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Biology

蛍光灯、摂取昆虫における流体吸収能力を決定するための磁気ナノ粒子

doi: 10.3791/56619 Published: December 20, 2017

Summary

流体食性昆虫は、多孔性の表面の液体の微量を取得する能力を持っています。このプロトコルでは、直接蛍光、磁性ナノ粒子供給溶液を用いた多孔質表面から液体を摂取する昆虫の能力を決定する方法について説明します。

Abstract

流体食性昆虫を摂取する環境では、プール、映画、または小さな毛穴に閉じ込められた液体の様々 な。口器の構造と機能の関係を評価する液体の獲得の研究が必要とただし、流体の吸収機構の解明は歴史的構造のアーキテクチャは、実験的証拠と時々 一人旅の観察から推論されます。蝶 (鱗翅目) とハエ (双翅目) の液体の少量を使用して流体吸収能力を評価する手法を報告する.昆虫は、特定の細孔径のフィルター ペーパーから蛍光、磁性ナノ粒子と混合 20% ショ糖液が供給されます。作物 (流体を格納するために使用される内部構造) は、昆虫から削除され、共焦点顕微鏡上に配置。磁石は昆虫が水分を摂取することができるかどうかを示すナノ粒子の存在を確認するための作物で手を振った。この手法を使用して、機構の解明、広範な供給 (毛細管と液体ブリッジの形成) 多孔性の表面からを供給するとき可能性のある鱗翅目、双翅目の間で共有されます。さらに、このメソッドは液餌昆虫、病気の感染、バイオミメティックス、ナノまたはマイクロ導管を含む可能性のある他の研究で重要なを含むさまざまな機能の研究使用できます、液体の輸送には、検証が必要です。

Introduction

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多くの昆虫のグループ (proboscises) の口器がある適応流体を供給するため、花の蜜、果実の腐敗など sap フロー (例:双翅目1、鱗翅目2膜翅目3)、木部 (半翅目4)、涙 (鱗翅目5) と血 (目, シラミ目6ノミ7、双翅目78半翅目、鱗翅目9)。流体を餌に昆虫の能力は生態系の健全性 (例えば受粉10)、病気伝達4,11生物2,12、および研究に関連します。収斂進化13。多彩な食料源、にもかかわらずいくつかの流体餌昆虫の中でテーマとマイクロやナノ液滴、液膜または多孔性の表面に限定されるが、液体の少量を取得する機能です。

流体食性昆虫 (すべての動物種の14,15の 20% 以上) と様々 な食料源を餌に能力の膨大な多様性を与えられた彼らの餌を理解動作流体吸収機構の解明、多くの分野で重要であります。昆虫の口器の機能、たとえば、バイオミメティック技術、例えば少量の流体が用いられるものと同様の方法を使用しての取得などのタスクを実行できるマイクロ流体デバイスの開発の役割を果たしています。昆虫16。流体吸収メカニズムの研究における根本的な問題は、流体、昆虫のフィード方法のみを決定するが、メカニズムをサポートして実験的証拠を取得します。のみ動作を使用して (例えば、テング12,17プロービング) 流体の正常な吸収を確認しませんも、それがルートを決定するための手段を提供するため、供給のための指標が十分なこと流体の旅行昆虫を通過するとき。また、少量より流体の実験を実行する流体が制限リソース2,12自然の供給シナリオを表します。

位相コントラスト イメージング多孔性の表面12から液体の少量で蝶がどのようにフィードを評価するオオカバマダラ (オオカバマダラl.) を併用した x 線します。モナルカ蝶フード運河に小さな毛穴に閉じ込められた流体をもたらすテングに沿って毛細管を介して表皮突起 (背 legulae) の間にスペースを使用します。着信の流体は、成長し高原不安定12,18, 頭に吸引ポンプの作用で、蝶の腸を運ばれる液体の橋に崩壊食品管壁のフィルムを形成します。X 線位相コントラスト イメージング昆虫12,19,20,21内の流体の流れを可視化するための最適なツールですが、テクニックはすぐに利用できるより便利メソッドは、昆虫の能力吸収液の迅速な評価のために必要ですし、摂取します。

D. plexippusの供給メカニズム適用他の鱗翅目に、ハエ (双翅目)、(両方のグループが多孔性の表面の液体のフィード) かどうかを決定する Lehnert13には、ここで詳細に報告されている多孔性の表面の液体の少量を餌に昆虫の能力を評価するための手法が適用されます。ここで説明したプロトコルは接液部を使用して研究と多孔質の表面、プール供給メカニズムのアドレスなど、他の研究方法論を変更できます。また、アプリケーションは、マイクロ流体システムと材料技術など、あらゆる分野に拡張します。

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Protocol

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1. 昆虫種、ソリューションおよび供給ステーションのセットアップの準備

注: 流体吸収能力、口器形態22,23に関する以前の研究の使用のため、キャベツ蝶 (モンシロチョウL.、シロチョウ科) は代表チョウ目の種として選択されます。家 (イエバエL., イエバエ科) や青いボトル蠅 (オオクロバエ vomitoria L., クロバエ科) は、彼らは多孔性の表面の13の餌、多く観察されるために使用されます。

  1. それら人工のダイエット (材料の表を参照してください) 蛹環境室の大人として浮上するまで昆虫のサプライヤーとリアから幼虫として順序モンシロチョウは 23 ° C、18 L: 6 日長に設定。順序Mイエバエと蛹としてC. vomitoriaモンシロチョウと同じ環境条件でリアのそれら。彼らは供給実験前蛹から出てくる後は、チョウ類成虫、ハエを給紙されません。
  2. 20% ショ糖液 (コントロール) と流体吸収をテストする 20% ショ糖ナノ粒子溶液を準備します。蛍光磁性ナノ粒子を追加することによってナノ粒子溶液を準備 (鉄酸化物ポリアクリル酸コーティング、約 20 nm 径の) 20% ショ糖液 (1 Mg/ml と dH2O ナノ粒子と 20% スクロースを24ソリューションには、1:1)。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 1 x ソリューションの準備 (10 x dH2O、pH 7.4 で 1 倍に希釈)、解剖に使われます。
  3. 手動式マニピュレーターのクランプと別の餌ステージ (平らなプラットフォーム) で構成される供給ステーションの設定 (図 1)。摂食の段階に凹面のスライドを配置、毛穴サイズ直径 1、5、8、11、20、30、41、または 60 μ m、膜フィルターの孔のサイズ径ナイロン ネット フィルターまたは供給実験の近くに 10 μ m。

2. 餌のプロトコル

  1. 昆虫の体、足と翼を折りたたんだティッシュ ペーパーにラップします。虫の位置を頭と口器のみが公開されます。昆虫、昆虫摂食の段階 (図 1) 上記の中断は、マニピュレーターをクランプによってまとめられる 2 つの顕微鏡のスライド間の翼に配置します。
  2. 凹面のスライドの中央に 20% ショ糖溶液のマイクロ ピペットで 20% ショ糖ナノ粒子液 30 μ L の液滴を管理します。ナノ粒子溶液の液滴とフィルター紙の中心が揃うように、凹面のスライドに特定の細孔径の単一のフィルター紙を置きます。液滴とろ紙の間お問い合わせは満ちる気孔 (図 1)、フィルター紙に沿って広がっているソリューションの結果します。
    注: フィルター ペーパーは、昆虫がフィード フィルター紙の上にナノ粒子が存在する可能性を最小限に抑えるため、周りの他の方法ではなく、液滴の上部に配置されます。
  3. 口器の遠位領域のみの摂食の段階 (図 1) 接液部のフィルター ペーパーを連絡することができるように、マニピュレーターを持つ昆虫を配置します。虫ピンを使用してフィルター紙の上に口器を拡張し、45 のフィードに昆虫を許可する s。
  4. フィルター ペーパーの表面に存在するかもしれない液体の膜にする昆虫のチャンスを最小限に抑えるために口器の位置 (すなわちスライドの平らな部分に触れているろ紙の部分と接触しているので。、スライドの凹の部分の上に直接ではなく)。虫餌に興味を表現していない、口器は餌の時間の期間のろ過紙、虫ピンに保持することができます。

3. 解剖

  1. 昆虫の体をカバーする十分な解決策があるので、50 ミリメートル時計ガラスに PBS のソリューションを配置します。時計ガラス、万国実体写真の横にある装置 (春マイクロはさみ、昆虫ピン、鉗子を切り裂く細かい点を解剖) を解剖位置と昆虫の下に配置します。
  2. 授乳後ティッシュ ペーパーから昆虫を削除し、翼を閉じた状態でそれを保持します。春の微小解剖はさみで頭、足、および昆虫の翼を取り外し、時計ガラス (図 2) PBS 溶液で昆虫を置きます。
  3. 必要な場合は、解剖前に昆虫を麻酔します。腹部遠位近傍キューティクルによって昆虫を保持するために鉗子を使用します。支配的な手で胸部に達するまで後端から始まる、腹部の側面に沿って前方方向でキューティクルをカットするのにはさみを解離性春マイクロを使用します。表皮だけをカットし、(図 2) が破損している昆虫の中の消化管ではないことを確保するための特別な注意を取る。
  4. 消化管内部 (図 2) を明らかにする腹部を開く解剖はさみでキューティクルの追加カットを作る。昆虫ピンの支援を受けて腹部キューティクル、脂肪体と他の構造を削除し、時計ガラスの胸部と消化管だけを残して後の処分のため時計のガラスの外にそれらを再配置します。
    注: 解剖胸部と腹部の合流点近くに位置する嚢のような構造 (消化管の延長) である作物が表示されます。
  5. 作物が公開されていない場合は、作物を明らかにするまで、はさみで胸郭に追加切開を確認します。作物が表示、時計ガラス (図 2) で作物と消化管だけを残して昆虫の残りの部分を切り取る。
    注: 鱗翅目昆虫の作物はほぼ透明で流体がないかどうかと、展開を認識することは困難かもしれない性質または解剖中切ってかどうかセロファンのような。
  6. その後画像 (図 2) の coverslip (24 mm × 24 mm) の上に作物を配置するのに鉗子を切り裂く細かい点を使用します。

4. 摂取されたナノ粒子の定量

  1. 位置、細かい点を解剖鉗子使用して coverslip の作物は作物の破裂を防ぐために注意します。20 倍の倍率で画像を倒立顕微鏡で CY3 チャネル (または位相) を使用します。乾燥からそれを防ぐために郭清後すぐに作物をイメージします。
  2. 顕微鏡の動作段階の制御ではない手で電磁攪拌バー (41.3 mm の長さと直径 8 mm) を保持します。
前後それぞれモーション約 1 秒 (図 2) では、作物 (作物から約 10 mm 距離) の近くに来たり、電磁攪拌棒を振る。
  • 電磁攪拌棒が振られる間は、ナノ粒子の作物を検査します。ほぼ透明な作物内でナノ粒子の動きのための顕微鏡の接眼レンズをのぞきながら、前後営業ステージをゆっくりと移動します。ナノ粒子が作物である場合肯定的な給餌を示す彼らは応答と波磁気と一体で攪拌棒 (図 2)。
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    Representative Results

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    液餌昆虫の中で流体吸収能力のパターンの研究には、餌が発生したときの決意が必要です。ここで説明したプロトコルを使用して、鱗翅目、双翅目の13の間制限の細孔サイズ仮説をテストしています。制限の細孔サイズ仮説は、細孔径が供給管12の直径より小さい場合は、液体充填孔から液餌昆虫を与えることができない状態します。毛穴で液体を保つ毛管圧力を克服するために、行動する吸引ポンプの液体の表面を提供するために、多孔質の表面から受信した流体は高原不安定18を介して安定の液体ブリッジを形成しなければなりません。(図 3) の異なるサイズの導管を給餌昆虫は、そこから彼らはフィードすることができます最小孔径が異なると予測されています。

    それぞれの種に対して制限の細孔径は、ろ紙13の特定の細孔径を餌に 50% テストの個人の能力に基づいて計算されます。昆虫 20% ショ糖液 (コントロール) を与え、収穫物ナノ粒子を持っていなかった。昆虫は、ナノ粒子を摂取した場合を評価するために解剖され後の口器を遠位と近位領域 (図 3) の導管を測定する共焦点顕微鏡をイメージしました。間接原液は口器、すなわち、ブローピン電線管サイズの密接な関係および気孔のサイズを制限することを提供することの重要な場所の指標として役立つかもしれないので、遠位部と近位部の測定が行われました。毛管作用を容易にする口器の構造の証拠。モンシロチョウの proboscises の食品の管の直径は、先端近傍 (遠位測定) とテングの長さ (近位部) の 30% を測定しました。5 pseudotracheae の平均直径が遠位部の測定として使用され、口腔の開口部の直径は各フライ試料に対する近位の測定として測定しました。

    このプロトコルでは、口器の遠位電線管サイズと昆虫が (図 4) を与えることができる最も小さい気孔のサイズとの間の密接な関係を明らかにしました。証拠は双翅目の種は最初 pseudotracheae (遠位口器測定) の (近位口器測定) を開くオーラルではなく発生するの流体取り込みを示される多孔性の表面 (図 4) から供給するとき。興味深いことに、pseudotracheae の構造のアーキテクチャは、鱗翅目昆虫の口器に似ており、収斂進化13例, 毛管流体の取り込みを促進するかもしれないクチクラの構造で構成されています。制限の密接な関係の細孔サイズ口器電線管サイズは、鱗翅目、双翅目の中で流体の吸収の重要なコンポーネントとして毛細管を支持する証拠を提供しています。

    Figure 1
    図 1: 実験概要とフィーディング ステーション。(A) セットアップは、ティッシュ ペーパー (tp) で昆虫をラップし、調節可能なノブ (ak) とマニピュレーター (ma) に接続されているクランプ (cl) によってまとめられる 2 つのスライド (sl)、昆虫の羽を配置することで構成されています。昆虫のテング (pr) が凹スライド (cs) に投与ナノ粒子溶液の滴 (dr) に配置されている濾紙 (fp) には摂食の段階 (st) になっています。(B) 図液滴と凹面のスライド上にろ紙を配置。(C) ナノ粒子の液滴ソリューションに広がる多孔性餌の表面を作成する毛細管を介してフィルター紙 (矢印)。Isopore の背面の (D) 蛍光顕微鏡画像は、ナノ粒子溶液 (20 倍の倍率、CY3 チャネル) で示す毛穴 (po) (10 μ m) をフィルター処理します。表面の液膜は認められなかった。(E) 共焦点顕微鏡 z スタックのイメージ isopore フィルター (10 μ m) の細孔のナノ粒子溶液 (ns) を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

    Figure 2
    図 2: 郭清とナノ粒子検出します。昆虫 (m. イエバエここにフロリダを示す) をセキュリティで保護する (A) 鉗子 (fo) が使われます。(B) 昆虫の羽、頭と足が削除されます。(C) はさみ (sc) を使用して、腹部の側面を切開します。(D) 生殖構造 (卵など)、追加の鉗子で消化管の不要な部分が削除されます。(E) その他の構造は、作物 (cr) を分離する削除されます。(F) 分離されたトリミング ナノ粒子の存在を検出するための準備。(G) 作物がカバー スリップ (cs) に配置し、倒立顕微鏡に移動します。電磁攪拌棒 (ma) がナノ粒子の動きを引き起こす作物近い手を振った。(H) 位相差顕微鏡でC. vomitoriaの作物にナノ粒子運動 (赤い丸で説明します)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

    Figure 3
    図 3: Lepidoperan と双翅目の口器の構造します。(A) レーザー アブレーション トモグラフィー画像流体吸収用食品運河 (fc) を作成構造 (legulae) のリンクによって一緒に来る 2 つの細長い上顎 galeae で構成されている鱗翅目テング (pr) を示します。インセット (共焦点顕微鏡画像) は、テングの遠位近背 legulae (dl) を示しています。背側の legulae の間のスペースは、食品管に流体をもたらす毛管作用を提供します。(B) それぞれの C 形帽状腱膜は気管 (tr), 神経, と本質的な筋肉 (im)。(C) 双翅目の口器は、小さな管、pseudotracheae (pt) (はめ込み式の共焦点画像のように)、中央口腔オープニング (op) から放射する遠位上内 (lb)、haustellum、演壇 (ro) から成っています。レーザー アブレーション トモグラフィー画像も複眼 (ce) と上顎の脚部 (mp) を示しています。食品 (D) 運河は、口腔を開くに接続は部分的に唇 (ラ) 陰唇 (lm) で構成されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

    Figure 4
    図 4: 昆虫の口器と毛穴との関係は、彼らすることができます食べるのであるからサイズします。制限の細孔径は、近位食品運河よりもむしろ遠位口器導管の直径 (平均 ± SEM) に関連付けられます。イエバエは以下のc. vomitoriaこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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    Discussion

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    昆虫の口器機能は形態学からみた歴史的に (e.g、鱗翅目のテング機能関連飲むわら25,26);。ただし、実験的証拠が組み込まれた最近の研究は、昆虫の口器と構造機能関係2,12,13の複雑さの私達の理解のパラダイム シフトで起因しました。,22,27. レーザー アブレーション断層レントゲン写真撮影 (図 3)、マイクロ コンピューター断層撮影 (マイクロ CT)28日、共焦点顕微鏡22電子顕微鏡による23のスキャンなどの近代的なイメージング技術を提供ための機会の詳細な形態学、機能のための証拠は実験を伴う必要があります。

    ここで説明する方法では、毛管現象は多孔性の表面を湿ったから給餌するとき昆虫で採用されている重要な仕組みである場合があり明らかにします。使用して摂食行動 (例えば.、12,17をプロービング) だけでなく明らかになるまでこの繰出し機構、プローブ表面の口器を持ついくつかの個人がフィード、特に定めるできたフィルター ペーパーと毛穴サイズ直径口器導管の直径よりも小さい。さらに、充填流体だったかどうかを決定する作物の検査も不十分であると、液体の量で摂取、これらの実験が小さすぎて視覚的評価、すなわち、いくつかの昆虫の作物が登場しぼん、ナノ粒子は流体が摂取されたことを示すに存在していた。

    小さな虫を処理する能力は、虫ピンで、口器を操作し、解剖は、いくつかの重要な手順と記述の方法論の限界を表す注意してください実行します。たとえば、解離が不能昆虫研究 (ナノ粒子溶液を含む可能性) 作物の内容時計ガラスの PBS 溶液で混合したので、作物の切断で起因したインスタンスがあったナノ粒子の摂取を確認することは困難となっています。さらに、昆虫の表皮の自己蛍光が唯一の手段としてのナノ粒子を可視化する蛍光顕微鏡を使用して妨げることができます。しかし、位相コントラストによる共焦点イメージングはこの問題を排除、視覚的評価 (図 2)、また磁性ナノ粒子を用いた蛍光ナノ粒子だけではなく最適な理由を強調する別の手段を提供します。このプロトコルは、水分を摂取する昆虫の能力を評価する手段を提供します、制限の 1 つは彼らが摂取されています。 中にナノ粒子を視覚化する手段が用意されています。したがって、取り込みプロセス中に流体力学を勉強しての可能性を排除します。

    ここで説明する手法は、液体の少量を摂取する昆虫の能力を評価するためのメソッドを提供します。液餌昆虫の巨大な多様性を与えられて、このプロトコル可能性がありますで使用される昆虫の他の研究で、口器で導管をマイクロ ・ ナノします。今後の研究が同様の手法を使用して、流体旅行消化管を通してなどいくつかの吸血昆虫に見られる作物をバイパスまたはどのくらい水分を調査した研究が特に残っているパスを決定するさらに、構造、中腸、後腸など限り給餌、解剖、およびイメージングの間の時間が考慮されます。

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    Disclosures

    著者が明らかに何もありません。

    Acknowledgments

    この作品は国立科学財団 (NSF) によってサポートされていた許可なし。IOS 1354956。博士アンドリュー d. ウォーレン (鱗翅目、生物多様性、フロリダ州フロリダ大学自然史博物館・ マクガイア センター) 蝶の画像を使用する許可を感謝します。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    20% sucrose solution Domino Sugar Sugar needed to produce the sucrose solution with dH2O
    Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P5493 10X concentration diluted to 1X in dH2O for insect dissections
    Single depression concave slide AmScope BS-C6 Slide is necessary for feeding stage setup
    Filter paper EMD Millipore NY6004700 (60 µm) Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
    Filter paper EMD Millipore NY4104700 (41 µm) Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
    Filter paper EMD Millipore NY3004700 (30 µm) Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
    Filter paper EMD Millipore NY2004700 (20 µm) Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
    Filter paper EMD Millipore NY1104700 (11 µm) Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
    Filter paper EMD Millipore TCTP04700 (10 µm) Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
    Filter paper EMD Millipore TETP04700 (8 µm) Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
    Filter paper EMD Millipore TMTP04700 (5 µm) Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
    Filter paper EMD Millipore RTTP04700 (1 µm) Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding
    Iris microdissecting scissors Carolina Biological Supply Company 623555 Scissors used for dissections
    Insect pins (#1) Bioquip Products 1208B1 Pins used during dissections and feeding trials
    Extra-fine point dissecting forceps Carolina Biological Supply Company 624684 Dissecting equipment
    Leica M205 C Stereoscope Leica Microsystems M205 C Stereoscope used for dissections
    Inverted confocal microscope Olympus IX81 Fluorescent microscope used to detect magnetic nanoparticles
    Fisherbrand PTFE Disposable Stir Bar Fisherscientific S68067 Magnet used to detect nanoparticles
    Kimtech Science Kimwipes Kimberly-Clark Professional 34155 Tissues used to secure insects during feeding trials
    House fly (Musca domestica) pupae Mantisplace.com insects for experiments
    Blue bottle fly (Calliphora vomitoria) pupae Mantisplace.com insects for experiments
    Cabbage butterfly (Pieris rapae) larvae Carolina Biological Supply Company 144102 insects for experiments
    Finnpipette F1  ThermoFisher Scientific 4641080N micropipette for dispensing liquids
    Finntip 250 pipette tips ThermoFisher Scientific 9400250 micropipette tips
    Microscope Glass cover slides (=coverslips) (24 x 24 mm) AmScope CS-S24-100 coverslips for viewing the insect's crop on confocal microscope

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    References

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    Lehnert, M. S., Reiter, K. E., Bennett, A., Gerard, P. D., Wei, Q. H., Byler, M., Yan, H., Lee, W. K. The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects. J. Vis. Exp. (130), e56619, doi:10.3791/56619 (2017).More

    Lehnert, M. S., Reiter, K. E., Bennett, A., Gerard, P. D., Wei, Q. H., Byler, M., Yan, H., Lee, W. K. The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects. J. Vis. Exp. (130), e56619, doi:10.3791/56619 (2017).

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