Summary
Ce protocole détaillé décrit le placement des électrodes stimulation transcrânienne sur l’OS temporal afin d’étudier les effets à court et à long terme de stimulation électrique transcranienne en se déplaçant librement des rats.
Abstract
La stimulation transcrânienne électrique (TES) est une approche relativement simple et puissante pour diffusément influent sur l’activité cérébrale au hasard ou de façon boucle fermée a déclenché l’événement. Bien que de nombreuses études mettent l’accent sur les avantages et les effets secondaires de TES dans les cerveaux sains et pathologiques, il existe encore de nombreuses questions en suspens fondamentale concernant le mécanisme d’action de la stimulation. Par conséquent, il est clairement nécessaire pour une méthode fiable et reproductible pour tester les aigus et les effets chroniques de TES chez les rongeurs. TES est cumulable avec les techniques comportementales et électrophysiologiques d’imagerie réguliers d’enquêter sur les réseaux neuronaux en vivo. L’implantation d’électrodes de stimulation transcrânienne n’impose pas des contraintes supplémentaires sur la conception expérimentale, alors qu’il offre un outil polyvalent et flexible pour manipuler l’activité cérébrale. Ici, nous fournissons un protocole détaillé, étape par étape pour fabriquer et implanter des électrodes de stimulation transcranienne pour influencer l’activité cérébrale de façon limitée dans le temps pendant des mois.
Introduction
La stimulation transcrânienne électrique (TES) est une approche méthodologique précieuse d’influencer l’activité cérébrale de façon limitée dans le temps. Selon la taille et le positionnement des électrodes de stimulation, TES peut affecter les volumes gros cerveau et monter les populations neuronales diffusément1,2,3. La stimulation transcrânienne courant continu est déjà médicalement approuvée pour le traitement du trouble dépressif majeur4,5et de nombreuses études mettant l’accent sur montrant les effets cognitifs de la stimulation transcrânienne dans les humains6 , 7. en outre, promettant des résultats ont été rapportés concernant le potentiel de TES dans le contrôle des crises d’épilepsie8,9.
Malgré les recherches intensives, il existe encore de nombreuses questions en suspens concernant les modalités d’action, effets secondaires et les résultats à long terme de l’application de cette méthode10,11,12. Par conséquent, il est extrêmement important d’avoir un protocole fiable et reproductible pour étudier les effets de TES dans des modèles animaux. Étant donné que de nombreux troubles (par exemple, la dépression, l’épilepsie et la schizophrénie) peuvent seulement être étudiées chez des animaux éveillés, et la nature de ces conditions médicales nécessitent généralement le traitement à long terme, nous fournissons un protocole pour la chronique implantation d’électrodes transcrânienne chez les rats. La méthode présentée ici peut être utilisée pour les études comportementales ou peut être combinée avec l’implantation d’électrodes d’enregistrement(p. ex., fils, silicone sondes, électrodes juxtacellular) ou avec des fenêtres crâniennes chroniques pour des expériences électrophysiologiques et imagerie, respectivement. Selon le protocole expérimental, le timing des stimuli peut être aléatoire ou déclenchés par l’événement aux signaux comportements spécifiques, ou pour les marques électrophysiologiques du cerveau particulier États (convulsions, oscillations thêta)8, 11 , 13.
Il est important de mentionner que contrairement à l’approche humaine utilisé actuellement, qui utilise un mode de réalisation d’électrodes placées sur la peau, nous montrons ici une méthode qui utilise le droit de l’implantation sous-cutanée sur la surface de l’OS temporal, depuis des rats à peine tolérer quoi que ce soit placé sur leur peau qui est facilement accessible à l’aide de leurs pattes.
Conformément aux principes de remplacement, réduction et raffinement, en raison de la chronicité de l’implantation, cette méthode permet de réduire le nombre d’animaux, étant donné que chaque animal peut être recruté dans différentes conditions expérimentales pendant des mois, ce qui permet l’utilisation de moins d’animaux pour tester différentes hypothèses.
Dans la présente étude, nous fournissons un protocole détaillé, étape par étape de l’électrode de stimulation transcranienne fabrication (Figure 1 a-B) et démontrer l’implantation chronique de ces électrodes sur l’OS temporal d’un six-month-old rats Long-Evans mâles.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici sont conformes aux directives des Communautés européennes Conseil (86/609 ECC) et ont été approuvés par le Comité d’éthique pour la recherche animale à l’Albert Szent-Györgyi médicale et pharmaceutique Center de l’Université de Szeged (XIV/218/2016).
1. fabrication des électrodes de Stimulation
- Pour faire une stimulation électrode, coupez six pièces de long de 10 cm de fils de branchement miniature, enlever 2 cm de la gaine sur une extrémité et 1 cm sur l’autre extrémité.
- Torsadez les deux câbles et souder sur le côté Pelé plus court.
- Acquérir une bande de trois emballages de bande de n’importe quel circuit intégré avec boîtier SOT-353.
- Piquer les fils torsadés dans les trois trous du package. Le segment le plus Pelé des fils doit être dans les cavités du package. Positionner les câbles afin que la fin de l’isolement est aligné avec le bord des trous.
- Mettre le ciment dentaire sur les trous pour fixer les fils.
ATTENTION : Le ciment dentaire doit être suffisamment dense pour éviter les fuites dans la cavité du package. - Une fois que le ciment est solidifiée (minimum 10 min), retournez l’emballage et mettez une fine couche de colle dans le trou pour former un joint d’étanchéité vers le ciment poreux. Éviter de coller les fils pelées.
- Torsadez les câbles sur le côté le plus court Pelé et souder (Figure 1 a).
- Prenez le segment le plus Pelé des fils avec le bout des pinces fines, roulez-les autour et les envelopper dans les cavités (Figure 1 b). Couper l’excédent de câble, si nécessaire.
2. fabrication des électrodes enregistrement
- Pour faire un enregistrement vu électrode de triplet (Figure 1-D), couper un morceau long d’un cm de tube d’acier inoxydable à l’aide du rotary à grande vitesse. Enlever l’aileron de l’extrémité du tube avec une aiguille fine, puis assurez-vous que le tube est complètement perméable et exempt de débris.
Remarque : Ne pas utiliser de pinces, car ils déformeront le tube. - Plier une épingle d’entretoise plaquée or Conseil avec une longueur minimale de 3 cm pour former un support J-forme. Couper la jambe plus longue de la forme de « J » et les souder ensemble pour récupérer la forme originale de réaliser une jonction amovible entre la partie de temps linéaire, qui se déroulera sous l’appareil stéréotaxique, et la forme de « U », qui va tenir l’électrode et servir de point d’ancrage . Coller le tube et la jambe courte du titulaire « J ». Coller quelques longues barres supplémentaires de 1 cm, si nécessaire, pour la stabilité.
- Couper 3 morceaux de fils électrodes longues 2,5 cm avec l’acier inoxydable, ciseaux ultrafines. Assurez-vous que c’est une coupe claire et nette, et l’isolation est intacte à la surface circulaire du fil électrode. Veillez également à ce que l’extrémité coupée n’est pas pliée à cause de la force appliquée. Plier 1 ou 2 mm à une extrémité de chacun des fils à des angles différents (par exemple, une droite gauche, un 45 ° et un angle droit) pour les rendre reconnaissable.
- Remplir le tube avec les fils, choisissez un espacement approprié des électrodes pour l’expérience (par exemple, pour cortical potentiel de champ local (LFP) et l’actuelle source densité (CSD) enregistrement, la saillie recommandée des extrémités des fils de la ouverture du tube : 3,7 mm, 4,5 mm et 4,1 mm respectivement). Remarque quel fil correspond à quelle profondeur pour maintenir l’ordre sur un canal approprié.
- Une fois les fils alignement à droite à côté de l’autre et sont parallèles avec le tube, pour fixer les fils de l’électrode, placez une seule goutte de superglue liquide aux deux extrémités du tube avec une aiguille fine. Veillez à ce que la colle s’écoule dans le tube en raison de l’effet de capillarité, mais pas vers les sites d’enregistrement aux extrémités saillantes.
- Préparer une carte d’interface électrode avec un bon microconnector compatible avec le système d’enregistrement à utiliser.
- Introduire les extrémités non enregistrement, tordues des fils dans les trous de la carte d’interface électrode correspondant à la chaîne d’enregistrement désiré. Lorsque tous les fils sont en position, poussez les broches en or dans les trous avec des pincettes.
NOTE : Épingles d’or peuvent être fixés en place à l’aide de ciment dentaire, mais dans la plupart des cas, il est assez stable même sans cette étape de sécurité.
3. l’anesthésie
- Placer l’animal dans une chambre à induction anesthésie scellé et remplissez-le avec 4-5 % d’isoflurane à 2 L/min d’air médical.
- Lorsque le rat est couché, retirer l’animal de la chambre et le placer dans un cadre stéréotaxique avec un morceau de nez de ventilation appropriée.
- Définissez le niveau de l’isoflurane à 2 %, bien que le taux de flux d’air reste le même. Vérifiez le niveau de l’anesthésie. S’il y a une absence du réflexe de retrait de patte en réponse à pincer, continuer, sinon d’augmenter la profondeur de l’anesthésie.
- Surveiller et maintenir la température corporelle du rat à 37 ° c ± 0,5 ° C, avec un système de surveillance homéothermes. Appliquer une goutte d’onguent de paraffine sur les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée. Répétez cette procédure pendant l’opération plusieurs fois, si nécessaire.
- Injecter par voie sous-cutanée de 0,3 mg/kg l’atropine pour éviter la formation de mucus dans les voies respiratoires. Répétez cette procédure toutes les quatre heures dans le cas de chirurgies plus longtemps. Surveiller la respiration et régler le vaporisateur, si nécessaire.
4. implantation de la Stimulation et les électrodes d’enregistrement
NOTE : Autoclave tout le nécessaire surgical instruments et suivre attentivement les règles générales de l’asepsie et l’antisepsie pendant toute la procédure. Évitez de toucher les zones non stériles à l’extérieur de la zone chirurgicale. Plonger les électrodes dans l’alcool éthylique (70 %) pendant 30 min avant l’implantation.
- Supprimer la plupart des cheveux sur le cuir chevelu avec une tondeuse à cheveux. Appliquez la crème dépilatoire sur le cuir chevelu, étalez-la sur la surface et attendre quelques minutes. Utilisez une spatule pour retirer délicatement la crème et les cheveux restant. Rincer la peau avec de l’eau, puis avec le désinfectant.
- Injecter 1-2 % de lidocaïne (ne pas dépasser une dose totale de 7 mg/kg) par voie sous-cutanée pour engourdir la peau. Appliquer une goutte de pommade vétérinaire pour les yeux (p. ex., paraffine).
- Faites une profondeur et une incision sagittale de long (environ 2 cm) à la ligne médiane avec un scalpel, depuis le front jusqu'à la nuque. Disséquer les tissus, y compris le périoste du crâne, puis à l’aide d’une pince à épiler ciseau ou dent de nettoyer la zone située entre les crêtes des deux OS temporaux. Gardez le crâne exposé en rétractant la peau disséquée en utilisant quatre bulldogs.
- Doucement, placer des pinces fines entre le bord escarpé de l’OS temporal et les muscles et les séparer. Faire des mouvements à la turlutte pour exposer comme une grande partie de la grande surface de l’OS temporal que possible, de préférence à partir du bord de l’os occipital au plan de la suture coronale, sans endommager les muscles.
- Placer bitemporally de rétracteurs pour garder l’OS temporal exposés.
- Rincer la surface du crâne avec 1 à 2 mL 3 % H2O2, puis laver à l’eau 1 à 2 mL.
- Sécher la surface de l’OS temporal avec beaucoup d’attention, éponger l’humidité avec des bâtons oculaires. Tester si les électrodes de stimulation s’insère sur la surface nettoyée crâne verticale (le bord supérieur de l’électrode de stimulation doit être aligné avec le bord de la crista de l’OS temporal). Rétablissez les bulldogs et les enrouleurs ou façonner des électrodes de stimulation avec des ciseaux, si nécessaire.
- Remplir les cavités de la stimulation électrodes avec électroconducteurs gel et mettent une fine couche de colle sur le rebord des électrodes.
- Placer l’électrode de stimulation sur la surface sèche de l’OS temporal avec un mouvement précis et maintenir fermement en place pendant une minute avec des pinces fines. S’assurer que l’humidité ne soit en contact avec la colle. Éponger avec des bâtons oculaires, si nécessaire.
ATTENTION : dans le cas où une instabilité de l’électrode est vécue, supprimez-le. Après le nettoyage de l’OS, répétez cette étape avec une nouvelle électrode de stimulation. - Mettre le ciment dentaire sur les bords de l’électrode de stimulation, tandis que l’humidité qui fuient des tissus est tarie en continu avec des bâtons oculaires. Couvrir l’électrode de stimulation ensemble avec du ciment.
- Après que le ciment est complètement trempé, répétez ces étapes sur le côté controlatéral.
- Percer des trous partout dans le crâne pour vis d’ancrage. Vis miniature en voiture dans les trous et mis le ciment dentaire sur eux. Utiliser un plus petit diamètre d’environ 10 % percer la tête par rapport au diamètre de la vis.
- Selon le but des expériences, soit souder un connecteur vers les extrémités des câbles, placez-le sur la surface, puis le couvercle avec du ciment, ou continuer à implanter les électrodes d’enregistrement et les fibres optiques ou préparer une fenêtre crânienne sur le crâne. Dans ce dernier cas, souder les connecteurs et les ancrer à la construction qu’à la fin. Dans le cas de la nécessité des enregistrements à long terme de TES et LFP simultanés, implanter les triplets de ladite électrode au lieu du fils unique.
Remarque : Cette configuration permet l’élimination du commun mode stimulation artefacts8. Pour les détails de l’implantation d’électrodes d’enregistrement, consultez précédents protocoles14,15. - Laver les tissus exposés abondamment avec du désinfectant. Injecter 1-2 % de lidocaïne (ne pas dépasser une dose totale de 7 mg/kg) par voie sous-cutanée.
- Débrider les bords de la plaie et fermez-les avec des sutures interrompus simples autour du connecteur/implant. Désinfecter la plaie avec la povidone iodée.
- Injecter le carprofene 5 mg/kg par voie sous-cutanée. Répétez cette opération si nécessaire.
Remarque : N’importe quel autres analgésiques peuvent être utilisés en atteindre les exigences établies par le Conseil des autorisations éthiques locales. - Suspendre l’anesthésie, l’earbars et l’embout de sortie et mettre l’animal dans une cage de récupération post-opératoire à reprendre conscience.
- S’assurer que l’animal est sous étroite surveillance pendant les premières heures postopératoires. Continuer de surveiller la zone d’implant périodiquement.
Remarque : L’animal ne doit pas être laissé sans surveillance jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Maison l’animal individuellement jusqu'à la guérison complète de la procédure.
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Representative Results
L’implantation d’électrodes de stimulation chronique (Figure 1 b) peut être associée d’implantation additionnelle d’enregistrement des électrodes (Figure 1-D). Ces réglages sont adaptés former l’enregistrement à la demande et les systèmes de stimulation d’interférer avec les activités spécifiques du cerveau. Nous présentons ici les résultats représentatifs d’une détection de boucle fermée l’épilepsie et le système d’intervention, appliquées sur les rats Long-Evans exprimant saisies spontanée (Figure 2 a)9. Cette souche est connue pour montrer les symptômes électrographiques et comportementales de l’épilepsie absence (petit mal) (Figure 2 b). Dans le cas d’une crise d’épilepsie, comme les signaux intracorticales sont analysés en temps réel, un déclencheur est envoyé à un générateur de stimulus isolé au moment opportun d’interférer avec l’activité de pointes-ondes du cerveau. À son tour, le générateur d’impulsion offre un stimulus de triphasiques-équilibré, grâce à des électrodes de stimulation bitemporal pour interrompre l’activité convulsive.
Figure 2-D montre la capacité des stimuli temporellement ciblés pour interrompre les saisies en cours de semaine 1 à semaine 16, ce qui démontre la robustesse et la fiabilité des électrodes stimulation implanté. Pour mettre ces résultats en contexte, Figure 2E affiche les enregistrements d’une expérience avortée, où le tissu secondaire pénétré entre l’OS temporal et la surface de l’électrode en raison de la mauvaise étanchéité et collage des électrodes (autopsie de la animal a confirmé l’invasion tissulaire). En plus d’augmenter l’impédance des électrodes de stimulation, le tissu croissant est susceptible d’offrir une dérivation électrique. Cette expérience met en évidence l’importance absolue d’isolement prudent d’obtenir des résultats fiables et reproductibles au cours d’expériences de stimulation.
Figure 1 : mesures de stimulation et fabrication d’électrodes d’enregistrement. (A) Twisted fils cousus dans les trous et fixée à l’emballage avant d’envelopper les fils pelées dans les cavités. (B) la forme définitive des électrodes de stimulation. En médaillon : enveloppé de fils à l’intérieur de l’emballage ; (C) côté Découvre les électrodes d’enregistrement ; Vue de dessus (D) les électrodes d’enregistrement. En médaillon : Pointe de l’enregistrement des sites, 400 µm espacement. (E) photo peropératoire de l’emplacement des électrodes stimulation transcrânienne. Les électrodes de stimulation sont déjà implantées, ainsi que certains des vis de fixation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : résultats représentatifs d’intervention saisie de boucle fermée à l’aide des électrodes de stimulation du présent protocole. (A) présentation du système à boucle fermée. Électrodes d’enregistrement triplet sont implantées dans le cortex pariétal et électrodes de stimulation sont placés bitemporally sur le crâne. Le rat est muni d’un amplificateur sur tête et relié à un système de détection de saisie en temps réel. (B), LFP trace une traces d’exemple LFP ininterrompue saisie de pointes-ondes (C et D) de l’intervention de la saisie du 1st et 16ème semaine de stimulation. (E) exemple d’échec de l’interruption de la saisie en cas de tissus entre les électrodes de stimulation et de l’OS temporal (confirmé par l’autopsie) de plus en plus s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’étape la plus critique du présent protocole est le collage de l’ensemble de l’électrode sur la surface osseuse. Dans le cas d’une mauvaise étanchéité, un espace se forme entre les électrodes et l’os et du tissu cicatriciel secondaire peut se transformer en cet écart, ce qui diminue la qualité de la stimulation. La surface osseuse doit être complètement sec au cours des étapes de coller sur le colis, et dans le cas touchés par l’instabilité des électrodes, il doit être supprimé et remplacé par un nouveau package pour obtenir les meilleurs résultats.
Une limitation de cette méthode est que comme la peau n’est pas complètement fermée après la chirurgie, il y a un risque relativement plus élevé d’infection. Soins postopératoires dans les premiers jours de 4-5 lors de la reprise avec une solution désinfectante et plus tard avec la poudre, aide à prévenir l’infection. Dans notre expérience, ce traitement facilite la formation de tissu cicatriciel, qui peut complètement refermer la plaie vers le monde extérieur.
Ici, nous avons présenté une des méthodes moins chers, plus accessibles de la fabrication d’électrodes, mais en fonction des besoins particuliers des expériences particulières, modification du matériau conducteur peut-être être nécessaire, par exemple, revêtement de la surface des câbles avec non polarisant interface matériaux d’électrodes, par exemple, Modélation. Le package de l’électrode peut être fait sur mesure, 3D-imprimés et modifiés par les expérimentateurs, dans les cas nos recommandations ne correspondent pas aux exigences d’une étude particulière. Dans notre expérience, la taille des électrodes transcrânienne fabriqué dans cette étude permettent d’implantations chez les rats mâles et femelles, au-dessus de 300 g de poids corporel, mais la taille des électrodes de stimulation peut facilement être réduite en coupant des bandes plus petites à l’étape du protocole 1.3. en outre, toutes les colles et ciments dentaires données dans le protocole peuvent être remplacés par des substituts, considérant que la couche externe est en contact direct avec les tissus, donc qu'ils devraient être biocompatible.
Dans la présente étude, nous avons fourni un protocole pour bitemporal stimulation électrode fabrication et d’implantation, ce qui est techniquement simple à réaliser, rentable et fiable à long terme, permettant à des expériences de stimulation électrique sur librement déplacement des rats9. Comme les électrodes de stimulation sont placées dans l’OS temporal, la surface du crâne entier horizontal est préservée pour les autres implantations. Cette méthode peut être combinée avec régulière électrophysiologiques15,16, optogenetic17,18 techniques, offrant la possibilité d’une combinaison souple de protocoles expérimentaux et d’imagerie.
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Disclosures
Antal Berényi est le propriétaire et fondateur de Amplipex Ltd, une société de fabrication à grande échelle multiplexage biosignal amplificateurs. Gábor Kozák et Tamás Földi n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les EU-FP7-ERC-2013-Starting grant (No.337075), le programme « Momentum » de l’Académie hongroise des Sciences (LP2013-62) et la subvention de GINOP-2.3.2-15-2016-00018. Nous remercions Máté Kozák pour documenter la stimulation et l’enregistrement des électrodes et Mihály Vöröslakos des échanges fructueux lors de la conception du protocole.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanoacrylate liquid | Henkel | Loctite 401 | |
| Cyanoacrylate gel | Henkel | Loctite 454 | |
| Wire for stimulation electrodes | Phoenix Wire Inc. | 36744MHW - PTFE Microminiature Hook-Up Wire | |
| Board spacer | E-tec Interconnect | SP1-020-S378/01-55 | |
| Connector | E-tec Interconnect | P2510I-02 | |
| Tape packaging for stimulation electrodes | Nexperia | 74HC1G00GW | Tape packaging of any integrated circuit with SOT-353 case can be used |
| Grip Cement Industrial Grade | Caulk Dentsply | 675571 (powder) 675572 (solvent) | |
| Electroconductive gel | Rextra | ECG Gel | |
| Recording electrode wire | California Fine Wire Co. | .002 (50 micron) Tungsten 99.95% (CFW Material #: 100-211), HMl-Natural, cut to 3.0 inch pieces, Round, Cut length piece wire | |
| Ultrafine scissors | Hammacher Instrumente | Stainless HSB 544-09 | |
| Stainless steel tube | Vita Needle Company | 29 RW, 304SS Tubing, T.I.G. Welded and Plug | |
| High speed rotary saw | Dremel | Model # 395 | |
| Rotary saw holder | Dremel | Model # 220 | |
| Rotary saw cut-off wheel | Dremel | Model # 409 | |
| Ocular sticks | Lohmann-Rauscher | Pro-ophta Ocular Sticks | |
| Wet disinfectant | Egis | Betadine | |
| Dry disinfectant | Wagner Pharma | Reseptyl-urea | |
| Drilling machine | NSK-Nakanishi United Kingdom | Vmax35RV Pack | |
| Anchoring screws | Antrin Miniature Specialties, Inc. | 000-120x1/16 SL BIND MS SS |
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