Summary

Синтез и анализ масс-спектрометрии Oligo-peptoids

Published: February 21, 2018
doi:

Summary

Протокол описан для ручной синтеза oligo-peptoids следуют анализ последовательности по масс-спектрометрии.

Abstract

Peptoids являются контролируемой последовательности пептид подражая олигомеров, состоящей из N-алкилированные глицин единиц. Среди многих потенциальных приложений было подумал peptoids как тип хранения молекулярной информации. Масс-спектрометрия анализ рассматривался метод выбора для последовательности peptoids. Peptoids может быть синтезирован через твердой фазы химии, используя повторяющийся цикл реакции двухэтапный. Здесь мы представляем метод вручную синтезировать oligo-peptoids и анализировать последовательность peptoids, с использованием методов тандемные масс-спектрометрия (МС/МС). Образец peptoid является nonamer, состоящие из чередующихся N-(2-methyloxyethyl) глицин (Nme) и N-(2-phenylethyl) глицин (Npe), а также N-(2-аминоэтил) глицин (НАО) в N-terminus. Последовательность формула peptoid является Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, где Ac ацетильной группы. Синтез происходит в коммерчески доступных твердофазный реакции судна. Каток Амида смола используется в качестве твердой поддержки приносить peptoid с амидной группой в C-terminus. Полученный продукт peptoid подвергается последовательность анализа с помощью тройной квадрупольного масс-спектрометра в сочетании с источником ионизации электроспрей. МС/МС измерение производит спектр фрагмент ионов в результате диссоциации заряженных peptoid. Ионы фрагмент сортируются основаны на значениях коэффициента их масса заряд (m/z). Значения m/z ионов фрагмент сравниваются номинальной массы ионов теоретически предсказанных фрагмент, по схеме peptoid фрагментации. Анализ генерирует шаблон фрагментации взимается peptoid. Структуре фрагментации связан на мономера последовательность нейтральных peptoid. В этой связи МС анализа считывает последовательность информации peptoids.

Introduction

Peptoids — класс контролируемой последовательности полимеров с структур позвоночника, имитирует структуру пептиды. Peptoids могут быть синтезированы из различных аминов, который позволяет peptoids выставить высоко настраиваемых свойств1,2. Peptoids были использованы как молекулярные модели для биофизических исследований, считается терапевтических агентов и разработана как лигандов для белки3,4,5,6. Peptoids были разработаны в различных биологически активных соединений, например противообрастающих и антитела подражательный материалы, противомикробных препаратов и фермента ингибиторы7,8,9. С весьма упорядоченный и перестраиваемые природой peptoids также было подумал как тип молекулярной информации хранения10. Открытие этих различных приложений требует разработки эффективных аналитических методов охарактеризовать последовательность и структура peptoids. Тандем массы на основе спектрометрии методы показали обещание как метод выбора для анализа свойства последовательности контролируемой последовательности полимеров, включая, peptoids11,12,13 14,15. Однако систематические исследования сопоставление моделей фрагментации Ион peptoid, результатом массовых спектрометрии исследования и структурной информации peptoids весьма ограничены.

Peptoids могут быть легко синтезированы методом твердой фазы. Хорошо разработанный метод предполагает итерации двухэтапный мономера дополнением цикла16,17. В каждом цикле сложения смола прыгните Амин ацетилированные haloacetic кислоты (как правило, bromoacetic кислота, BMA), и это сопровождается перемещением реакции с Первичные амины. Хотя протоколы автоматизированного синтеза регулярно применялись для синтеза peptoid, peptoids может быть синтезирован вручную с отличные урожаи в стандартной химии лабораторные16,18,19, 20.

Наша лаборатория приняла метод ручной peptoid синтеза и упростить аппарат используемых в существующих методах. Ранее мы изучили фрагментации моделей серии peptoids с помощью МС/МС методы21,22,23. Наши результаты показывают, что peptoids производят характерные образовавшиеся, когда они подвергаются столкновения индуцированной диссоциации (CID)21,23 или захват электронов диссоциации (ECD)22 экспериментов. В этой статье мы демонстрируем, как oligo-peptoids может быть синтезирован в стандартной химическую лабораторию, как выполнять CID эксперименты с помощью тройной квадрупольного масс-спектрометра и как анализировать спектральные данные. Peptoid быть синтезированы и характеризуется является nonamer с N-терминальный ацетилирования и C-терминала amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Структура peptoid показано на рисунке 1.

Protocol

1. синтез Peptoid Примечание: Синтез начинается с активации смолы, отек смолы и удаление группы защиты. Это сопровождается растущей цепи peptoid на смолы через повторяющиеся мономера Добавление циклов. Первый мономера, в сочетании со смолой является остатков C-терминала. Peptoid удли…

Representative Results

Структура peptoid 9-mer с N-терминальный ацетилирования, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, показано на рисунке 1. Peptoid был синтезирован вручную в фриттированных полипропиленовые реакции судна через подход твердой фазы. Каток Амида смолы (0,047 ммоль, 84 мг с загрузкой 0,56 м?…

Discussion

Nonamer peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, синтезирован с использованием представленные протокола. Синтез аппарат включает шприц как полипропиленовые твердофазный реакции судна и механический shaker. Реакционные сосуды, коммерчески доступных и недорогих. Механический shaker является общим аппара?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить г-н Майкл Коннолли и д-р Рональд Гилад (молекулярных литейного, Лоуренса Беркли национальной лаборатории) для поддержки технику в peptoid синтезе. Мы признаем поддержку от национального научного фонда (ЧЕ-1301505). Все масс-спектрометрии эксперименты были проведены на объекте спектрометрии массы химии в Университете Тихого океана.

Materials

ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L Agilent Technologies Inc. The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc.
Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software Varian Inc. The software is a part of the Varian 320L package
Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD Fisher Scientific International Inc. 14-400-126
Hermle Centrifuge, Model Z 206 A Hermle Labortechnik GmbH
Solid phase reaction vessel, 10 mL Torviq SF-1000
Pressure caps for reaction vessels Torviq PC-SF
Syringe filters, pore size 0.2 μm Fisher Scientific Inc. 03-391-3B
Syringe filters, pore size 0.45 μm Fisher Scientific Inc. 03-391-3A
Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL VWR International, LLC. 490001-626
Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL VWR International, LLC. 490001-620
ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0 CambridgeSoft Corporation CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc.
Styrofoam cup, 12 Oz Common Supermarket
Rink amide resin Chem-Impex International, Inc. 10619
Piperidine Chem-Impex International, Inc. 02351 Highly toxic
N, N’-diisopropylcarbodiimide Chem-Impex International, Inc. 00110 Highly toxic
Bromoacetic acid Chem-Impex International, Inc. 26843 Highly toxic
2-Phenylethylamine VWR International, LLC. EM8.07334.0250
2-Methyoxyethylamine Sigma-Aldrich Co. LLC. 241067
N-Boc-ethylenediamine VWR International, LLC. AAAL19947-06
Acetic anhydride Sigma-Aldrich Co. LLC. 252845
N, N-dimethylformamide VWR International, LLC. BDH1117-4LG Further distillation before use
N, N-diisopropylethylamine Chem-Impex International, Inc. 00141
Triisopropylsilane Chem-Impex International, Inc. 01966
Trifluoroacetic acid Chem-Impex International, Inc. 00289 Highly toxic
Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System Millipore Corporation ZMQP60001 For generating HPLC grade water
HPLC-grade Water Produced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System
Methanol Pharmco-Aaper 339USP/NF HPLC grade
Acetonitrile Fisher Scientific International, Inc. A998-4 HPLC grade
Diethyl ether VWR International, LLC. BDH1121-19L Further distillation before use
Dichloromethane VWR International, LLC. BDH1113-19L Further distillation before use
Nitrogen gas Fresno Oxygen/Barnes Supply NIT 50-C-F Ultra high purity, 99.9995%
Argon gas Fresno Oxygen/Barnes Supply ARG 50-C-F Ultra high purity, 99.9995%

References

  1. Sun, J., Zuckermann, R. N. Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material. ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).
  2. Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function. Org. Biomol. Chem. 7 (8), 1508-1524 (2009).
  3. Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (8), 2794-2799 (2008).
  4. Kruijtzer, J. A., Nijenhuis, W. A., Wanders, N., Gispen, W. H., Liskamp, R. M., Adan, R. A. Peptoid-Peptide Hybrids as Potent Novel Melanocortin Receptor. J. Med. Chem. 48 (13), 4224-4230 (2005).
  5. Liu, B., Alluri, P. G., Yu, P., Kodadek, T. A Potent Transactivation Domain Mimic with Activity in Living Cells. J. Am. Chem. Soc. 127 (23), 8254-8255 (2005).
  6. Patch, J. A., Barron, A. E. Helical Peptoid Mimics of Magainin-2 Amide. J. Am. Chem. Soc. 125 (40), 12092-12093 (2003).
  7. Ham, H. O., Park, S. H., Kurutz, J. W., Szleifer, I. G., Messersmith, P. B. Antifouling Glycocalyx-Mimetic Peptoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (35), 13015-13022 (2013).
  8. Olivier, G. K., Cho, A., Sanii, B., Connolly, M. D., Tran, H., Zuckermann, R. N. Antibody-Mimetic Peptoid Nanosheets for Molecular Recognition. ACS Nano. 7 (10), 9276-9286 (2013).
  9. Olsen, C. A., Ziegler, H. L., Nielsen, H. M., Frimodt-Moeller, N., Jaroszewski, J. W., Franzyk, H. Antimicrobial, Hemolytic, and Cytotoxic Activities of β-Peptoid-Peptide Hybrid Oligomers: Improved Properties Compared to Natural AMPs. ChemBioChem. 11 (10), 1356-1360 (2010).
  10. Lutz, J. -. F., Ouchi, M., Liu, D. R., Sawamoto, M. Sequence-Controlled Polymers. Science. 341 (6146), 628 (2013).
  11. Altuntas, E., Schubert, U. S. “Polymeromics”: Mass spectrometry based strategies in polymer science toward complete sequencing approaches: A review. Anal. Chim. Acta. 808, 56-69 (2014).
  12. Paulick, M. G., Hart, K. M., Brinner, K. M., Tjandra, M., Charych, D. H., Zuckermann, R. N. Cleavable Hydrophilic Linker for One-Bead-One-Compound Sequencing of Oligomer Libraries by Tandem Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 8 (3), 417-426 (2006).
  13. Thakkar, A., Cohen, A. S., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Pei, D. High-Throughput Sequencing of Peptoids and Peptide-Peptoid Hybrids by Partial Edman Degradation and Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 11 (2), 294-302 (2009).
  14. Sarma, B. K., Kodadek, T. Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library. ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).
  15. Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis. Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).
  16. Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).
  17. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).
  18. Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory. J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).
  19. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).
  20. Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J Vis Exp. (117), (2016).
  21. Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition. Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).
  22. Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).
  23. Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).

Play Video

Cite This Article
Ren, J., Mann, Y. S., Zhang, Y., Browne, M. D. Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids. J. Vis. Exp. (132), e56652, doi:10.3791/56652 (2018).

View Video