Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Metodologi for Sputum induktion og laboratorium behandling

Published: December 17, 2017 doi: 10.3791/56612
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Respiratory Medicine, CHU Liege, GIGA I3 Research Group, University of Liege, 2Department of Clinical Pharmacy, CIRM (Center for Interdisciplinary Research on Medicines), University of Liege
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi teknik af sputum induktion. Denne protokol forklarer også sputum forarbejdning til at udføre en differentieret celletal og samle spyt supernatanten og celler for yderligere analyse.

Abstract

Teknik af sputum induktion og forarbejdning er en anerkendt ikke-invasiv metode giver mulighed for indsamling og analyse af celler fra luftvejene, som er interessante i forskellige respiratoriske sygdomme som astma, kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), kronisk hoste, eller idiopatisk pulmonal fibrose. Denne teknik er godt tolereret, sikker og ikke-invasiv, men er i øjeblikket begrænset til opslagstjenester og specialiserede centre i klinisk praksis, fordi det er teknisk krævende, tidskrævende, og kræver uddannet personale. Succesraten af sputum induktion og analyse er omkring 80%.

Her beskriver vi induktion og laboratorium behandling af sputum prøver. Spyt er foranlediget ved indånding af hypertonisk eller isotonisk saltvand med salbutamol. For behandlingen bruger vi hele sputum teknik. Dithiothreitol (DTT) bruges til at tillade mucolysis af sputum prøver. Det primære mål med spyt behandling er at opnå en differentieret celletal for at studere de nuværende i luftvejene lumen celletyper. Yderligere analyser kan også udføres på sputum supernatanten og sputum celler, som kan tillade yderligere undersøgelse af inflammatoriske processer og immun mekanismer. Eksempler kan nævnes at studere mæglere i sputum supernatanten og udføre et stort spektrum af analyse af sputum celler flowcytometri, genomforskning og proteomics.

Endelig, repræsentative resultater af sputum analyse i raske kontrolpersoner, astmatikere og KOL-patienter er præsenteret.

Introduction

Flere metoder er brugt til at undersøge betændelse i luftvejene: direkte målinger (ligesom bronchiale biopsier eller bronchoalveolar lavages) og indirekte metoder (som symptom vurdering, blod prøve analyse og lunge-funktion test)1. De direkte teknikker har fordel af pålideligt vurdere betændelsen i luftvejene, men de er invasive og ikke lade sig gøre i stor skala på grund af patienternes ubehag og risikoen afholdt1. Hvad angår de indirekte metoder korrelerer de dårligt med en direkte vurdering af luftvejs inflammation1.

Sputum samling er en anden måde at prøve celler fra luftvejene og giver mulighed for en direkte vurdering af betændelse i luftvejene. Alligevel producerer spyt spontant kan føre til prøver af dårlig kvalitet og er ikke muligt for alle patienter2. Dette spørgsmål har overvundet ved hjælp af ultralyd forstøves hypertonisk saltvand til at fremkalde sputum produktion2. Denne metode blev oprindeligt anvendt hos patienter inficeret med human immundefekt virus (HIV) til diagnosticering af Pneumocystis carinii lungebetændelse3 og blev tilpasset til raske forsøgspersoner og astmatikere i 19924. Sputum induktion er også muligt i mere alvorlige patienter ved hjælp af isotonisk saltvand5. Selvom generelt veltolereret, kan indånding af saltvand forårsage bronkospasme hos patienter med hyperresponsive airways5. Det anbefales derfor, at administrere en korttidsvirkende beta-agonist før procedure1. Derudover har vi tidligere har vist, at tilføje salbutamol at saltvandsopløsning i den ultrasonisk forstøver yderligere faldt denne risiko6. Fordele af sputum induktion er at det er non-invasiv2 og sikker, når den passende forholdsregler er truffet5.

Til forarbejdning af sputum prøver, to metoder der i øjeblikket anvendes i litteraturen: hele sputum teknik og plug udvalg7. I vores laboratorium udføres den hele sputum teknik. Det primære mål med spyt behandling er at opnå en differentieret celletal for at studere typen af betændelse i luftvejene lumen. Mange yderligere analyser er dog også muligt for yderligere at undersøge inflammatoriske processer og immun mekanismer, enten ved at studere mæglere i sputum supernatanten8 eller ved at udføre detaljerede undersøgelse på sputum celler (f.eks. , flyde flowcytometri9, celle kulturer10, genomforskning10, proteomics10, immuncytokemi7, in situ hybridisering7, osv.)

Teknik af sputum induktion og analyse er i øjeblikket begrænset til forskning tjenester og specialiserede centre i klinisk praksis, fordi det er teknisk krævende, tidskrævende, og kræver uddannet personale1. Betændelse i luftvejene kan undersøges med denne metode for forskellige luftvejssygdomme såsom astma, kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), kronisk hoste eller idiopatisk lungefibrose11.

Protocol

Alle metoder, der beskrives i dette afsnit er blevet godkendt af den etiske komité i University Hospital i Liege og alle raske forsøgspersoner gav skriftlig informeret samtykke til deltagelse.

1. sputum induktion

  1. Før og efter bronkodilatator Spirometri
    1. Udføre en Spirometri (tvunget ekspiratorisk volumen i 1 sekund [FEV1] og tvungen vital kapacitet [FVC] manøvre) Ifølge den amerikanske thorax samfund (ATS) / europæiske Respiratory Society (ERS) standardkriterier12.
    2. Administrere 400 µg af inhaleret salbutamol fra en målte dosis inhalator (MDI) gennem en spacer enhed.
      Bemærk: I voksne, utilsigtede hændelser af inhaleret salbutamol omfatte tremor og takykardi13.
    3. Gentag Spirometri (FEV1 og FVC manøvre) 15 min senere, ifølge ATS/ERS standardkriterier12.
  2. Forberedelse af den ultrasonisk forstøver
    Bemærk: Forstøver skal grundigt rengøres og desinficeres før hver anvendelse i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger.
    1. Fyld nebulizer kammer med destilleret vand op til det anbefalede niveau.
    2. Placer en ren kop i salen, forstøver.
    3. Dække cup med passende låg.
    4. Fylde koppen med enten 50 mL af hypertonisk saltvand (5%) for en patient med post bronkodilatator FEV1 > 65% forudsagt eller 50 mL isotonisk saltvand (0,9%) for en patient med post bronkodilatator FEV1≤65% forudsagt.
    5. Tilføje 1,75 mL af salbutamol sulfat (5 mg/mL) til cup.
    6. Tilslut rør og ventiler i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger.
  3. Nebulization og opspyt samling
    Bemærk: Udføre teknik under lægeligt tilsyn.
    1. Forklar proceduren til patienten.
    2. Bede patienten om at bruge en næse klip.
    3. Tænd forstøver og vælg det laveste niveau af aerosol- og fan indstillinger.
    4. Bede patienten om at inhalere aerosoler gennem mundstykket med tidevandsenergi vejrtrækning i 5 min.
      Bemærk: Aerosol og fan indstillinger kan øges afhængigt af patientens tolerance.
      1. Uudholdelig hoste eller kvalme, Afbryd proceduren og gå til trin 1.3.5.
      2. Trykken for brystet eller respiratorisk ubehag, skal du gå til trin 1.3.8.
    5. Slukke forstøver.
    6. Bede patienten om at fjerne næse klip, skyl munden med vand og gurgle to gange før du kassere det i vasken.
      Bemærk: Spyt celler kan forurene sputum prøven og føre til en ubrugelig prøve.
    7. Bede patienten om at hoste op sputum i en plastikbeholder.
    8. Udføre en Spirometri (tvunget ekspiratorisk manøvre) for at måle FEV1.
    9. Evaluere FEV1 fald som følger: (FEV1 målt i trin 3.8 [mL]) - (efter bronkodilatator FEV1 målt i trin 1.3 [mL]) / (efter bronkodilatator FEV1 målt i trin 1.3 [mL]) * 100.
      1. Hvis FEV1 falder med 20% eller mere fra værdien efter bronkodilatator, Afbryd proceduren. Måling af FEV1 igen 10 min senere. Hvis FEV1 falder 20% eller mere, bede lægen om at administrere forstøves ipratropiumbromid bromid (0,25 mg/2 mL) og holde patienten under medicinsk observation. Gå til trin 1.3.10.
      2. Hvis FEV1 ikke falder med 20% eller mere fra værdien efter bronkodilatator, Gentag trin 3,2 til 3,9 én til tre gange at nå frem til en total nebulization tid på 10-20 min.
        Bemærk: Den samlede nebulization tid vil afhænge kvalitet (tilstedeværelse af stik eller tyktflydende dele) og mængden af spyt prøve. Hvis prøven kvalitet og/eller varemængden er dårlig efter 10 min af nebulization, bør proceduren udvides til at nå frem til en total nebulization tidspunktet for 15 til 20 min.
    10. Hold spyt prøve nedkølet indtil behandling.

2. spyt behandling

Bemærk: Behandle spyt inden 3 timer efter prøveudtagningen for optimale cellernes levedygtighed.

Forsigtig: Bære en laboratoriekittel, beskyttelseshandsker og briller.

  1. Foreløbige præparater
    1. Gøre en 10-fold fortynding af koncentreret dithiothreitol løsning (slimløsnende middel) med sterilt destilleret vand at få 10 mL af 6.5 mM opløsning, i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger.
      Bemærk: For at forhindre koncentreret dithiothreitol løsning blander med den omgivende luft, trække løsningen fra hætteglasset med en steril sprøjte og kanyle. Når åbnet, koncentreret opløsning hætteglasset opbevares ved stuetemperatur og bruges inden 5 dage. Den fortyndede opløsning fremstilles dagligt.
      Advarsel: På grund af øjne og hud irritation hazard, bære beskyttelsesudstyr (tøj, handsker og beskyttelsesbriller).
    2. Gøre en 5-fold fortynding af trypan blå løsning (0,4%) med Dulbecco's Phosphate-Buffered saltvand (DPBS) at opnå en 0,08% løsning. Holde denne fortyndede opløsning ved stuetemperatur og brug inden for 2 uger.
      Advarsel: På grund af kræftfremkaldende farer, bære beskyttelsesudstyr (tøj, handsker og beskyttelsesbriller).
  2. Samling af Sputum supernatanten
    1. Overføre hele spyt i en 50 mL konisk bund plastikrør og vejer prøven.
    2. Tilføje en 3-fold vægten af DPBS løsning.
    3. Langsomt vortex prøve for 30 s.
    4. Centrifuger på 800 x g og 4 ° C i 10 min.
    5. Filtrer prøven gennem 2 enkelt lag af steril gaze og indsamle supernatanten i en 50 mL konisk bund plastikrør.
    6. Alikvot supernatanten i 2 mL plastik rør og opbevar dem ved-80 ° C.
      Bemærk: Supernatanten prøver er nyttige til assay spyt flydende fase komponenter.
  3. Sputum Mucolysis
    1. Hvis det er nødvendigt, skal du tilføje DPBS til celle pellet at nå frem til en samlet maengde paa cellesuspension af 5 mL.
    2. Fortyndet cellesuspension med 1 bind af 6.5 mM dithiothreitol. Bruge en bænk rocker til rock cellesuspension i 20 min. ved stuetemperatur.
      1. Gentag mindst 3 gange med DPBS.
    3. Der centrifugeres i fortyndet cellesuspension ved 550 x g og 4 ° C i 10 min.
Supernatanten.
  • Resuspenderes celle i omkring 1 mL DPBS.
  • Vurdering af kvalitative egenskaber af sputum prøven (celle koncentration, planocellulært forurening og levedygtighed af Trypan blå udstødelse metode) ved hemocytometer tælle
    1. Vurdere og registrere cellesuspension nøjagtige volumen.
    2. Tilsæt 50 µL af cellesuspension til 50 µL af opløsningen 0,08% trypan blå og homogeniseres.
    3. Lagt prøve under coverslip af en hemocytometer (Thoma kammer) og placere den under den optisk mikroskop (400 X).
    4. Tælle de planocellulære celler, levende ikke-planocellulære celler (uncolored celler) og de døde ikke-planocellulære celler (blå farvet celler).
      Bemærk: I tilfælde af for lavt eller for højt celle tæthed, koncentrere sig eller udvande cellesuspension og gentage trin 2.4.1-2.4.3.
    5. Vurdere den celle koncentration af suspension, procentdelen af planocellulære celler, og procentdelen af levedygtigheden af ikke-planocellulære celler.
      Bemærk: Beregne den samlede ikke-squamous celle count/g af sputum: celle koncentration af suspension (trin 5.4) * volumen af cellesuspension (trin 4.8) * % af ikke-planocellulære celler / vægt af sputum prøven (trin 2.2.1).
  • Forberedelse af en farves cytospin slide med cellesuspension og opbevaring af resterende celler, hvis nødvendigt
    Bemærk: Hvis cellesuspension indeholder mere end 80% planocellulære celler, prøven anses for fattige kvalitet og uegnet til en cytospin slide14. I så fald skal ophøre med behandlingen og overveje dette eksempel forgæves.
    1. Fortynde en alikvot af cellesuspension med DPBS at få mindst 350 µL af en cellesuspension ved 500.000 celler/mL.
    2. Samle den celle koncentrator i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger.
    3. Fyld hver af de 3 rum celle koncentrators med 100 µL af denne cellesuspension.
    4. I en cytocentrifuge, spin for 2 min. ved 150 x g og stuetemperatur. Kassér analysere.
    5. Demontere den celle koncentrator i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger.
    6. Tillad dias til luft tørre.
      Bemærk: På dette stadium, resterende celler kan gemmes i en tilstrækkelig buffer hvis behov for yderligere eksperimenter.
    7. Pletten dias med en kommerciel farvning kit (Se Tabel af materialer), i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger.
    8. Mount diaset med en egnet montering medium og en cover slip.
    9. Placer slide under optisk mikroskop (600 X) med immersionsolie.
    10. Regne mindst 500 ikke-planocellulære celler: neutrofiler, eosinofile, makrofager, lymfocytter og epitelceller.
      Bemærk: Differential celletal er normalt udføres af kun én eller to dedikeret og uddannet observatører at begrænse interobserver uoverensstemmelser.
    11. Optag absolutte værdier og procenter af hver celletype.

    • Representative Results

    Hemocytometer
    Et typisk billede er vist i figur 1 , der er visualiseret med mikroskop ved hjælp af hemocytometer. Planocellulære celler er let identificeres, da de er meget større end de ikke-planocellulære celler. Disse planocellulære celler er epitelceller kommer fra munden. Begge typer af celler er plettet af Trypan blå når død. Forsigtighed skal træffes for at undgå tælle gær, bakterier og skrot.

    Figure 1
    Figur 1 : Hemocytometer billede viser (A) en levende ikke-squamous celle, (B) en død ikke-squamous celle, og (C) en squamous celle. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Cytospin slide: figur 2 viser et repræsentativt billede af en cytospin dias opnået efter sputum forarbejdning. De forskellige celletyper (neutrofiler, eosinofile, makrofager, lymfocytter og epitelceller) kan differentieres ved hjælp af deres morfologi og farvning. I nogle tilfælde kontaminering af planocellulære celler kan være vigtig, og hvis procentdelen af planocellulære celler er større end 80%, prøven anses mislykket (figur 3).

    Figure 2
    Figur 2 : Cytospin slide billede viser (A) en neutrofile, (B) en makrofag, (C) en eosinofil, (D) en lymfocyt og (E) en epitelcelle. Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 3
    Figur 3 : Eksempel på en dårlig kvalitet cytospin dias med > 80% af planocellulære celler. Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Succesrate
    I vores afdeling, succesraten af proceduren (kombinerer en vellykket induktion og en læsbar cytospin), baseret på en stikprøve af 1.129 patienter (raske forsøgspersoner, astmatikere eller KOL patienter), er 82% (924/1,129). I en sub analyse efter typen af patienter er succesraten 75% (57/76) hos raske forsøgspersoner, 82% (827/1.004) hos astmatikere og 82% (40/49) i KOL-patienter.

    Resultater hos raske forsøgspersoner
    I en retrospektiv analyse af en række 289 raske forsøgspersoner fra vores afdeling, median (interkvartil rækkevidde) sputum vægt var 3.72 g (interkvartil vifte af 2,46 g - 5,54 g) og median samlede ikke-squamous celle count/g af sputum 0,59 x 10 ()6 interkvartil række 0,37 x 106 - 1.29 x 106).

    I de raske forsøgspersoner, andelen af planocellulære celler er lav på 19% (10% - 34%) og levedygtighed er høj på 66% (54-78%). Med hensyn til andelen af de forskellige celletyper, resultaterne er sammenfattet i figur 4A. Vi kan iagttage at procentdelen af makrofager (49% [31-68%]) er højere end procentdelen af neutrofiler (34% [14% - 60%]), mens procentdelene af lymfocytter (2% [1-3%]), eosinofile (0% [0-0%]) og epitelceller (4% [2-11%]) er lav. Disse resultater er ens, når data er udtrykt i absolutte værdier (figur 4B).

    Figure 4
    Figur 4 : Repræsentative resultater af differential celletal observeret hos raske forsøgspersoner udtrykt som procenter af (A) eller (B) absolutte værdier. Resultaterne er vist som median (interkvartil rækkevidde). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Det er også vigtigt at tage hensyn til en alder af patienter. Faktisk, en stærk korrelation er til stede mellem patientens alder og andelen af neutrofiler i spyt prøver (figur 5). Ligeledes, når klassificere patienter efter 10 års aldersgrupper (figur 6), vi observeret en betydelig stigning i den neutrofile procentdel med stigende aldersgruppe. Derfor, denne variabel skal overvejes, når man sammenligner resultaterne fra forskellige årgange, og forsigtighed skal træffes i matchende af emner.

    Figure 5
    Figur 5: Korrelation mellem alder og opspyt neutrofile procentdel. Korrelationen blev beregnet med Spearman test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 6
    Figur 6: Evolution af den neutrofile procent ifølge alderskategori. P-værdien af ANOVA blev < 0,0001 til sammenligning af neutrofile procent mellem aldersklasser. Flere var sammenligninger med Dunns flere sammenligninger test. P-værdier er repræsenteret som følger: * p < 0,05, ** p < 0,01, og *** p < 0,001. Resultaterne er vist som median (interkvartil rækkevidde). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Resultater i patienter, der lider af luftvejssygdomme
    Teknik af provokeret sputum er almindeligt anvendt til at vurdere den inflammatoriske celle profil i astmatisk patienter.Denne teknik kan også anvendes til patienter med KOL, en anden inflammatoriske luftvejssygdomme. Når man sammenligner raske forsøgspersoner, astmatikere og KOL-patienter (de 3 grupper der matchede for alder, køn og tobak vaner), konstaterede vi, at den inflammatoriske celler profil er helt anderledes mellem disse kohorter (figur 7). Faktisk, astmatisk patienter er normalt karakteriseret ved hævet spyt eosinofile, mens andelen af sputum neutrofile er normalt højere hos KOL patienter sammenlignet med raske kontrolpersoner, som er knyttet til sygdommens sværhedsgrad.

    Figure 7
    Figur 7 : Sputum inflammatoriske celle profil af raske forsøgspersoner (n = 45), astmatisk patienter (n = 108), og KOL-patienter (n = 54). De tre grupper blev matchet til køn, alder og tobak vaner. P-værdier af ANOVA blev < 0,05, < 0,0001, og < 0,0001 til sammenligning af neutrofiler, eosinofile, og makrofager mellem grupper, henholdsvis. Flere var sammenligninger med Dunns flere sammenligninger test. P-værdier er repræsenteret som følger: * p < 0,05 og *** p < 0,001. Resultaterne er vist som median (interkvartil rækkevidde). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Discussion

    Metoden provokeret sputum er et nyttigt redskab til at undersøge luftvejene rum. Der er flere mulige anvendelser af denne teknik. Først, kan det forbedre viden om immunceller og mekanismer involveret i forskellige luftvejssygdomme. For eksempel, denne teknik har tilladt undersøgelsen af luftvejs inflammation i store kohorter af patienter, og det har vist at ca. halvdelen af astmatiske patienter er karakteriseret ved en unormal luftvejene eosinofil inflammation15, 16 , 17, mens KOL patienter normalt udviser en hævet spyt neutrofile tæller18. Denne teknik har også bidraget til bedre karakterisering af luftvejs inflammation hos patienter med idiopatisk lungefibrose og beviser mæglere, der kan bidrage til denne sygdom19. Andet kan teknik af provokeret sputum være nyttigt at forudsige respons på behandlingen. For eksempel, har tilstedeværelsen af en unormal procentdel af sputum eosinofile vist sig at være en intelligent markør af kortikosteroid lydhørhed11,18. I astma og KOL, blev skræddersy dosis af kortikosteroider til at normalisere procentdelen af sputum eosinofile vist sig at være mere effektiv i faldende antallet af eksacerbationer end justere behandling i henhold til de aktuelle kliniske retningslinjer11 ,20,21. For det tredje, sputum analyse kan bidrage til at udvikle målrettede behandlinger. For eksempel, har tilstedeværelsen af en unormal antal sputum neutrofiler i KOL og nogle astmatisk patienter ført til udviklingen af antineutrophilic behandlinger11. For det fjerde, teknikken kan spille en rolle i diagnose. For eksempel, er tilstedeværelsen af sputum eosinofili nødvendigt at stille en diagnose af ikke-astmatiker eosinofil bronkitis11.

    Udover at opnå en differentieret celletal, en teknik, inducerende sputum giver også mulighed for udførelsen af mange yderligere analyser, ved at studere enten sputum supernatanten eller sputum celler. Eksempler med spyt supernatanten analyse af mæglere8,19,22 og vurdering af stikprøve for eosinofile22kemotaktisk aktivitet. Fra sputum celler, RNA kan udvindes og anvendes til mikroRNA eller genekspression analyserer19,23 . Sputum cellerne kan også analyseres af flow flowcytometri9,23 , som giver mulighed for blandt andet Immunofænotypning og sortering celler. Derudover sputum celler kan være kulturperler10, og deres mægler produktion kan være målte in vitro-24. Det er værd at bemærke, at i dette tilfælde, mægler indhold er forskellige fra hvad kan findes i spyt supernatanten. Faktisk, mæglere i sputum supernatanten kan være påvirket af sekret fra luftvejene bosiddende celler og plasma udsondring, i modsætning til sputum celle kultur model24. Endelig kan immuncytokemi og i situ hybridisering også udføres ved hjælp af sputum celler7.

    Provokeret sputum teknik har nogle begrænsninger. Induktion skal udføres under lægeligt tilsyn. Det er også afgørende for den erhvervsdrivende til at give grundig vejledning til patienter. Andre begrænsninger omfatter samarbejde og medicinsk tilstand af patienter, som respiratoriske indsats. Med hensyn til gennemførligheden af denne teknik i børn, flere undersøgelser har rapporteret, at det var vellykket og sikker hos børn ældre end 6 år25. Data om børn af < 6 år mangler25, men det er sandsynligt, at spyt induktion er vanskelig at udføre i disse børn14. Teknikken er i øjeblikket begrænset til forskning tjenester og specialiserede centre, fordi det er teknisk krævende, tidskrævende, og det kræver uddannet personale1. En anden begrænsning er, at teknikken af sputum induktion og analyse ikke er altid vellykket, hvilket betyder, at en læsbar cytospin ikke altid opnås26. Men succesraten er normalt omkring 80% i forskellige kohorter af patienter4,26,27,28,29. Endelig skal udvises forsigtighed, når man sammenligner forskellige kohorter af patienter med hensyn til matching af alder, som det blev vist at påvirke sputum celle tæller30,31. På samme måde har andre parametre såsom køn og tobak vaner at blive matchet, da de kan også påvirke sputum celle tæller29,32. Når patienten matchende ikke er muligt, er en anden måde at tage hensyn til alder, køn eller rygning status justere den statistiske analyse for disse variabler.

    Sammenlignet med andre teknikker, der tillader indsamling celler fra luftvejene, ligesom biopsier og bronchoalveolar lavages, har provokeret sputum metode fordelene ved at være simpelt, veltolereret, sikker, reproducerbar, omkostningseffektiv og non-invasiv. Disse fordele tillade provokeret sputum teknik skal udføres på en stor skala og gentagne gange over tid, og gøre det en alternativ valg for luftvejene prøveudtagning. Bronchosorption er en anden teknik, der tillader indsamling af slimhindebelægning væske for at vurdere luftvejene mæglere33. Mens denne teknik (kræver bronkoskopi) er mere indgribende end provokeret sputum, har det fordele af at undgå enhver form for kontaminering med spyt og opnå højere koncentrationer af mæglere end i bronchoalveolar lavage33.

    Kritiske trin kræver opmærksomhed i protokollen. Først, forsigtighed skal tages vedrørende den saltholdige koncentration og tid af induktion, fordi disse to parametre kan påvirke resultaterne og skal derfor være standardiserede34,35. Andet, mucolysis med DTT er et vigtigt skridt i behandlingen. Forhold til PBS, blev DTT vist at bedre sprede sputum celler7, som forbedrer cytopsin slide kvalitet og er vigtigt at have en reproducerbar celle tæller2. Men den slimløsnende middel kan interferere med måling af biokemiske komponenter.Spiking eksperimenter skal derefter udføres, når du måler en ny biokemiske sammensatte36. Endelig, en anden kritisk trin af proceduren er cellen tælle skridt, som skal udføres af en uddannet tekniker at sikre pålidelige og fortolkelige resultater.

    En alternativ metode ved hjælp af sputum stik (viscid eller tættere dele), i stedet for hele spyt er også beskrevet i litteraturen7. Begge teknikker har fordele og ulemper. Hele sputum teknik giver mulighed for hurtigere behandling7, men er ofte forurenet med spyt, som udvander prøven og kan forringe kvaliteten af cytospins2,7. Med plug udvalg teknik, er spyt forureningen reduceret, hvilket betyder, at prøver ofte er af bedre kvalitet for dosering af flydende fase mæglere og cytospin dias7. Behandlingen er dog længere7 og valgte stik kan ikke være repræsentative for hele stikprøven37. Det er også værd at bemærke, at ikke alle prøver indeholder stik, som kan være begrænsende. Begge metoder er valideret og reproducerbar, og der er i øjeblikket ingen beviser, at differentieret celle tæller fra begge disse metoder er forskellige14,38.

    I fremtiden, kunne provokeret sputum bruges som et klinisk værktøj til at give biomarkører for undersøgelse, diagnose og forvaltning af alle former for inflammatoriske luftvejssygdomme.

    Disclosures

    Forfatterne har ikke noget at oplyse.

    Acknowledgments

    Dette arbejde blev støttet af University Hospital af Liege (CHU Liege). Vi anerkender "Øjeblikke produktioner" for video-produktion. Vi anerkender også Cedric François, patienten, der dukkede op i filmen.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Spirometer - Spirobank MIR France
    Salbutamol MDI - Ventolin GLAXOSMITHKLINE CNK: 0135-913 See drug available in the country
    Nebulizer UltraNeb DeVilbiss Healthcare USA UltraNeb U3000
    Devilbiss UltraNeb Disposable Cups & Lids DeVilbiss Healthcare USA 100HD-647
    DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers DeVilbiss Healthcare USA 1001005879
    One-way Valves Hudson RCI USA 41664
    One-way Valves Hudson RCI USA 41665
    Aerosol T-connector  Hudson RCI USA 41077
    Ventilation circuit monobranch corrugated Int'Air Medical France TA30A
    NaCl 5 %  / / Produced by our hospital pharmacy
    Mini-Plasco NaCl 0.9% B.Braun Medical  Diegem Belgium
    Salbutamol sulfate 5 mg/mL - Ventolin GLAXOSMITHKLINE CNK: 0094-987 See drug available in the country
    Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL - Atrovent Boehringer Ingelheim Germany CNK: 1543-305 See drug available in the country
    Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline LONZA Belgium BE17512F
    Sputolysin reagent Calbiochem 56000
    Trypan blue 0.4% solution 100 mL LONZA Bio Whittaker Belgium 17-942E
    Hemocytometer - Thoma chamber Labor Optik Lancing UK 1500000
    Hemacolor Stainig set Merck Belgium 1116610001 Alternative product  : Diff Quik Staining Set
     Medion Diagnostic 
    Mounting medium - Entellan Merck Belgium 107960
    Statspin Cytofuge 12  Beckman Coulter Belgium X00-003066-001

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice. European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).
    2. Pavord, I. D., Pizzichini, M. M., Pizzichini, E., Hargreave, F. E. The use of induced sputum to investigate airway inflammation. Thorax. 52 (6), 498-501 (1997).
    3. Leigh, T. R., et al. Sputum induction for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. The Lancet. 334 (8656), 205-206 (1989).
    4. Pin, I., et al. Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma. Thorax. 47 (1), 25-29 (1992).
    5. Pizzichini, M. M. M., Leigh, R., Djukanović, R., Sterk, P. J. Safety of sputum induction. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 9s-18s (2002).
    6. Delvaux, M., et al. Nebulised salbutamol administered during sputum induction improves bronchoprotection in patients with asthma. Thorax. 59 (2), 111-115 (2004).
    7. Efthimiadis, A., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 19s-23s (2002).
    8. Kelly, M., et al. Analysis of fluid-phase mediators. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 24s-39s (2002).
    9. Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
    10. Vignola, A. M., et al. Future directions. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 51s-55s (2002).
    11. Brightling, C. E. Clinical applications of induced sputum. Chest. 129 (5), 1344-1348 (2006).
    12. Miller, M. R. Standardisation of spirometry. European Respiratory Journal. 26 (2), 319-338 (2005).
    13. Global Initiative for Asthma (GINA) Global Strategy for Asthma Management and Prevention. , http://www.ginasthma.org/ (2017).
    14. Szefler, S. J., et al. Asthma outcomes: biomarkers. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3 Suppl), S9-S23 (2012).
    15. Douwes, J., Gibson, P., Pekkanen, J., Pearce, N. Non-eosinophilic asthma: importance and possible mechanisms. Thorax. 57 (7), 643-648 (2002).
    16. Schleich, F. N., et al. Importance of concomitant local and systemic eosinophilia in uncontrolled asthma. The European Respiratory Journal. 44 (1), 97-108 (2014).
    17. Demarche, S., et al. Detailed analysis of sputum and systemic inflammation in asthma phenotypes: are paucigranulocytic asthmatics really non-inflammatory? BMC pulmonary medicine. 16, 46 (2016).
    18. Pavord, I. D., et al. Clinical applications of assessment of airway inflammation using induced sputum. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 40s (2002).
    19. Guiot, J., Henket, M., Corhay, J. L., Moermans, C., Louis, R. Sputum biomarkers in IPF: Evidence for raised gene expression and protein level of IGFBP-2, IL-8 and MMP-7. PLOS ONE. 12 (2), e0171344 (2017).
    20. Green, R. H., et al. Asthma exacerbations and sputum eosinophil counts: a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9347), 1715-1721 (2002).
    21. Siva, R., et al. Eosinophilic airway inflammation and exacerbations of COPD: a randomised controlled trial. European Respiratory Journal. 29 (5), 906-913 (2007).
    22. Louis, R., et al. Cell infiltration, ICAM-1 expression, and eosinophil chemotactic activity in asthmatic sputum. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 466-472 (1997).
    23. Maes, T., et al. Asthma inflammatory phenotypes show differential microRNA expression in sputum. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1433-1446 (2016).
    24. Moermans, C., et al. Local and systemic cellular inflammation and cytokine release in chronic obstructive pulmonary disease. Cytokine. 56 (2), 298-304 (2011).
    25. Gibson, P. G., et al. Sputum induction in children. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 44s-46s (2002).
    26. Reddel, H. K., et al. An Official American Thoracic Society/European Respiratory Society Statement: Asthma Control and Exacerbations: Standardizing Endpoints for Clinical Asthma Trials and Clinical Practice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 180 (1), 59-99 (2009).
    27. Duncan, C. J. A., Lawrie, A., Blaylock, M. G., Douglas, J. G., Walsh, G. M. Reduced eosinophil apoptosis in induced sputum correlates with asthma severity. The European Respiratory Journal. 22 (3), 484-490 (2003).
    28. Demarche, S. F., et al. Asthma Control and Sputum Eosinophils: A Longitudinal Study in Daily Practice. The Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 5 (5), 1335-1343 (2017).
    29. Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2 Pt 1), 475-478 (2000).
    30. Brooks, C. R., Gibson, P. G., Douwes, J., Dalen, C. J. V., Simpson, J. L. Relationship between airway neutrophilia and ageing in asthmatics and non-asthmatics: Airway neutrophilia and ageing. Respirology. 18 (5), 857-865 (2013).
    31. Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
    32. Chalmers, G. W., et al. Smoking and airway inflammation in patients with mild asthma. Chest. 120 (6), 1917-1922 (2001).
    33. Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma: Increased Interferons (IFN-γ and IFN-λ) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. 19, 128-138 (2017).
    34. Popov, T. A., et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis). European Respiratory Journal. 8 (4), 559-565 (1995).
    35. Holz, O., et al. Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days. Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).
    36. Louis, R., et al. The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum. European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).
    37. Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects. American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
    38. Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination. The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).

    Tags

    Medicin spørgsmål 130 mennesker Sputum supernatanten betændelse i luftvejene eosinofile neutrofiler makrofager lymfocytter epitelceller lungesygdomme
    Metodologi for Sputum induktion og laboratorium behandling
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Guiot, J., Demarche, S., Henket, M., … More

    Guiot, J., Demarche, S., Henket, M., Paulus, V., Graff, S., Schleich, F., Corhay, J. L., Louis, R., Moermans, C. Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing. J. Vis. Exp. (130), e56612, doi:10.3791/56612 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter