En protokol, der er beskrevet for manuel syntese af oligo-peptoids efterfulgt af Sekvensanalyse ved massespektrometri.
Peptoids er sekvens-kontrollerede peptid-efterligne oligomerer bestående af N-alkylerede glycin enheder. Blandt mange potentielle anvendelser, har peptoids været tænkt som en type af Molekylær information opbevaring. Massespektrometri analyse har været betragtet som den foretrukne metode til sekvensering peptoids. Peptoids kan syntetiseres via faste fase kemi ved hjælp af en gentaget to-trins reaktion cyklus. Her vil vi præsentere en metode til at manuelt syntetisere oligo-peptoids og analysere sekvensen af peptoids ved hjælp af tandem massespektrometri (MS/MS) teknikker. Prøve peptoid er en nonamer bestående af skiftevis N-(2-methyloxyethyl) glycine (Nme) og N-(2-phenylethyl) glycine (Npe), samt en N-(2-aminoethyl) glycine (næ) på N-terminus. Formlen sekvens af peptoid er Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, hvor Ac er acetyl-gruppen. Syntesen finder sted i et kommercielt tilgængelige fast-fase reaktion fartøj. Rink akrylamid harpiks bruges som solid støtte til at give peptoid med et AMID gruppe på C-terminus. Den resulterende peptoid produkt er udsat for Sekvensanalyse ved hjælp af en triple-Quadrupol massespektrometer koblet til en electrospray Ionisation kilde. MS/MS måling producerer et spektrum af fragmentioner som følge af dissociation af ladede peptoid. Fragmentioner sorteres baseret på værdier af deres masse til ladning forhold (m/z). M/z-værdier af fragmentioner sammenlignes mod de nominelle masserne af teoretisk forudsagte fragmentioner, ifølge ordningen af peptoid opsplitning. Analysen skaber en fragmentering mønster af de ladede peptoid. Fragmentering mønster er korreleret til monomere sekvens af de neutrale peptoid. I denne henseende læser MS analyse de sekvens oplysninger af peptoids.
Peptoids er en klasse af sekvens-kontrollerede polymerer med rygrad strukturer efterligne struktur af peptider. Peptoids kan syntetiseres fra forskellige aminer, som gør det muligt for peptoids at udstille meget afstemmelige egenskaber1,2. Peptoids har været brugt som Molekylær modeller for biofysiske forskning, betragtes som terapeutiske agenter, og udformet som ligander for proteiner3,4,5,6. Peptoids har udviklet sig til en bred vifte af biologisk aktive forbindelser, såsom anti-tilgroning og antistof-mimetiske materialer, antimikrobielle stoffer og enzym-hæmmere7,8,9. Med et stærkt bestilte og afstemmelige karakter, har peptoids også været tænkt som en type af Molekylær information opbevaring10. Opdagelsen af disse forskellige programmer kræver udvikling af effektive analytiske metoder til at karakterisere sekvensen og strukturen i peptoids. Tandem massespektrometri-baseret teknikker har vist lovende som den foretrukne metode til at analysere egenskaberne sekvens for sekvens-kontrollerede polymerer, herunder peptoids11,12,13, 14,15. Men systematiske undersøgelser korrelerede peptoid ion opsplitning mønstre som følge af masse massespektrometri undersøgelser og de strukturelle oplysninger af peptoids er meget begrænset.
Peptoids kan syntetiseres let, ved hjælp af en fast fase metode. Den veludviklede metode indebærer en gentagelse af en to-trins monomer tilføjelse cyklus16,17. En harpiks-bundet Amin er acetyleret af en haloacetic syre (typisk bromacetat, BMA) i hver cyklus med tilsætning, og dette er efterfulgt af en forskydning reaktion med en primær Amin. Selv om automatiserede syntese protokoller har været rutinemæssigt anvendt i peptoid syntese, kan peptoids syntetiseres manuelt med fremragende udbytter i en standard kemi laboratorium16,18,19, 20.
Vores lab har vedtaget metoden til manuel peptoid syntese og forenklet de apparater, der anvendes i de eksisterende metoder. Vi har tidligere studeret opsplitning mønstre af en serie af peptoids ved hjælp af MS/MS teknikker21,22,23. Vores resultater viser, at peptoids producere karakteristiske opdelinger, når de er udsat for kollision-induceret dissociation (CID)21,23 eller elektron-indfangning dissociation (ECD)22 eksperimenter. I denne artikel vil vise vi hvordan oligo-peptoids kan syntetiseres i en standard kemi laboratorium, hvordan man udfører CID eksperimenter ved hjælp af en triple-Quadrupol massespektrometer og hvordan man kan analysere den spektrale data. Peptoid at være syntetiseret og karakteriseret er en nonamer med N-terminale acetylation og C-terminal amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Strukturen i peptoid er vist i figur 1.
En nonamer peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, er blevet syntetiseret ved hjælp af protokollen præsenteret. Apparatet sammenfatning indebærer en sprøjte-lignende polypropylen fast-fase reaktion fartøj og et rysteapparat. Reaktion fartøjer er kommercielt tilgængelige og lave omkostninger. Omrøreren er en fælles apparater i kemi laboratorier. Med brugen af en sprøjte-lignende reaktion fartøj, kan løsninger trukket ind og skubbet ud af fartøjet ved at manuelt flytte stemplet. Denne teknik give…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Mr. Michael Connolly og Dr. Ronald Zuckermann (The molekylære støberi, Lawrence Berkeley National Laboratory) for teknik opbakning i peptoid syntese. Vi anerkender støtten fra National Science Foundation (CHE-1301505). Alle massespektrometri eksperimenter blev udført på kemi masse massespektrometri facilitet på universitetet i Stillehavet.
ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L | Agilent Technologies Inc. | The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc. | |
Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software | Varian Inc. | The software is a part of the Varian 320L package | |
Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD | Fisher Scientific International Inc. | 14-400-126 | |
Hermle Centrifuge, Model Z 206 A | Hermle Labortechnik GmbH | ||
Solid phase reaction vessel, 10 mL | Torviq | SF-1000 | |
Pressure caps for reaction vessels | Torviq | PC-SF | |
Syringe filters, pore size 0.2 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3B | |
Syringe filters, pore size 0.45 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3A | |
Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL | VWR International, LLC. | 490001-626 | |
Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL | VWR International, LLC. | 490001-620 | |
ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0 | CambridgeSoft Corporation | CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc. | |
Styrofoam cup, 12 Oz | Common Supermarket | ||
Rink amide resin | Chem-Impex International, Inc. | 10619 | |
Piperidine | Chem-Impex International, Inc. | 02351 | Highly toxic |
N, N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex International, Inc. | 00110 | Highly toxic |
Bromoacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 26843 | Highly toxic |
2-Phenylethylamine | VWR International, LLC. | EM8.07334.0250 | |
2-Methyoxyethylamine | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 241067 | |
N-Boc-ethylenediamine | VWR International, LLC. | AAAL19947-06 | |
Acetic anhydride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 252845 | |
N, N-dimethylformamide | VWR International, LLC. | BDH1117-4LG | Further distillation before use |
N, N-diisopropylethylamine | Chem-Impex International, Inc. | 00141 | |
Triisopropylsilane | Chem-Impex International, Inc. | 01966 | |
Trifluoroacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 00289 | Highly toxic |
Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System | Millipore Corporation | ZMQP60001 | For generating HPLC grade water |
HPLC-grade Water | Produced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System | ||
Methanol | Pharmco-Aaper | 339USP/NF | HPLC grade |
Acetonitrile | Fisher Scientific International, Inc. | A998-4 | HPLC grade |
Diethyl ether | VWR International, LLC. | BDH1121-19L | Further distillation before use |
Dichloromethane | VWR International, LLC. | BDH1113-19L | Further distillation before use |
Nitrogen gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | NIT 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
Argon gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | ARG 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |