte.

    Figure 7
    Figuur 7 : Sputum inflammatoire cel Profiel van gezonde proefpersonen (n = 45), astmatische patiënten (n = 108), en COPD patiënten (n = 54). De drie groepen waren overeen met geslacht, leeftijd en tabak gewoonten. De p-waarden van ANOVA werden < 0,05, < 0,0001, en < 0,0001 voor het vergelijken van neutrofiele granulocyten, eosinofielen en macrofagen tussen groepen, respectievelijk. Meerdere vergelijkingen werden gemaakt met Dunns meerdere vergelijkingen test. De p-waarden zijn als volgt vertegenwoordigd: * p < 0,05 en *** p < 0,001. Resultaten worden weergegeven als de mediaan (interkwartielafstand). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Discussion

    De geïnduceerde sputum-methode is een nuttig instrument om te studeren het compartiment van de luchtwegen. Er zijn meerdere mogelijke toepassingen van deze techniek. Eerst, kan het verbeteren van kennis over immuuncellen en mechanismen die betrokken zijn bij verschillende aandoeningen van de luchtwegen. Bijvoorbeeld, deze techniek heeft het onderzoek van de luchtweg ontsteking in grote cohorten van patiënten toegestaan, en het heeft aangetoond dat ongeveer de helft van astmatische patiënten worden gekenmerkt door een abnormale airway eosinofiel ontsteking15, 16 , 17, terwijl COPD patiënten vertonen meestal een verhoogde sputum neutrofiele tellen18. Deze techniek heeft ook bijgedragen aan betere karakterisering van luchtweg ontsteking bij patiënten met idiopathische longfibrose en bewijs bemiddelaars die aan deze ziekte19 bijdragen kunnen. Ten tweede, de techniek van geïnduceerde sputum kan zinvol te voorspellen reactie op behandeling. Bijvoorbeeld, de aanwezigheid van een abnormale percentage van sputum eosinofielen gebleken te zijn van een voorspellende marker van corticosteroïd responsiviteit11,18. In astma en COPD, werd aanpassing van de dosis van corticosteroïden te normaliseren van het percentage van sputum eosinofielen getoond om meer effectief in het verminderen van het aantal exacerbaties dan het aanpassen van de behandeling volgens de huidige klinische richtlijnen11 2120, ,. Ten derde, sputum analyse kan bijdragen tot het ontwikkelen van gerichte therapieën. Bijvoorbeeld, heeft de aanwezigheid van een abnormaal aantal sputum neutrofielen in COPD en sommige astmatische patiënten geleid tot de ontwikkeling van antineutrophilic behandelingen11. Ten vierde, de techniek kan spelen een rol in diagnose. Bijvoorbeeld, is de aanwezigheid van sputum eosinofilie nodig om een diagnose van niet-astmatische eosinofiel bronchitis11.

    Naast het verkrijgen van een gedifferentieerde cel telling, de techniek van het inducerende sputum ook toe de prestaties van veel extra analyses, door het bestuderen van sputum bezinken of sputum cellen. Voorbeelden met sputum supernatant zijn de analyse van bemiddelaars/mediators8,19,22 en de beoordeling van de Chemotactische activiteit van het monster voor eosinofielen22. Uit sputum cellen, RNA kan worden geëxtraheerd en kan worden gebruikt voor microRNA of genexpressie analyseert19,23 . De cellen van sputum kunnen ook door stroom cytometry9,23 waarmee, o.a. immunophenotyping en sorteren van cellen worden geanalyseerd. Bovendien, sputum cellen kunnen gekweekte10, en hun productie bemiddelaar kan worden gemeten in vitro24. Het is vermeldenswaard dat in dit geval, de inhoud van de bemiddelaar is verschillend van wat kan worden gevonden in sputum bezinken. Bemiddelaars in sputum supernatant kunnen inderdaad, worden beïnvloed door afscheidingen uit resident cellen van de luchtwegen en plasma afscheiding, in tegenstelling tot de sputum cel cultuur model24. Ten slotte kan immunocytochemie en in situ hybridisatie ook worden uitgevoerd met behulp van sputum cellen7.

    De geïnduceerde sputum techniek kent een aantal beperkingen. De inductie moet onder medisch toezicht worden uitgevoerd. Het is ook essentieel voor de exploitant om grondige instructies aan patiënten geven. Andere beperkingen omvatten de samenwerking en de medische conditie van patiënten, zoals respiratoire inspanningen nodig zijn. Met betrekking tot de haalbaarheid van deze techniek bij kinderen, verschillende studies hebben gemeld dat het was succesvol en veilig bij kinderen ouder dan 6 jaar oud25. Gegevens over kinderen van < 6 jaar ontbreken25, maar het is waarschijnlijk dat sputum inductie is moeilijk uit te voeren in die kinderen14. De techniek is momenteel beperkt tot het onderzoek van diensten en gespecialiseerde centra, omdat het technisch veeleisende en tijdrovende, en het vereist opgeleid personeel1. Een andere beperking is dat de techniek van sputum inductie en analyse niet altijd succesvol is, wat betekent dat een leesbaar cytospin26niet altijd is verkregen. Het slagingspercentage is echter meestal ongeveer 80% in de verschillende cohorten van patiënten4,26,27,28,29. Tot slot moet voorzichtigheid worden genomen bij het vergelijken van de verschillende cohorten van patiënten met betrekking tot de onderlinge afstemming van leeftijd zoals het bleek om de impact van de sputum cel tellen30,31. Ook hebben andere parameters zoals geslacht en tabak gewoonten gepaard gaan als zij ook met de sputum cel graaf29,32 interfereren kunnen. Wanneer patiënten matching niet mogelijk is, is een andere manier om het rekening houden met leeftijd, geslacht of roken status aan te passen van de statistische analyse voor deze eigenschappen.

    In vergelijking met andere technieken waarmee de cellen verzamelen van airways, zoals biopsieën en bronchoalveolar de lavages, kent de geïnduceerde sputum-methode de voordelen van het eenvoudige, goed verdragen, veilige, reproduceerbaar, kosteneffectieve en niet-invasieve. Deze voordelen toestaan de geïnduceerde sputum techniek moet worden uitgevoerd op een grote schaal en herhaaldelijk na verloop van tijd, en het alternatief bij uitstek voor bemonstering van de luchtwegen. Bronchosorption is een andere techniek waardoor de collectie van de mucosal voering vloeistof teneinde airway bemiddelaars33. Hoewel deze techniek (vereisen bronchoscopie) meer invasief dan geïnduceerde sputum is, heeft de voordelen van het vermijden van verontreiniging met speeksel en het verkrijgen van hogere concentraties van bemiddelaars dan in bronchoalveolar lavage33.

    Kritische stappen nodig aandacht in het protocol. Eerst, moet voorzichtigheid worden genomen betreffende de zoute concentratie en het tijdstip van inductie, omdat deze twee parameters kunnen de resultaten beïnvloeden en moeten dus gestandaardiseerd34,35. Ten tweede, de mucolysis met DTT is een belangrijke stap van de verwerking. Ten opzichte van PBS, werd DTT aangetoond dat het sputum cellen7, dat verbetert de kwaliteit van de dia cytopsin en is absoluut noodzakelijk dat er een reproduceerbare cel tellen2beter te verspreiden. Echter kan het slijmoplossende agent interfereren met de meting van biochemische onderdelen.Stekelige experimenten moet worden uitgevoerd bij het meten van een nieuwe biochemische samengestelde36. Tot slot is een andere kritische stap van de procedure de cel stap, die moet worden uitgevoerd door een opgeleide technicus om betrouwbare en interpreteerbaar resultaten tellen.

    Een alternatieve methode met behulp van sputum stekkers (viscid of dichtere delen), in plaats van het hele sputum, wordt ook beschreven in de literatuur7. Beide technieken hebben voor- en nadelen. De hele sputum techniek kunt sneller verwerken van7, maar is vaak besmet met speeksel, die verdunt het monster en de kwaliteit van cytospins2,7kan verminderen. Met de plug selectie techniek, wordt de speeksel-verontreiniging verminderd, hetgeen betekent dat de monsters vaak van betere kwaliteit voor de dosering van vloeibare fase bemiddelaars en cytospin dia's7 zijn. De verwerking is echter langer7 en geselecteerde pluggen kunnen niet representatief zijn voor de gehele monster37. Het is ook vermeldenswaard dat niet alle monsters bevatten stekkers, die kunnen worden beperkt. Beide methoden zijn gevalideerde en reproduceerbaar is, en er is momenteel geen bewijs dat de graven van de differentiële cel verkregen van beide methoden verschillende14,,38 zijn.

    Geïnduceerde sputum kan in de toekomst worden gebruikt als een klinische instrument waarmee biomarkers voor het onderzoek, diagnose en beheer van allerlei inflammatoire aandoeningen van de luchtwegen.

    Disclosures

    De auteurs hebben niets te onthullen.

    Acknowledgments

    Dit werk werd gesteund door de Universiteit ziekenhuis van Luik (CHU Luik). Wij erkennen "Instants productions" voor de videoproductie. We erkennen ook Cedric François, de patiënt die in de film verscheen.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Spirometer - Spirobank MIR France
    Salbutamol MDI - Ventolin GLAXOSMITHKLINE CNK: 0135-913 See drug available in the country
    Nebulizer UltraNeb DeVilbiss Healthcare USA UltraNeb U3000
    Devilbiss UltraNeb Disposable Cups & Lids DeVilbiss Healthcare USA 100HD-647
    DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers DeVilbiss Healthcare USA 1001005879
    One-way Valves Hudson RCI USA 41664
    One-way Valves Hudson RCI USA 41665
    Aerosol T-connector  Hudson RCI USA 41077
    Ventilation circuit monobranch corrugated Int'Air Medical France TA30A
    NaCl 5 %  / / Produced by our hospital pharmacy
    Mini-Plasco NaCl 0.9% B.Braun Medical  Diegem Belgium
    Salbutamol sulfate 5 mg/mL - Ventolin GLAXOSMITHKLINE CNK: 0094-987 See drug available in the country
    Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL - Atrovent Boehringer Ingelheim Germany CNK: 1543-305 See drug available in the country
    Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline LONZA Belgium BE17512F
    Sputolysin reagent Calbiochem 56000
    Trypan blue 0.4% solution 100 mL LONZA Bio Whittaker Belgium 17-942E
    Hemocytometer - Thoma chamber Labor Optik Lancing UK 1500000
    Hemacolor Stainig set Merck Belgium 1116610001 Alternative product  : Diff Quik Staining Set
     Medion Diagnostic 
    Mounting medium - Entellan Merck Belgium 107960
    Statspin Cytofuge 12  Beckman Coulter Belgium X00-003066-001

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice. European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).
    2. Pavord, I. D., Pizzichini, M. M., Pizzichini, E., Hargreave, F. E. The use of induced sputum to investigate airway inflammation. Thorax. 52 (6), 498-501 (1997).
    3. Leigh, T. R., et al. Sputum induction for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. The Lancet. 334 (8656), 205-206 (1989).
    4. Pin, I., et al. Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma. Thorax. 47 (1), 25-29 (1992).
    5. Pizzichini, M. M. M., Leigh, R., Djukanović, R., Sterk, P. J. Safety of sputum induction. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 9s-18s (2002).
    6. Delvaux, M., et al. Nebulised salbutamol administered during sputum induction improves bronchoprotection in patients with asthma. Thorax. 59 (2), 111-115 (2004).
    7. Efthimiadis, A., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 19s-23s (2002).
    8. Kelly, M., et al. Analysis of fluid-phase mediators. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 24s-39s (2002).
    9. Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
    10. Vignola, A. M., et al. Future directions. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 51s-55s (2002).
    11. Brightling, C. E. Clinical applications of induced sputum. Chest. 129 (5), 1344-1348 (2006).
    12. Miller, M. R. Standardisation of spirometry. European Respiratory Journal. 26 (2), 319-338 (2005).
    13. Global Initiative for Asthma (GINA) Global Strategy for Asthma Management and Prevention. , http://www.ginasthma.org/ (2017).
    14. Szefler, S. J., et al. Asthma outcomes: biomarkers. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3 Suppl), S9-S23 (2012).
    15. Douwes, J., Gibson, P., Pekkanen, J., Pearce, N. Non-eosinophilic asthma: importance and possible mechanisms. Thorax. 57 (7), 643-648 (2002).
    16. Schleich, F. N., et al. Importance of concomitant local and systemic eosinophilia in uncontrolled asthma. The European Respiratory Journal. 44 (1), 97-108 (2014).
    17. Demarche, S., et al. Detailed analysis of sputum and systemic inflammation in asthma phenotypes: are paucigranulocytic asthmatics really non-inflammatory? BMC pulmonary medicine. 16, 46 (2016).
    18. Pavord, I. D., et al. Clinical applications of assessment of airway inflammation using induced sputum. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 40s (2002).
    19. Guiot, J., Henket, M., Corhay, J. L., Moermans, C., Louis, R. Sputum biomarkers in IPF: Evidence for raised gene expression and protein level of IGFBP-2, IL-8 and MMP-7. PLOS ONE. 12 (2), e0171344 (2017).
    20. Green, R. H., et al. Asthma exacerbations and sputum eosinophil counts: a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9347), 1715-1721 (2002).
    21. Siva, R., et al. Eosinophilic airway inflammation and exacerbations of COPD: a randomised controlled trial. European Respiratory Journal. 29 (5), 906-913 (2007).
    22. Louis, R., et al. Cell infiltration, ICAM-1 expression, and eosinophil chemotactic activity in asthmatic sputum. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 466-472 (1997).
    23. Maes, T., et al. Asthma inflammatory phenotypes show differential microRNA expression in sputum. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1433-1446 (2016).
    24. Moermans, C., et al. Local and systemic cellular inflammation and cytokine release in chronic obstructive pulmonary disease. Cytokine. 56 (2), 298-304 (2011).
    25. Gibson, P. G., et al. Sputum induction in children. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 44s-46s (2002).
    26. Reddel, H. K., et al. An Official American Thoracic Society/European Respiratory Society Statement: Asthma Control and Exacerbations: Standardizing Endpoints for Clinical Asthma Trials and Clinical Practice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 180 (1), 59-99 (2009).
    27. Duncan, C. J. A., Lawrie, A., Blaylock, M. G., Douglas, J. G., Walsh, G. M. Reduced eosinophil apoptosis in induced sputum correlates with asthma severity. The European Respiratory Journal. 22 (3), 484-490 (2003).
    28. Demarche, S. F., et al. Asthma Control and Sputum Eosinophils: A Longitudinal Study in Daily Practice. The Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 5 (5), 1335-1343 (2017).
    29. Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2 Pt 1), 475-478 (2000).
    30. Brooks, C. R., Gibson, P. G., Douwes, J., Dalen, C. J. V., Simpson, J. L. Relationship between airway neutrophilia and ageing in asthmatics and non-asthmatics: Airway neutrophilia and ageing. Respirology. 18 (5), 857-865 (2013).
    31. Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
    32. Chalmers, G. W., et al. Smoking and airway inflammation in patients with mild asthma. Chest. 120 (6), 1917-1922 (2001).
    33. Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma: Increased Interferons (IFN-γ and IFN-λ) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. 19, 128-138 (2017).
    34. Popov, T. A., et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis). European Respiratory Journal. 8 (4), 559-565 (1995).
    35. Holz, O., et al. Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days. Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).
    36. Louis, R., et al. The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum. European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).
    37. Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects. American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
    38. Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination. The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).

    Tags

    Geneeskunde kwestie 130 mens Sputum Supernatant luchtweg ontsteking eosinofielen neutrofiele granulocyten macrofagen lymfocyten epitheliaale cellen longziekten
    Methodologie voor Sputum inductie en laboratorium Processing
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Guiot, J., Demarche, S., Henket, M., … More

    Guiot, J., Demarche, S., Henket, M., Paulus, V., Graff, S., Schleich, F., Corhay, J. L., Louis, R., Moermans, C. Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing. J. Vis. Exp. (130), e56612, doi:10.3791/56612 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter