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Biology

In Vitro Dosage de SUMOylation pour étudier l’activité de Ligase E3 SUMO

doi: 10.3791/56629 Published: January 29, 2018

Summary

Contrairement à l’ubiquitine ligases, quelques ligase E3 SUMO ont été identifiés. Ce modifié in vitro SUMOylation protocole est capable d’identifier de nouveaux SUMO E3 ligases par un essai de reconstitution in vitro .

Abstract

Modification de petite ubiquitin-comme modificateur (SUMO) est une importante modification poteau-de translation (PTM) qui intervient dans la transduction du signal principalement par le biais d’interactions protéine-protéine de modulation. Semblable à la modification de l’ubiquitine, SUMOylation est réalisée par une cascade enzymatique séquentielle dont E1-activation enzymatique (SAE1/SAE2), enzyme de conjugaison E2 (Ubc9) et E3-ligase (c.-à-d., famille PIAS, RanBP2 et Pc2). Cependant, différent de l’ubiquitination, une ligase E3 n’est pas essentiel pour la réaction, mais ne fournissent la précision et l’efficacité pour la conjugaison de SUMO. Protéines modifiées par SUMOylation peuvent être identifiés par l’essai in vivo avec par immunoprécipitation avec des anticorps spécifiques substrat et immunoblotting avec des anticorps spécifiques à SUMO. Toutefois, la démonstration de l’activité protéine SUMO E3 ligase exige en vitro reconstitution de SUMOylation dosages utilisant des enzymes purifiées, substrat et protéines SUMO. Étant donné que dans les réactions in vitro , habituellement SAE1/SAE2 et Ubc9, seuls sont suffisants pour la conjugaison de SUMO, amélioration de SUMOylation par une ligase E3 putative n’est pas toujours facile à détecter. Nous décrivons ici une mis à jour le in vitro SUMOylation protocole qui identifie toujours modification de SUMO à l’aide d’un système in vitro reconstitué. Un protocole étape par étape pour purifier catalytiquement active K-bZIP, une ligase E3 SUMO-2/3 virale, est également présenté. Les activités de SUMOylation de la K-bZIP purifiée figurent sur p53, un objectif bien connu de SUMO. Ce protocole peut être utilisé non seulement pour élucider roman SUMO E3 ligases, mais aussi pour avoir révélé leur spécificité paralogue SUMO.

Introduction

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Modification de SUMO a été initialement identifiée comme une modification post-traductionnelle réversible (PTM) qui régule la stabilité protéique1. En plus de la conjugaison directe, SUMO peut être attaché à une protéine par l’intermédiaire des interactions non covalentes par SUMO interaction motifs (SIMs)2. Similaire à la liaison de tyrosyl-phosphorylation par les molécules d’héberger l’homologie Src 2 (SH2) ou la liaison de la phosphotyrosine (PTB) domaines3,4, modification de SUMO fournit une plateforme d’interaction additionnelle pour sélective recrutement de SIM contenant effecteur protéines5,6. En plus de la réglementation de la transduction du signal, SUMOylation de facteurs de transcriptionnelles et de molécules de remodelage de la chromatine servent à moduler l’expression de gène7,8. Études de schémas de SUMOylation pangénomique ont révélé que modification de SUMO est associée de positif9,10 ou négative10,11,12 transcription Règlement, en partie en raison de la spécificité de paralogue de SUMOylation.

Il existe trois principales isoformes SUMO pour protéine conjugaison présent dans les cellules de mammifères ; Il s’agit de SUMO-1 et le très homologues SUMO-2 et le SUMO-3 (dénommé SUMO-2/3)13. SUMO est généralement conjugué au résidu lysine (K) dans le motif de ψKxD/E consensus dans la protéine cible. La carte SIM dans le SUMO E3 ligases est responsable de la spécificité de paralogue14. Contrairement aux voies de l’ubiquitination contenant des centaines de E3 ligases, ont été signalés quelques SUMO E3 ligases identifiés15. Ligase E3 SUMO est définies par les propriétés, y compris leur capacité à (i) lier Ubc9, (ii) se lient portion SUMO via un domaine SIM et (iii) améliorer le transfert de SUMO de Ubc9 sur substrat. Ligase E3 n’est pas absolument requis pour SUMO conjugaison16, mais fournit le substrat et la spécificité de SUMO-paralogue. Depuis habituellement seulement une petite fraction de la protéine substrat total est modifié SUMO, détection de protéines SUMOylated en vivo est toujours un défi. Par conséquent, les dosages exacts et reproductibles sont nécessaires afin d’élucider la fonction précise de modification du SUMO.

L' in vitro SUMOylation test, qui évalue la capacité de Ubc9 purifié de catalyser la SUMOylation de substrats protéiques, est un dosage reconnu pour l’étude de SUMO modification17. Toutefois, l’activité ligase E3 SUMO dans la plupart des cas ne peuvent pas être détectée ou ne peut être détectée avec muté ligase SUMO avec forte activité de ligase E3 SUMO et de spécificité de substrat faible par le protocole standard en raison de la présence d’une quantité abondante de Ubc918 . La réussite de ce test dépend en grande partie le titrage prudent de Ubc9 purifié. L’essai in vitro SUMOylation avec décrite ici est modifié par rapport à une norme SUMOylation protocole (voir Table des matières). L’observation des modification de SUMO mondiale accrue au cours de la réactivation de l’herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi (KSHV) nous a amenés à identifier la ligase E3 SUMO virale qui peut-être être responsable de la régulation de SUMOylation. Après une projection à petite échelle des protéines interagissants de viral SUMO E3 ligase K-bZIP, p53 a été identifié comme un nouveau substrat. Dans ce protocole, nous montrent en détail dans les étapes impliquées dans l’expression et purification de type sauvage K-bZIP, une ligase E3 SUMO virale avec spécificité SUMO-2/3 des cellules d’insecte. La capacité de la K-bZIP purifiée afin d’améliorer la SUMOylation de p53, un substrat bien connu de SUMO, est évaluée en présence de quantités réduites d’enzymes E1 et E2. À l’aide de ce test de SUMOylation modifié, chercheurs peuvent sûrement définissent les capacités de ligase E3 SUMO SUMOylate roman ou substrats connus, qui est une première étape dans l’étude des protéines SUMOylation. En outre, cette méthode permet d’identifier les nouveaux SUMO E3 ligases avec activité de ligase faible mais la spécificité de substrat de haute.

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Protocol

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1. préparation des Baculovirus Expression constructions

  1. Purifier le SUMO E3 ligase K-bZIP en clonant l’ADNc de K-bZIP19 dans un vecteur de baculovirus expression double (voir Table des matières) avec une balise épitope N-terminale. Nous avons eu des succès à l’aide d’une balise de l’octapeptide (indiquée dans le protocole comme vecteur-tag-K-bZIP).
    Remarque : La matrice d’ADN pour le clonage de K-bZIP polymerase chain reaction (PCR) est cDNA reverse transcription de l’ARN isolé de cellules TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 suite de traitement doxycycline20.
    1. Transfert K-bZIP ADNc pleine longueur19 dans le vecteur d’expression double avec CpoI sites de clonage. CPO J’ai digérer le produit PCR et 1 µg du vecteur d’expression double à 37 ° C pendant 3 h21.
    2. Séparer et extraire l’ADN digéré après électrophorèse sur gel d’agarose 0,8 %22. Ligaturer l’insert (K-bZIP) et vector par T4 DNA ligase à 16 ° C, pendant 30 min selon les instructions du fabricant (voir Table des matières).
    3. Ajouter 5 µL de ligature ADN à 50 µL compétentes d' e. coli cellules « A » (voir Table des matières) dans un tube de 1,5 mL. Mettre sur la glace pendant 30 min. Puis, incuber le tube de 1,5 mL dans un bain d’eau de 42 ° C pour 45 s et mettre immédiatement le tube sur la glace pendant 3 min.
    4. Ajouter 600 µL de milieu O.S.C. (0,5 % (p/v) d’extrait de levure, 2 % (p/v) tryptone, 10 mM NaCl, KCl 2,5 mM, 20 mM MgSO4et 4 % (p/v) de glucose) dans le tube et incuber à 37 ° C pendant 1 h. Puis, centrifuger le tube à température ambiante pendant 3 min à 600 g.
    5. Retirer le surnageant, resuspendre le culot avec 60 µL de milieu Luria-Bertani (LB, 1 % (p/v) tryptone, 0,5 % (p/v) extrait de levure et 85 mM NaCl) et bien le répartir sur les boîtes de gélose LB contenant 100 ampicilline µg/mL. Incuber la gélose à 37 ° C pendant 16 h23,24.
    6. Sélectionnez 1 colonie d’inoculer dans le milieu LB de 5 mL contenant 100 µg/mL ampicilline et à la culture à 37 ° C pendant 16 h avec 250 tr/min secouant. Ensuite, extrayez le plasmide, vecteur-tag-K-bZIP, par un kit d’extraction de plasmide selon les instructions du fabricant (voir Table des matières).
  2. Générer le bacmid recombinant contenant la balise-K-bZIP par transformation de la vector-tag-K-bZIP en compétent e. coli cellules « B » (voir Table des matières).
    1. Mélanger 0,2 µg vector-tag-K-bZIP plasmide et 100 µL compétente E. cellules de coli « B » dans un tube de 1,5 mL et le mettre sur glace pendant 30 min. Incuber le tube dans le bain-marie à 42 ° C pendant 45 s et mettre immédiatement le tube sur la glace pendant 3 min.
    2. Ajouter 900 µL de milieu O.S.C. dans le tube et incuber à 37 ° C pendant 4 h avec rotation à 50 tr/min. Ensuite, prenez 10 µL de milieu, ajouter une supplémentaire 50 µL de S.O.C moyen pour diffuser sur plaques de gélose LB contenant 50 kanamycine µg/mL, 7 gentamicine µg/mL, 10 µg/mL, substrat de galactosidase 100 µg/mL et à 40 µg/mL isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG ) et incuber les boîtes pendant 48 h à 37 ° C.
    3. Ensemencer une colonie blanche dans le milieu LB de 5 mL contenant 50 µg/mL kanamycine, gentamicine 7 de µg/mL et 10 tétracycline µg/mL. Incuber à 37 ° C avec 250 tr/min, secouer pendant 16 h.
    4. Isoler la bacmid recombinant DNA contenant la balise-K-bZIP, quantifier et remettre en suspension à une concentration de 1 µg/µL25.
  3. Générer des baculovirus recombinants exprimant tag-K-bZIP par transfection 1 µg de bacmid recombinant DNA contenant la balise-K-bZIP en cellules Sf9 dans un puits d’une plaque de 6 puits.
    1. Graine 2 x 106 Sf9 cellules (voir Table des matières) dans un milieu de 2 mL Grace insecte fourni avec 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % de gentamicine dans chaque puits d’une plaque 6 puits, puis incuber à 27 ° C pendant 1 h.
    2. Maintenir une culture en phase journal des cellules Sf9 en milieu d’insecte de Grace fourni avec 10 % FBS, gentamicine 1 % et 1 % de détergent C (voir Table des matières) à 27 ° C en suspension orbitale à 140 tr/mn. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et le bleu trypan Coloration ; viabilité cellulaire devrait dépasser 95 %. Maintenir les cellules en utilisant un ratio de sous-culture de 1:3 tous les 2-3 jours (densité minimale ~0.5 x 106 cellules/mL).
    3. Ajouter 2 µL bacmid ADN (1 µg/µL) et 98 µL réduit médias de sérum (voir Table des matières) dans un tube de 2 mL. Puis, ajoutez 4 µL de réactif de transfection (voir Table des matières) pour le tube et bien mélanger. Incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
    4. Ajouter ce mélange de transfection (104 µL) dans chaque puits et incuber à 27 ° C pendant 12 à 16 h.
    5. Retirez les supports épuisés avec aspiration douce et remplacez par 2 mL d’insecte moyen frais Grace fourni avec 10 % de SVF et 1 % de gentamicine. Les cellules Sf9 adhèrent librement à la surface de la plaque et ne sera pas dérangés avec aspirant doucement.
  4. Recueillir les baculovirus recombinant après transfection et amplifient les baculovirus pour obtenir des stocks de haut-titre (P1) pour d’autres expériences.
    1. 72 h après avoir changé de support, gratter le Sf9 cellules à l’aide d’un poussoir de cellules stériles, recueillir le surnageant de chaque puit individuel dans un tube de 1,5 mL et vortexer pendant 10 s.
    2. Centrifuger à 4 ° C pendant 3 min à 150 x g. frais viré surnageant comme P0 baculovirus et partie aliquote dans des tubes de 1,5 mL (baculovirus 1 mL dans chaque tube). Conserver à-80 ° C.
    3. Cellules7 Sf9 graine 1 x 10 dans le milieu d’insecte de 10 mL Grace fourni avec 10 % de SVF et 1 % de gentamicine dans une boîte de Pétri de 10 cm et incuber à 27 ° C pendant 1 h.
    4. Pour l’amplification des baculovirus recombinant exprimant sa balise-K-bZIP, ajouter 0,5 mL de baculovirus P0 aux cellules Sf9 ensemencés et incuber à 27 ° C pendant 48 h.
    5. Recueillir le surnageant comme P1 baculovirus dans un tube de 15 mL et conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois.

2. purification du K-bZIP

  1. Maintenir une culture en phase journal des cellules Sf9 en milieu d’insecte de Grace fourni avec 10 % FBS, gentamicine 1 % et 1 % de détergent C à 27 ° C en suspension orbitale à 140 tr/mn comme indiqué au point 1.3.2.
  2. Le jour de la transduction, ajouter 1 mL du surnageant contenant des baculovirus (P1) dans 250 mL de cellules Sf9 avec une densité de 2 x 106 cellules/mL.
  3. Incuber les cellules Sf9 pendant 72 h à 27 ° C dans un agitateur orbital avec 140 t/mn secouer, puis recueillir par centrifugation à 2 740 x g pendant 15 min à 4 ° C.
  4. Éliminer le surnageant et lyse granules cellulaires dans 10 mL de tampon de lyse (20 mM HEPES pH 7,9, 0,5 M de NaCl, 1 % de détergent un glycérol 2 % (voir Table des matières), inhibiteur de la protéase cocktail) et tourner à 50 tr/min à l’aide d’un mélangeur de suspension à 4 ° C pendant 30 min.
  5. Cellule de centrifugeuse lysat à 15 000 x g pendant 15 min recueillir le liquide surnageant.
  6. Pour purifier le tag-K-bZIP, incuber les lysats cellulaires (10 mL) avec 50 µL d’anticorps marqués des billes magnétiques dans des tubes en polypropylène 14 mL et faire tourner à 50 tr/min pendant 3 h à 4 ° C à l’aide d’un mélangeur de suspension. Après leur capture de protéine, pellet les perles en 800 x centrifugation g pendant 30 s à 4 ° C. Enlever la plupart du surnageant et remettre en suspension les perles dans le volume résiduel d’environ 1 mL transférer dans un tube de 1,5 mL pour le lavage.
  7. Lavez la protéine capturée en plaçant le tube contenant les perles sur un support magnétique et retirer le surnageant après que les billes magnétiques ont pleinement adhéré à la paroi du tube.
  8. Laver les billes avec tampon de lyse quatre fois.
    1. Ajouter le tampon de lyse 1 mL dans des tubes de 1,5 mL, puis retournez les tubes 10 fois. Placer le tube de 1,5 mL sur un support magnétique et éliminer le surnageant comme indiqué au point 2.7.
    2. Répétez l’étape précédente, un autre 3 fois.
  9. Laver une fois les perles avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS).
    1. Ajouter 1 mL de PBS (137 mM NaCl, KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4 2,7 mM) dans des tubes de 1,5 mL, puis retournez les tubes 10 fois.
    2. Mettre le tuyau de 1,5 mL sur un support magnétique, puis enlever le surnageant.
  10. Éluer tag-K-bZIP protéine de billes magnétiques anticorps marqués en ajoutant 100 µL de l’octapeptide 150 µg/mL dilué dans du PBS dans un tube de 1,5 mL. Tourner le tube pendant 10 min à 50 tr/min par mixer de suspension à la température ambiante. Ensuite, replacez le tube sur le support magnétique et recueillir le surnageant contenant K-bZIP dans un tube propre 1,5 mL.
  11. Analyse 1-5 µL purifiée tag-K-bZIP protéine par SDS-PAGE, suivie de bleu de Coomassie26. Chargez 2 µg, 1 µg et 0,5 µg échantillons d’albumine sérique bovine (BSA) sur le même gel et utilisent pour quantifier avec un programme de traitement d’image, comme ImageJ. Estimation de la concentration de K-bZIP par comparaison aux normes BSA.
  12. Le K-bZIP purifiée est maintenant prêt à être utilisé dans chaque essai de SUMOylation. Diluer le K-bZIP dans du PBS à une concentration finale de 100 ng/µL et magasin en petites parties aliquotes à-80 ° C.

3. SUMOylation Assay

  1. Ajouter 3 µL de 100 ng/µL de tag-K-bZIP purifiée dans le mélange maître de chaque in vitro SUMOylation réaction. Composants en mélange maître contiennent 1 µL de tampon de protéines, 1 x tampon de SUMOylation, protéine de p53 0,5 µL (0,5 mg/mL), 25 nM de E1 activation enzymatique (conc. stock : 1 µM), 50 nM de E2 conjugaison (conc. stock : 10 µM) et 250 nM chacun des peptides SUMO (SUMO-1 , SUMO-2 ou SUMO-3 ; conc. stock : 5 µM) pour un volume final de 17 µL.
  2. Mélanger doucement et incuber la réaction à 30 ° C pendant 3 h. arrêter la réaction en ajoutant 20 µL de tampon de charge SDS-PAGE 2 (100 millimètres Tris-HCL pH 6,8, dodécylsulfate de sodium 4 %, 0,2 % (p/v) bleu de bromophénol, 20 % (v/v) de glycérol et 200 mM β-mercaptoéthanol) et dénaturer les échantillons à 95 ° C pendant 5 min.
  3. Séparer les échantillons SDS-page, de transférer les protéines séparées sur une membrane en PVDF en utilisant un dispositif de transfert électrophorétique demi-sec et analyse par Western blot à l’aide d’anticorps anti-p53.
    1. Mettre en place l’appareil de gel comme à l’étape 2.11 et charger 20 µL de l’échantillon dans les puits du gel.
    2. Exécutez le gel de 10 % dans une constante courante à 80 V pour environ 120 min (jusqu'à ce que la bande de colorant atteigne le bas du gel). À l’issue de l’électrophorèse, couper l’alimentation.
    3. Débranchez l’appareil gel et gel de cassettes pour sortir le gel et flotter le gel dans le tampon de transfert semi-sec (48 mM Tris-HCl, glycine de 39 mM, méthanol 20 %) pendant 5 min.
    4. Prenez un autre récipient et laisser tremper la membrane PVDF dans le méthanol pendant 1 min. Ensuite, sortez PVDF méthanol et mis en mémoire tampon de transfert semi-sec. Agiter délicatement la membrane pendant 5 min.
    5. Retirez le couvercle de sécurité de l’appareil d’électrophorèse demi-sec.
    6. Pré mouillage du filtre en papier et préparez un sandwich de gel sur l’anode de platine de fond comme suit : papier filtre, PVDF membrane, gel et papier filtre.
    7. Cathode sûr cover plaque et de la sécurité, puis exécutez blot à 15 V un courant constant de 90 min. tour coupe l’alimentation électrique, débrancher les appareils semi sèche et retirer la membrane PVDF.
    8. Membrane de PVDF bloc avec un tampon de blocage (lait écrémé 5 % dans un tampon TBST (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0,1 % de détergent B (voir Table des matières), pH 7,6)) à température ambiante pendant 1 h avec 30 tr/min, secouant par agitateur orbital.
    9. Hybrider les membranes PVDF avec anticorps anti-p53 dilué (1:1, 000) dans un tampon bloquant pour 12-16 h à 4 ° C avec 30 t/mn agitation à l’aide d’un mélangeur de suspension.
    10. Retirez la membrane en PVDF dans un récipient et mettre dans un mélange TBST. Rincer les membranes PVDF avec un mélange TBST deux fois plus.
    11. Tremper la membrane PVDF dans TBST pendant 30 min à 45 tr/min, secouant par agitateur orbital.
    12. Hybrider les membranes PVDF avec anticorps de anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) diluée (1:4, 000) dans un tampon bloquant pendant 1 h à température ambiante avec 30 t/mn, secouant à l’aide d’un mélangeur de suspension.
    13. Laver la membrane en PVDF avec un mélange TBST 3 fois comme décrit à l’étape 3.4.10.
    14. Faire tremper la membrane PVDF dans TBST pendant 30 min avec 45 t/mn agitation à l’aide d’un mélangeur de suspension. Supprimez un mélange TBST et PBS pour préserver la membrane en PVDF à 4 ° C pendant 12 h.
    15. Mélanger le réactif substrat chimioluminescent améliorée (substrat de l’ECL) 1 et 2 (1:1) (voir la Table des matières). Retirer la membrane PVDF le PBS, éponger brièvement avec un essuie-tout ou un essuie-glace arrière légers pour absorber l’excès d’humidité et immédiatement ajouter 400 µL de réactif de l’ECL à la surface de chaque membrane pour 3-5 min. enlever excès ECL réactif en tamponnant brièvement, mais ne permettent pas de la m embrane pour sécher complètement.
    16. Exposer la tache à l’aide d’un système d’imagerie luminescence ou autoradiographie film27.

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Representative Results

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Selon les informations fournies par le fabricant, la quantité standard d’enzyme E1 et E2 dans le dosage de la SUMOylation est de 50 nM et 500 nM, respectivement. La quantité minimale d’E2 conjugaison Ubc9 qui est capable de SUMOylate p53 a été tout d’abord déterminée par un essai in vitro SUMOylation avec. Aussi bas que le cinquième de la quantité de Ubc9 utilisé dans le standard en vitro protocole d’analyse de SUMOylation a pu efficacement SUMOylate p53 (Figure 1A). Par conséquent, la moitié de la quantité d’enzyme E1 en combinaison avec un dixième de la quantité de Ubc9 utilisés dans le protocole standard a été utilisé pour un autre essai SUMOylation in vitro avec. Une réduction significative de l’efficacité de la SUMOylation a été observée par rapport au protocole standard (Figure 1B).

Ainsi, la capacité de SUMO E3 ligase K-bZIP pour améliorer p53 que sumoylation a été déterminée à l’aide de ces modifié in vitro les conditions de la SUMOylation. Taggé K-bZIP purifiée à partir de cellules Sf9 (Figure 2A) a été employé dans une réaction de SUMOylation contenant des quantités plus faibles d’enzymes E1 et E2 Ubc9. Dans ces conditions modifiées, K-bZIP pourrait efficacement catalysent la SUMOylation de p53 (Figure 2B). Immunoblotting avec anticorps anti-p53 a confirmé les montants totaux similaires de p53 dans chaque réaction, et également détecté SUMO modifiées p53.

Figure 1
Figure 1 : Détermination de la quantité minimale d’enzymes SUMO utilisées dans l’essai in vitro SUMOylation avec. (A) p53 de que sumoylation a été évaluée dans un essai de SUMOylation in vitro qui comprenait un demi et un cinquième la quantité d’enzyme Ubc9 utilisé dans le protocole standard. Après 3 heures de in vitro SUMOylation réaction, SUMOylated p53 enzymes ont été examinés par Western blot avec anticorps anti-p53. (B) In vitro SUMOylation de p53 a été également analysée en utilisant la moitié de l’enzyme E1 en combinaison avec un dixième de la quantité de Ubc9 utilisés dans le protocole standard. Un Western blot a été réalisé comme décrite comme dans (A). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Renforcement de la SUMOylation de p53 par SUMO E3 ligase K-bZIP. (A) purifiée exprimés par les baculovirus K-bZIP protéine, analysé par SDS-PAGE, suivi de coloration bleu de Coomassie. 1 µg BSA et 10 µL purifiée K-bZIP étaient chargement pour comparatif de la quantité de protéines. (B) K-bZIP amélioré p53 que sumoylation a été évaluée en utilisant une réaction de SUMOylation in vitro avec la moitié du montant de l’enzyme E1 et un dixième de la quantité de Ubc9 recommander dans le protocole standard. SUMOylated p53 ont été étudiés par Western blot, tel que décrit dans la Figure 1A. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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L' in vitro SUMOylation protocole décrit ici régulièrement sert à établir le statut de SUMOylation de substrats de Ubc9 identifiés. La limitation majeure en utilisant le protocole standard utilisé pour étudier la fonction de SUMOylation de ligase E3 SUMO est l’abondance de SUMO E1 activation et enzymes de conjugaison E2 Ubc9 qui maximisent la conjugaison de SUMO dans des systèmes in vitro . Compte tenu de ce défi, nous croyons que par titrage de la quantité d’enzymes SUMO E1 et E2 au niveau qu’on peut détecter à peine que leur activité dans la SUMOylation est le moyen disponible uniquement à déterminer l’activité catalytique de SUMO E3 ligase utilisant cette in vitro Système de SUMOylation. Suite à cette hypothèse, nous avons réussi élucidé l’activité de ligase E3 de K-bZIP et identifia comme une ligase E3 SUMO roman avec spécificité envers SUMO-2/3.

L’étape critique au sein du protocole est l’incorporation des quantités plus faibles d’E1 et E2. En utilisant ces montants inférieurs, comme illustré à la Figure 2, roman SUMO E3 ligases avec activité de ligase faible peut être en mesure d’identifier avec la préservation de leur spécificité de substrat et SUMO paralogues. Une limitation majeure de la technique est la condition pour un anticorps de qualité reconnaissant le substrat SUMO, étant donné que seulement une infime partie du substrat peut être modifiée de SUMO.

Bien que beaucoup de protéines montrent la possibilité d’augmenter la SUMOylation après surexpression en vivo, définissant une ligase E3 SUMO doit être démontrée par un système SUMOylation reconstitués in vitro à l’aide d’enzymes purifiées, E1, E2 et E3. Par opposition à des centaines et peut-être des milliers d’ubiquitin E3 ligases identifiés, jusqu'à présent, seulement quelques SUMO E3 ligases ont été trouvés. Cela peut être dû en partie à l’utilisation de l’analyse de SUMOylation standard traditionnel in vitro qui maximise l’efficacité de la conjugaison de SUMO et par conséquent empêche la fonction de SUMOylation de potentiels SUMO E3 ligases. Le présent protocole décrit une analyse simple et cohérente pour sonder la SUMOylation renforcée par une ligase E3 SUMO. La méthode décrite est essentielle pour l’identification et la caractérisation de nouveaux SUMO E3 ligases.

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Disclosures

Les auteurs ne divulguer aucun conflit d’intérêt potentiel.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de la ministère des sciences et de la technologie (MOST, 105-2320-B-010-007-MY3 au PCC), de l’Institut National de recherche en santé (INRH-EX105-10215BC au PCC), du ministère de la Science et technologie (plus 105-2314-B-400-019 à HJK) et de la National Health Research Institute (INRH MG-105-SP-10, INRH MG-106-SP-10 au HJK). Ce travail a été également soutenu en partie avec l’Université nationale Yang-Ming sur publication du manuscrit de PCC. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou réparation du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pFastBac Invitrogen 10359-016 dual expression baculovirus vector
pCR2.1-TOPO vector Invitrogen PCR product vector
competent cell  E. coli DH5α Yeastern Biotech FYE678-80VL competent E. coli cells A
E. coli DH10Bac Invitrogen 10359-016 competent E. coli cells B
FugeneHD Roche 04709705001 transfection reagent
Opti-MEM Gibco 31985062 reduced serum media
T4 Ligase NEW England BioLabs M0202S
CpoI (RsrII) Thermo Scientific ER0741
Bluo-gal Thermo Scientific B1690 galactosidase substrate
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
Grace’s Insect Medium Gibco 11605094
Fetal Bovine Serum Gibco 10082147
Gentamicin Thermo Fisher 15750060
Ampicillin Sigma-Aldrich A9393-25G
Kanamycin Sigma-Aldrich K0254-20ML
gentamicin Gibco 15710-064
tetracyclin Sigma-Aldrich 87128-25G
LB Broth Merk 1.10285.0500
HEPES Sigma-Aldrich H4034-100G
NaCl Sigma-Aldrich S9888-5KG
KCl Merk 1.04936.1000
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S5136-500G
KH2PO4 J.T.Baker 3246-01
sodium dodecyl sulfate Merk 1.13760.1000
β-mercaptoethanol Bio-Rad 161-0710
TRIS (Base) J.T.Baker 4109-06
Non-fat milk Fonterra
glycerol J.T.Baker 2136-01
Triton X-100 Amresco 0694-1L detergent A
Tween 20 Amresco 0777-500ML detergent B
Poloxamer 188 solution Sigma-Aldrich P5556-100ML detergent C
Protease Inhibitor Cocktail Tablet Roche 04 693 132 001
3x Flag peptide Sigma F4799
anti-FLAG m2 Magnetic beads Sigma-Aldrich M8823 antibody-tagged magnetic beads
SUMOlink SUMO-1 Kit Active Motif 40120 standard SUMOylation protocol 
SUMOlink SUMO-2/3 Kit Active Motif 40220 standard SUMOylation protocol 
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
QIAGEN Plasmid Mini Kit QIAGEN 12123 plasmid extraction kit
Polypropylene tubes Falcon 352059
Petri Dish Falcon 351029
Cell lifter Corning CNG3008
Loading tip Sorenson BioScience 28480
PVDF PerkinElmer NEF1002
Blotting filter paper Bio-Rad 1703932
Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) Bio-Rad 1658001 EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell Bio-Rad 1703940
Pierce ECL Western Blotting Thermo 32106 ECL reagent
suspension mixer Digisystem laboratory instruments  Inc. SM-3000
orbital shaker Kansin instruments Co. OS701
ImageQuant LAS 4000
biomolecular imager
GE Healthcare 28955810
Sf9 Thermo Scientific B82501
anti-p53 antibody Cell Signaling #9282
anti-rabbit antibody GE Healthcare NA934-1ML

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References

  1. Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277, (11), 8999-9009 (2002).
  2. Lin, D. Y., et al. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors. Mol Cell. 24, (3), 341-354 (2006).
  3. Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells. J Mol Endocrinol. 56, (1), 21-31 (2016).
  4. Huang, W. Q., et al. Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis. Curr Cancer Drug Targets. 14, (6), 567-588 (2014).
  5. Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin. Trends Biochem Sci. 33, (5), 201-208 (2008).
  6. Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26, (18), 4102-4112 (2007).
  7. Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex. Mol Cell. 34, (2), 145-154 (2009).
  8. Lyst, M. J., Stancheva, I. A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation. Biochem Soc Trans. 35, Pt 6 1389-1392 (2007).
  9. Liu, H. W., et al. Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes. Nucleic Acids Res. 40, (20), 10172-10186 (2012).
  10. Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast. Genes Dev. 24, (12), 1242-1252 (2010).
  11. Chang, P. C., et al. The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi's sarcoma associated herpesvirus reactivation. BMC Genomics. 14, 824 (2013).
  12. Neyret-Kahn, H., et al. Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation. Genome Res. 23, (10), 1563-1579 (2013).
  13. Tatham, M. H., et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J Biol Chem. 276, (38), 35368-35374 (2001).
  14. Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson. World J Virol. 2, (2), 79-90 (2013).
  15. Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (12), 861-871 (2010).
  16. Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108, (3), 345-356 (2002).
  17. Knipscheer, P., et al. Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination. Mol Cell. 31, (3), 371-382 (2008).
  18. Vethantham, V., Manley, J. L. In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (1), 5121 (2009).
  19. Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. J Virol. 73, (3), 1909-1917 (1999).
  20. Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation. PLoS Pathog. 11, (7), 1005051 (2015).
  21. Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. RsrII--a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site. Nucleic Acids Res. 12, (17), 6701-6708 (1984).
  22. Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J Virol. 14, (5), 1235-1244 (1974).
  23. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189, (23), 8746-8749 (2007).
  24. Gingold, E. B. Bacterial transformation. Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).
  25. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86, (18), 9708-9720 (2012).
  26. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, (5259), 680-685 (1970).
  27. Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Nat Protoc. 8, (5), 998-1009 (2013).
<em>In Vitro</em> Dosage de SUMOylation pour étudier l’activité de Ligase E3 SUMO
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Yang, W. S., Campbell, M., Kung, H. J., Chang, P. C. In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity. J. Vis. Exp. (131), e56629, doi:10.3791/56629 (2018).More

Yang, W. S., Campbell, M., Kung, H. J., Chang, P. C. In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity. J. Vis. Exp. (131), e56629, doi:10.3791/56629 (2018).

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