Summary
כאן נתאר את הטכניקה של ברוק אינדוקציה. פרוטוקול זה גם מסביר את ברוק עיבוד כדי לבצע ספירה מבדלת תא וכדי לאסוף sputum supernatant תאים עבור ניתוח נוסף.
Abstract
הטכניקה של אינדוקציה sputum ועיבוד היא שיטה לא פולשנית מוכר המאפשר איסוף וניתוח של תאים של דרכי הנשימה, וזה מעניין למחלות שונות בדרכי הנשימה כמו אסתמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), שיעול כרוני או idiopathic פיברוזיס ריאתי. טכניקה זו היטב נסבל, בטוחה, לא פולשנית, אך מוגבלת כעת שירותי מחקר ומרכזי מתמחה באימון קליניים כי היא תובענית מבחינה טכנית, זמן רב, והיא דורשת צוות מיומן. שיעור ההצלחה של אינדוקציה sputum וניתוח הוא כ- 80%.
כאן, אנו מתארים עיבוד אינדוקציה והמעבדה sputum דגימות. ברוק הנגרמת על ידי שאיפת תמיסת hypertonic או מול עם סאלבוטאמול. עיבוד, אנו משתמשים בטכניקה sputum שלם. Dithiothreitol (DTT) משמש כדי לאפשר mucolysis של ברוק דגימות. המטרה העיקרית של עיבוד ברוק היא כדי לקבל ספירת תאים דיפרנציאלית ללמוד את סוגי תאים נוכח לומן דרכי הנשימה. ניתן לבצע ניתוחים נוספים גם על ברוק supernatant ותאים ברוק, אשר עשוי לאפשר את המשך בחקירת תהליכים דלקתיים, מנגנונים חיסוניים. דוגמאות כוללות לומד מגשרים בברוק supernatant וביצוע מגוון גדול של ניתוח בתאי sputum כגון cytometry זרימה, גנומיקה או פרוטאומיקס.
לבסוף, מוצגים תוצאות נציג של ניתוח sputum פקדים בריא לחולי אסתמה, מטופלי COPD.
Introduction
מספר שיטות משמשים כדי לחקור דלקת דרכי הנשימה: ישיר מדידות (כמו ביופסיות הסמפונות או bronchoalveolar lavages), שיטות עקיפות (כמו הערכה סימפטום, דם מדגם ניתוח ויצירת ריאה תפקודי)1. הטכניקות ישירה יש את היתרון של אמין הערכת הדלקת של דרכי הנשימה, אבל הם פולשנית, לא ריאלי בקנה מידה גדול בגלל נוחות המטופל, הסיכון שיגרמו1. לגבי שיטות עקיפות, הם לקוי לתאם עם בחינה ישירה של דלקת דרכי הנשימה1.
אוסף sputum דרך נוספת לתאים מדגם של דרכי הנשימה ומאפשר את ההערכה ישירה של דלקת דרכי הנשימה. למרות זאת, בהפקת sputum באופן ספונטני עלול להוביל דגימות של איכות ירודה, אינה אפשרית עבור חולים כל2. יש כבר להתגבר על בעיה זו על-ידי שימוש ultrasonically nebulized היפרטונית כדי לעודד את ייצור sputum2. שיטה זו שימשה בתחילה בחולים נגוע וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) לאבחון של דלקת ריאות Pneumocystis carinii 3 , הותאמה עבור חולי אסטמה 19924והנושאים בריא. ברוק אינדוקציה היא גם אפשרית בחולים חמורות יותר באמצעות מלוחים מול5. אמנם בדרך כלל נסבל היטב, שאיפת תמיסת מלח עלולה לגרום לעווית הסימפון בחולים עם hyperresponsive איירווייז5. לכן, מומלץ לנהל אגוניסט בטא קצרת לפני ההליך1. יתר על כן, אנו בעבר הראו כי הוספת סאלבוטאמול תמיסת מלח ב מפוחים אולטראסאונד נוסף ירד זה סיכון6. היתרונות של ברוק אינדוקציה היא כי זה לא פולשנית2 בטוח בעת הצורך באמצעי זהירות נלקחים5.
עיבוד sputum דגימות, שתי שיטות משמשים כיום בספרות: הטכניקה כל ברוק, את הבחירה של הכנס7. במעבדה שלנו, הטכניקה sputum כולו מתבצע. המטרה העיקרית של עיבוד ברוק היא כדי לקבל ספירת תאים דיפרנציאלית ללמוד את הסוג של דלקת נוכח לומן דרכי הנשימה. עם זאת, רבים ניתוחים נוספים הינם אפשריים להמשיך לחקור תהליכים דלקתיים ומנגנונים המערכת החיסונית, על ידי לימוד מגשרים sputum supernatant8 או על-ידי ביצוע חקירה מפורטת על תאים ברוק (למשל , flow cytometry9, תרביות תאים10, גנומיקה10, פרוטאומיקס10, immunocytochemistry7, בחיי עיר הכלאה7, וכד')
הטכניקה של אינדוקציה sputum וניתוח מוגבלת כעת ומרכזים שירותים מיוחדים הקלינית כי היא תובענית מבחינה טכנית, זמן רב, והיא דורשת צוות מיומן1. דלקת דרכי הנשימה עשוי להיחקר בשיטה זו עבור מחלות שונות בדרכי הנשימה כמו אסתמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), שיעול כרוני או idiopathic פיברוזיס ריאתי11.
Protocol
כל השיטות המתוארות בסעיף זה אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים והשליט של אוניברסיטת ונתן בכל המקצועות בריא בכתב הסכמה מדעת להשתתפות.
1. ברוק אינדוקציה
- ספירומטריה מראש, שלאחר למצוקת
- לבצע ספירומטריה (הכריחו נפח expiratory בשנייה 1 [FEV1] ולתמרן חיוניים בכפייה קיבולת [FVC]) על פי החברה הגבילו אמריקאי (ATS) / הקריטריונים הסטנדרטיים החברה בדרכי הנשימה האירופי (ERS)12.
- לנהל µg 400 של סאלבוטאמול בשאיפה מ משאף במינון מוניות (MDI) דרך התקן מרווח.
הערה: אצל מבוגרים, תיעודו של סאלבוטאמול בשאיפה כוללות רעד וקצב13. - חזור ספירומטריה (FEV1 ולתמרן FVC) 15 דקות מאוחר יותר, על פי הקריטריונים הסטנדרטיים ATS/ERS12.
- הכנת מפוחים אולטראסוניות
הערה: מפוחים צריך ביסודיות לנקות ולשמור נקיים לפני כל שימוש, בהתאם להוראות היצרן.- למלא את התא מפוחים עם מים מזוקקים עד לרמה המומלצת.
- מניחים כוס נקי בבית הבליעה מפוחים.
- מכסים את הספל עם המכסה המתאים.
- למלא את הכוס גם 50 מ של לקילו (5%) לחולה עם למצוקת שלאחר FEV1 > 65% חזה או 50 מ ל תמיסת מול (0.9%) לחולה עם למצוקת שלאחר FEV1≤65% חזה.
- להוסיף 1.75 מ של פתרון סולפט סאלבוטאמול (5 מ"ג/מ"ל) בגביע.
- לחבר את צינורות ושסתומים בהתאם להוראות היצרן.
- אוסף nebulization וברוק
הערה: בצע את הטכניקה תחת השגחה רפואית.- להסביר את ההליך למטופל.
- בקש מהמטופל להשתמש סרטון האף.
- הפעלת מפוחים ובחר ברמה הנמוכה ביותר של הגדרות תרסיס ומאוורר.
- בקש מהמטופל לשאוף בתרסיס דרך היצירה הפה עם הנשימה גאות במשך 5 דקות.
הערה: תרסיס והגדרות מאוורר ניתן להגדיל בהתאם הסובלנות של המטופל.- במקרה של שיעול בלתי נסבל או בחילה, להפסיק את ההליך, עבור לשלב 1.3.5.
- במקרה של לחץ בחזה או אי נוחות בדרכי הנשימה, עבור לשלב 1.3.8.
- . כבה את מפוחים.
- בקש מהמטופל כדי להסיר את הסרטון האף, לשטוף את הפה עם מים, לגרגר פעמיים לפני השלכת אותו בכיור.
הערה: רוק התאים עשויים לזהם את הדגימה ברוק, להוביל דוגמה לא שמיש. - בקש מהמטופל להשתעל sputum לתוך מיכל פלסטיק.
- לבצע ספירומטריה (תמרון expiratory בכפייה) כדי למדוד FEV1.
- להעריך את האשמה1 FEV כדלקמן: (נמדד FEV1 צעד 3.8 [mL]) - (למצוקת שלאחר FEV1 נמדד בשלב 1.3 [mL]) / (למצוקת שלאחר FEV1 נמדד בשלב 1.3 [mL]) * 100.
- אם ה FEV1 נופל על-ידי 20% או יותר מהערך למצוקת שלאחר, להפסיק את ההליך. למדוד FEV1 שוב 10 דקות מאוחר יותר. אם ה FEV1 נופל 20% או יותר, שאל את הרופא לנהל nebulized ipratropium ברומיד (0.25 מ"ג/2 מ"ל) ולשמור את החולה תחת השגחה רפואית. עבור לשלב 1.3.10.
- אם ה FEV1 לא נופל על-ידי 20% או יותר מהערך למצוקת שלאחר, חזור על שלבים 3.2 ל 3.9 אחת עד שלוש פעמים כדי להגיע בזמן nebulization סך של 10 עד 20 דקות.
הערה: הזמן הכולל nebulization תלויות באיכות (נוכחות של פקקים או חלקים צמיגה) והן את כמות הדגימה ברוק. אם לדוגמה איכות ו/או כמות של עניים אחרי 10 דקות של nebulization, ההליך צריך ניתן להרחיב כדי להגיע בזמן nebulization סך של 15 עד 20 דקות.
- שמור את הדגימה sputum בקירור עד עיבוד.
2. ברוק עיבוד
הערה: תהליך ברוק בתוך 3 שעות של דגימה עבור תא אופטימום הכדאיות.
התראה: ללבוש חלוק מעבדה, כפפות מגן ומשקפי מגן.
- הכנות ראשוניות
- לגרום לדילול 10-fold הפתרון dithiothreitol מרוכז (סוכן mucolytic) עם מים מזוקקים סטריליים כדי לקבל 10 מ של פתרון 6.5 מ מ, בהתאם להוראות היצרן.
הערה: על מנת למנוע פתרון dithiothreitol מרוכז ערבוב עם אויר, למשוך את הפתרון המבחנה עם מזרק סטרילי ואת המחט. ברגע שנפתח, המבחנה תמיסה מרוכזת חייב להיות לשמור בטמפרטורת החדר ולא להשתמש בו בתוך 5 ימים. הפתרון מדולל מוכן מדי יום.
התראה: בגלל הסכנה לגירוי העין ועור, ללבוש ציוד מגן (ביגוד, כפפות, משקפי מגן). - לגרום לדילול 5-fold הפתרון trypan blue (0.4%) עם Dulbecco Phosphate-Buffered מלוחים (DPBS) כדי לקבל פתרון 0.08%. לשמור על הפתרון מדולל בטמפרטורת החדר ולהשתמש בתוך 2 שבועות.
שים לב: בשל סיכונים מסרטנים, ללבוש ציוד מגן (ביגוד, כפפות, משקפי מגן).
- לגרום לדילול 10-fold הפתרון dithiothreitol מרוכז (סוכן mucolytic) עם מים מזוקקים סטריליים כדי לקבל 10 מ של פתרון 6.5 מ מ, בהתאם להוראות היצרן.
- אוסף של ברוק תגובת שיקוע
- העברת ברוק כולו בתוך צינור פלסטיק 50 מל-התחתון חרוט ולשקול את הדגימה.
- להוסיף משקל 3-fold של DPBS פתרון.
- אט-אט מערבולת המדגם ב-30 s.
- צנטריפוגה ב 800 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- לסנן את הדגימה דרך 2 שכבות יחידה של גזה סטרילית ולאסוף את תגובת שיקוע של צינור פלסטיק 50 מל-חרוט התחתון.
- Aliquot תגובת שיקוע בפלסטיק 2 mL צינורות ואחסן אותם ב- 80 ° c
הערה: דוגמאות Supernatant שימושיים assay sputum שלב נוזל רכיבים.
- Mucolysis ברוק
- אם יש צורך, להוסיף DPBS בגדר תא להגיע הנפח הכולל של התא השעיה של 5 מ.
- לדלל התליה תא עם נפח 1 של 6.5 מ מ dithiothreitol. השתמש רוקר ספסל יפציץ התליה תא עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- חזור על פחות 3 פעמים עם DPBS.
- Centrifuge התליה תא מדולל ב 550 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- להעריך ולהקליט את עוצמת הקול המדויק של התליה תא.
- להוסיף 50 µL של השעיה תא µL 50 של הפתרון trypan blue 0.08%, homogenize.
- שים המדגם תחת coverslip של hemocytometer (Thoma קאמרית) ולמקם אותו תחת מיקרוסקופ אופטי (400 X).
- לספור תאים קשקשיים תאים קשקשיים-שאינו חי (תאי צבע), תאים מתים שאינם קשקשיים (תאים בצבע כחול).
הערה: במקרה של צפיפות התאים נמוך מדי או גבוה מדי, להתרכז או לדלל התליה תא וחזור על שלבים 2.4.1-2.4.3. - להעריך את התא ריכוז ההשעיה, האחוז של תאים קשקשיים ו האחוז של הכדאיות של תאי קשקש.
הערה: לחשב את סך הלא-קשקש הספירה/g של ברוק: התא ריכוז של המתלה (שלב 5.4) * נפח של התליה תא (שלב 4.8) * אחוז תאי קשקש / משקל של המדגם ברוק (שלב 2.2.1).
הערה: אם התליה תא מכיל יותר מ 80% קשקשיים תאים, המדגם נחשב עני איכות מתאים cytospin שקופית14. במקרה זה, הפסק העיבוד ולשקול את הדוגמית הזו לא מוצלח.
- לדלל עם aliquot של התליה תא עם DPBS כדי לקבל לפחות 350 µL של השעיה תאים-תאים למ"ל 500,000.
- להרכיב את רכז תא בהתאם להוראות היצרן.
- למלא כל אחד תאי 3 במסוע תא µL 100 של השעיה התא הזה.
- ב cytocentrifuge, ספין למשך 2 דקות ב 150 x g ובטמפרטורת החדר. למחוק את supernatants.
- לפרק את רכז תא בהתאם להוראות היצרן.
- לאפשר השקופית כדי אוויר יבש.
הערה: בשלב זה, תאים שיורית ניתן לאחסן מאגר הולם במידת הצורך לניסויים נוספים. - כתם השקופית עם צביעת מסחרי קיט (ראה את הטבלה של חומרים), בהתאם להוראות היצרן.
- טעינת השקופית עם מדיום הרכבה מתאים ועם מכסה.
- מקם את השקופית תחת המיקרוסקופ האופטי (600 X) עם שמן טבילה.
- לספור תאים שאינם קשקשיים לפחות 500: נויטרופילים, אאוזינופילים, מקרופאגים, לימפוציטים ותאי אפיתל.
הערה: ספירת התאים דיפרנציאלית מתבצע בדרך כלל על ידי היחידה או שניים ייעודי מאומן משקיפים להגבלת סתירות interobserver. - הערכים המוחלטים הרשומה והאחוזים של כל סוג התא.
Representative Results
Hemocytometer
תמונה אופיינית מוצג באיור 1 זה הוא מדמיין עם המיקרוסקופ באמצעות את hemocytometer. תאים קשקשיים מזוהים בקלות, כפי שהם הרבה יותר גדול מאשר תאי קשקש. אלה תאים קשקשיים הם תאים אפיתל בא מן הפה. שני סוגים של תאים מוכתמות Trypan Blue כאשר מת. זהירות יש לנקוט כדי להימנע ספירת שמרים חיידקים, גרוטאות.
איור 1 : Hemocytometer תמונה המציגה (A) חיים שאינם-קשקש, (B), מת ללא-קשקש ו (ג) הקשקש התא. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Cytospin שקופית: איור 2 מציג תמונת הנציגה של שקופית cytospin שהושג לאחר העיבוד ברוק. ניתן להבחין את סוגי תאים שונים (נויטרופילים, אאוזינופילים, מקרופאגים, לימפוציטים, ותאי האפיתל) על-ידי הגיוון ומורפולוגיה שלהם. במקרים מסוימים, זיהום על ידי תאים קשקשיים יכול להיות חשוב ונחשבת, אם האחוז של תאים קשקשיים גדול מ- 80%, המדגם לא מוצלח (איור 3).
איור 2 : Cytospin שקופית תמונה המציגה (A) של נויטרופילים, (B) macrophage, (ג) eosinophil, (ד) הלימפוציטים, ו- (E) תא אפיתל. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : דוגמה של שקופית cytospin באיכות ירודה עם > 80% של תאים קשקשיים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
אחוזי הצלחה
במחלקה שלנו, שיעור ההצלחה של הפרוצדורה (שילוב של אינדוקציה מוצלחת של cytospin קריא), בהתבסס על מדגם של חולים 1,129 (לנסיינים בריאים, חולי אסטמה או מטופלי COPD), 82% (924/1,129). בניתוח משנה בהתאם לסוג של חולים, שיעור ההצלחה הוא 75% (57/76) במקצועות בריאות, 82% (827/1,004) בחולי אסטמה, 82% (40/49) בחולי COPD.
תוצאות במקצועות בריא
ב ניתוח רטרוספקטיבי של סדרה של 289 לנסיינים בריאים מהמחלקה שלנו, החציון (טווח בין רבעוני) משקל sputum היה 3.72 g (טווח בין רבעוני של 2.46 g - 5.54 g), ספירת החציוני הכולל הלא-קשקש/g של ברוק 0.59 x 106 ( טווח בין רבעוני של 0.37 x 106 - 1.29 x 106).
בנושאים האלה בריאים, חלקם של תאים קשקשיים הוא נמוך ב- 19% (10% 34%) והוא הכדאיות בגובה של 66% (54-78%). לגבי האחוז של סוגי תאים שונים, תוצאות מסוכמות באיור 4A. ניתן להבחין כי האחוז של מקרופאגים (49% [31-68%]) הוא גבוה יותר מאשר האחוז של נויטרופילים (34% [14% - 60%]), ואילו האחוזים של לימפוציטים (2% [1-3%]), אאוזינופילים (0% [0% 0%]) ותאי אפיתל (4% [2-11%]) נמוכים. תוצאות אלו דומים כאשר הנתונים מבוטאים בערכים מוחלטים (איור 4B).
איור 4 : התוצאות נציג של ספירת דיפרנציאלית שנצפתה לנסיינים בריאים המבוטא באחוזים (A) או לערכים מוחלטים (B). התוצאות יוצגו כמו חציון (טווח בין רבעוני). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
חשוב גם להתחשב הגיל של המטופלים. אכן, מתאם חזק הוא בין גיל החולה את הפרופורציה של נויטרופילים נוכח sputum דגימות (איור 5). באופן דומה, בעת מיון מטופלים לפי קבוצות גיל 10 שנה (איור 6), הבחנו עלייה משמעותית באחוזים נויטרופילים עם הגדלת קבוצת גיל. לכן, משתנה זה יש לקחת בחשבון כאשר משווים תוצאות גדודים שונים, זהירות יש לנקוט את ההתאמה של נושאים.
איור 5: מתאם בין גיל לבין ברוק אחוז נויטרופילים. המתאם חושבה עם הבדיקה ספרמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: האבולוציה של האחוז נויטרופילים בהתאם לקטגוריית גיל. הערך-p של אנובה היה < 0.0001 עבור ההשוואה של נויטרופילים אחוז בין כיתות גיל. השוואות מרובות נעשו עם מבחן השוואות מרובות של דאן. ערכי p-מיוצגים כדלקמן: * p < 0.05, * * p < 0.01, ו * * * p < 0.001. התוצאות יוצגו כמו חציון (טווח בין רבעוני). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
התוצאות בחולים הסובלים ממחלות מערכת הנשימה
הטכניקה של ברוק המושרה משמש בדרך כלל כדי להעריך את הפרופיל תאים דלקתיים אצל חולי אסתמה.טכניקה זו ויכול להיות מיושם גם לחולים הסובלים ממחלת ריאות חסימתית כרונית, מחלות נשימה דלקתי אחר. בעת השוואה בין הנבדקים בריא לחולי אסתמה, מטופלי COPD (הקבוצות 3 להיות תואמות גיל, מגדר, טבק הרגלים), הבחנו כי הפרופיל תאים דלקתיים שונה לגמרי בין קוהורטות אלה (איור 7). אכן, חולי אסתמה בדרך כלל מאופיינים אאוזינופילים sputum מוגבה, ואילו חלקם של נויטרופילים sputum הוא בדרך כלל גבוה יותר בחולי COPD לעומת שולט בריא, אשר קשורה לחומרת המחלה.
איור 7 : ברוק תאים דלקתיים לפרופיל לנסיינים בריאים (n = 45), חולי אסתמה (n = 108), ומטופלים COPD (n = 54). לשלוש הקבוצות היו תואמות מגדר, גיל, הרגלי טבק. ערכי-p של אנובה היו < 0.05, < 0.0001, ו < 0.0001 עבור ההשוואה של נויטרופילים, אאוזינופילים מקרופאגים בין קבוצות, בהתאמה. השוואות מרובות נעשו עם מבחן השוואות מרובות של דאן. ערכי p-מיוצגים כדלקמן: * p < 0.05 ו * * * p < 0.001. התוצאות יוצגו כמו חציון (טווח בין רבעוני). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
השיטה sputum המושרה היא כלי שימושי ללמוד תא דרכי הנשימה. ישנם מספר יישומים אפשריים של טכניקה זו. קודם כל, זה עשוי לשפר את הידע על תאים חיסוניים ומנגנונים מעורב מחלות נשימה שונות. לדוגמה, טכניקה זו אפשרה את החקירה של דלקת דרכי הנשימה ב קוהורטות גדולות של חולים, ולא הוכח כי כמחצית מהמטופלים אסתמה מאופיינים של הנשימה נורמלית דלקת אאוזינופילית15, 16 , 17, ואילו מטופלי COPD מוצג בדרך כלל של נויטרופילים sputum מוגבה סופר18. טכניקה זו תרמה גם אפיון טוב יותר של דלקת דרכי הנשימה בחולים עם idiopathic פיברוזיס ריאתי, מגשרים ראיות שעשויים לתרום זו מחלה19. שנית, בטכניקה של ברוק המזורזת עשויה להיות שימושית לחזות את התגובה לטיפול. לדוגמה, נוכחות אחוז חריג של אאוזינופילים sputum הוכח להיות סמן ניבוי של הסטרואידים תגובתיות11,18. אסטמה, COPD, התאמת המינון של קורטיקוסטרואידים לנרמל את האחוז של אאוזינופילים sputum הוצגה להיות יותר יעיל בהפחתת מספר exacerbations מאשר התאמת הטיפול על פי הנחיות קליניות הנוכחי11 20, ,21. שלישית, ניתוח sputum עשוי לעזור לפתח טיפולים ממוקדים. לדוגמה, הנוכחות של מספר חריג של ברוק נויטרופילים ב כמה חולי אסתמה ו- COPD הוביל לפיתוח טיפולים antineutrophilic11. רביעית, הטכניקה עשויים לשחק תפקיד באבחון. לדוגמה, הנוכחות של אאוזינופיליה sputum יש צורך לערוך אבחנה של אי-אסטמה ברונכיט אאוזינופילית11.
מלבד קבלת ספירה מבדלת תא, בטכניקה של גרימת sputum מאפשר גם את הביצועים של ניתוחים נוספים רבים, על ידי לימוד sputum supernatant או תאים ברוק. דוגמאות עם sputum supernatant כוללים הניתוח של מגשרים8,19,22 , את ההערכה של הפעילות chemotactic של המדגם אאוזינופילים22. מתאי ברוק, RNA יכול חילוצם ואופן המשמש microRNA או ביטוי גנים מנתח19,23 . ניתן גם לנתח את התאים sputum מאת לזרום cytometry9,23 המאפשר, בין היתר, תאים immunophenotyping ומיון. יתר על כן, ברוק תאים יכול להיות בתרבית10, ייצורם מתווך יכול להיות נמדד במבחנה24. ראוי לציין כי במקרה זה, תוכן המתווך הוא שונה מכל מה ניתן למצוא ברוק supernatant. אכן, מגשרים בברוק supernatant עשוי להיות מושפע על ידי הפרשות דרכי הנשימה תאים תושב ועל ידי exudation פלזמה, בניגוד דגם24תרבות תא ברוק. לבסוף, immunocytochemistry וב -באתרו הכלאה גם ניתן לבצע באמצעות תאים sputum7.
הטכניקה sputum המושרה יש מספר מגבלות. אינדוקציה חייב להתבצע תחת פיקוח רפואי. זה חיוני גם באופרטור לתת הוראות יסודיות לחולים. מגבלות אחרות כוללות את שיתוף הפעולה ואת מצבו הרפואי של חולים, מאמצים במערכת הנשימה. בנוגע להיתכנות של טכניקה זו אצל ילדים, מספר מחקרים דיווחו שזה היה מוצלח ובטוח לילדים מעל גיל 6 בת25. נתונים על ילדי < 6 שנים של גיל חסרים25, אך סביר כי sputum אינדוקציה היא קשה לבצע את הילדים האלה14. הטכניקה היא מוגבל ומרכזים שירותים מיוחדים כי זה טכנית תובעניים, זמן רב, וזה דורש צוות מיומן1. מגבלה נוספת היא כי הטכניקה של אינדוקציה sputum וניתוח אינה תמיד מוצלח, כלומר כי cytospin קריא לא תמיד מתקבל26. אולם, שיעור ההצלחה הוא בדרך כלל בסביבות 80% בגדודים שונים של מטופלים4,26,27,28,29. בסופו של דבר, זהירות יש לנקוט בעת השוואת גדודים שונים של חולים בדבר ההתאמה בין גיל כמו זה הוצג לפגיעה30,31ספירת תאים sputum. באופן דומה, פרמטרים אחרים כגון הרגלי מין וטבק צריך להיות מתאימים כפי הם גם עלולים להפריע29,32ספירת תאים ברוק. בעת התאמת המטופל אינו אפשרי, דרך נוספת לקחת לגיל, מין או מצב עישון בחשבון היא להתאים את ניתוח סטטיסטי עבור מאפיינים אלו.
השיטה sputum המושרה לעומת טכניקות אחרות, המאפשרים איסוף תאי איירווייז, ביופסיות, bronchoalveolar lavages, יש את היתרונות של להיות פשוטה נסבל היטב, בטוח, לשחזור, חסכונית, לא פולשנית. יתרונות אלה מאפשרים את הטכניקה sputum המושרה להתבצע ב בקנה מידה גדול, שוב ושוב לאורך זמן, ולהפוך אותו חלופה של בחירה עבור הדגימה את דרכי הנשימה. Bronchosorption היא טכניקה נוספת ומאפשר את האוסף של הנוזל שורות mucosal כדי להעריך את דרכי הנשימה מגשרים33. אמנם שיטה זו (דרישת ברונכוסקופיה) פולשניים יותר מאשר sputum המושרה, יש את היתרונות של הימנעות כל זיהום עם הרוק וקבלת ריכוז גבוה של מגשרים מאשר ב שטיפת bronchoalveolar33.
פעולות קריטיות צריך תשומת לב בפרוטוקול. ראשית, שים לב חייב להילקח בדבר ריכוז מלח ואת הזמן של אינדוקציה, כי אלה שני פרמטרים יכול להשפיע על התוצאות ולכן צריך להיות מתוקנן34,35. שנית, mucolysis עם DTT היא צעד חשוב של העיבוד. לעומת PBS, הוצגה DTT כדאי לפזר sputum תאים7, אשר משפר את איכות השקופית cytopsin חיוני יש ספירת תאים לשחזור2. עם זאת, הסוכן mucolytic עלולים להפריע המדידה של רכיבים הביוכימי.עולה ניסויים ואז לבצע בעת מדידת תרכובת ביוכימית36חדש. לבסוף, צעד קריטי נוסף של ההליך היא התא ספירת צעד, אשר חייב להתבצע על ידי טכנאי מוסמך כדי להבטיח תוצאות interpretable ואמין.
שיטה חלופית באמצעות sputum תקעים (חלקים viscid או צפופה), במקום ברוק שלמה, המתואר גם ספרות7. בשתי הטכניקות יש יתרונות וחסרונות. הטכניקה sputum כל מאפשר מהירה יותר עיבוד7, אך לעתים קרובות מזוהם עם הרוק, אשר מדללת את הדגימה, יכול להפחית את האיכות של2,cytospins7. עם הטכניקה הבחירה הכנס, הזיהום רוק מופחת, מה שאומר כי דגימות לעיתים קרובות באיכות טובה יותר את המינון של מתווכים פאזה נוזלית ועבור שקופיות cytospin7. העיבוד עם זאת עוד7 , תקעים שנבחר לא יכול להיות נציג של כל מדגם37. . זה גם ראוי לציין כי לא כל דוגמאות מכילים תקעים, אשר יכולים להיות הגבלת... שתי השיטות הן המאומת לשחזור, ויש כיום אין ראיות כי הסעיפים תא דיפרנציאלית המתקבל שתי השיטות האלה הם שונים14,38.
בעתיד, sputum המושרה יכול לשמש ככלי קליני כדי לספק סמנים ביולוגיים החקירה, אבחון וניהול של כל מיני מחלות דלקתיות במערכת הנשימה.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת בית החולים של והשליט (Liege צ'ו). אנו להכיר "הרגעים הפקות" עבור הפקת הסרטון. אנו גם להכיר סדריק פרנסואה, המטופל שהופיע בסרט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spirometer - Spirobank | MIR France | ||
| Salbutamol MDI - Ventolin | GLAXOSMITHKLINE | CNK: 0135-913 | See drug available in the country |
| Nebulizer UltraNeb | DeVilbiss Healthcare USA | UltraNeb U3000 | |
| Devilbiss UltraNeb Disposable Cups & Lids | DeVilbiss Healthcare USA | 100HD-647 | |
| DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers | DeVilbiss Healthcare USA | 1001005879 | |
| One-way Valves | Hudson RCI USA | 41664 | |
| One-way Valves | Hudson RCI USA | 41665 | |
| Aerosol T-connector | Hudson RCI USA | 41077 | |
| Ventilation circuit monobranch corrugated | Int'Air Medical France | TA30A | |
| NaCl 5 % | / | / | Produced by our hospital pharmacy |
| Mini-Plasco NaCl 0.9% | B.Braun Medical Diegem Belgium | ||
| Salbutamol sulfate 5 mg/mL - Ventolin | GLAXOSMITHKLINE | CNK: 0094-987 | See drug available in the country |
| Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL - Atrovent | Boehringer Ingelheim Germany | CNK: 1543-305 | See drug available in the country |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | LONZA Belgium | BE17512F | |
| Sputolysin reagent | Calbiochem | 56000 | |
| Trypan blue 0.4% solution 100 mL | LONZA Bio Whittaker Belgium | 17-942E | |
| Hemocytometer - Thoma chamber | Labor Optik Lancing UK | 1500000 | |
| Hemacolor Stainig set | Merck Belgium | 1116610001 | Alternative product : Diff Quik Staining Set Medion Diagnostic |
| Mounting medium - Entellan | Merck Belgium | 107960 | |
| Statspin Cytofuge 12 | Beckman Coulter Belgium | X00-003066-001 |
References
- Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice. European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).
- Pavord, I. D., Pizzichini, M. M., Pizzichini, E., Hargreave, F. E. The use of induced sputum to investigate airway inflammation. Thorax. 52 (6), 498-501 (1997).
- Leigh, T. R., et al. Sputum induction for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. The Lancet. 334 (8656), 205-206 (1989).
- Pin, I., et al. Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma. Thorax. 47 (1), 25-29 (1992).
- Pizzichini, M. M. M., Leigh, R., Djukanović, R., Sterk, P. J.
- Delvaux, M., et al. Nebulised salbutamol administered during sputum induction improves bronchoprotection in patients with asthma. Thorax. 59 (2), 111-115 (2004).
- Efthimiadis, A., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 19s-23s (2002).
- Kelly, M., et al. Analysis of fluid-phase mediators. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 24s-39s (2002).
- Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
- Vignola, A. M., et al.
- Brightling, C. E. Clinical applications of induced sputum. Chest. 129 (5), 1344-1348 (2006).
- Miller, M. R. Standardisation of spirometry. European Respiratory Journal. 26 (2), 319-338 (2005).
- Global Initiative for Asthma (GINA) Global Strategy for Asthma Management and Prevention. , http://www.ginasthma.org/ (2017).
- Szefler, S. J., et al. Asthma outcomes: biomarkers. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3 Suppl), S9-S23 (2012).
- Douwes, J., Gibson, P., Pekkanen, J., Pearce, N. Non-eosinophilic asthma: importance and possible mechanisms. Thorax. 57 (7), 643-648 (2002).
- Schleich, F. N., et al. Importance of concomitant local and systemic eosinophilia in uncontrolled asthma. The European Respiratory Journal. 44 (1), 97-108 (2014).
- Demarche, S., et al. Detailed analysis of sputum and systemic inflammation in asthma phenotypes: are paucigranulocytic asthmatics really non-inflammatory? BMC pulmonary medicine. 16, 46 (2016).
- Pavord, I. D., et al. Clinical applications of assessment of airway inflammation using induced sputum. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 40s (2002).
- Guiot, J., Henket, M., Corhay, J. L., Moermans, C., Louis, R. Sputum biomarkers in IPF: Evidence for raised gene expression and protein level of IGFBP-2, IL-8 and MMP-7. PLOS ONE. 12 (2), e0171344 (2017).
- Green, R. H., et al. Asthma exacerbations and sputum eosinophil counts: a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9347), 1715-1721 (2002).
- Siva, R., et al. Eosinophilic airway inflammation and exacerbations of COPD: a randomised controlled trial. European Respiratory Journal. 29 (5), 906-913 (2007).
- Louis, R., et al. Cell infiltration, ICAM-1 expression, and eosinophil chemotactic activity in asthmatic sputum. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 466-472 (1997).
- Maes, T., et al. Asthma inflammatory phenotypes show differential microRNA expression in sputum. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1433-1446 (2016).
- Moermans, C., et al. Local and systemic cellular inflammation and cytokine release in chronic obstructive pulmonary disease. Cytokine. 56 (2), 298-304 (2011).
- Gibson, P. G., et al. Sputum induction in children. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 44s-46s (2002).
- Reddel, H. K., et al. An Official American Thoracic Society/European Respiratory Society Statement: Asthma Control and Exacerbations: Standardizing Endpoints for Clinical Asthma Trials and Clinical Practice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 180 (1), 59-99 (2009).
- Duncan, C. J. A., Lawrie, A., Blaylock, M. G., Douglas, J. G., Walsh, G. M. Reduced eosinophil apoptosis in induced sputum correlates with asthma severity. The European Respiratory Journal. 22 (3), 484-490 (2003).
- Demarche, S. F., et al. Asthma Control and Sputum Eosinophils: A Longitudinal Study in Daily Practice. The Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 5 (5), 1335-1343 (2017).
- Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2 Pt 1), 475-478 (2000).
- Brooks, C. R., Gibson, P. G., Douwes, J., Dalen, C. J. V., Simpson, J. L. Relationship between airway neutrophilia and ageing in asthmatics and non-asthmatics: Airway neutrophilia and ageing. Respirology. 18 (5), 857-865 (2013).
- Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
- Chalmers, G. W., et al. Smoking and airway inflammation in patients with mild asthma. Chest. 120 (6), 1917-1922 (2001).
- Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma: Increased Interferons (IFN-γ and IFN-λ) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. 19, 128-138 (2017).
- Popov, T. A., et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis). European Respiratory Journal. 8 (4), 559-565 (1995).
- Holz, O., et al. Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days. Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).
- Louis, R., et al. The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum. European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).
- Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects. American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
- Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination. The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).
