Summary
Dit witboek beschrijft een protocol om 3D-chemische kaarten combineren energie gefilterd beeldvorming en Elektronentomografie. De chemische verdeling van twee katalysator ondersteunt gevormd door elementen die moeilijk zijn te onderscheiden van andere beeldvormingstechnieken werd bestudeerd. Elke toepassing bestaat voor het toewijzen van overlappende chemische elementen - respectievelijk spaced-ionisatie randen.
Abstract
Energie gefilterde Transmissie Electronenmicroscopie tomografie (EFTEM tomografie) kunnen driedimensionale (3D) chemische kaarten van materialen op nanometric schaal. EFTEM tomografie kunt scheiden chemische elementen die zeer moeilijk te onderscheiden van andere beeldvormingstechnieken gebruikt. Het experimentele protocol beschreven hier laat zien hoe om 3D chemische kaarten om te begrijpen van de chemische distributie en morfologie van een materiaal te maken. Monster voorbereiding stappen voor gegevens segmentatie worden gepresenteerd. Dit protocol staat de analyse van de 3D-distributie van chemische elementen in een nanometric monster. Echter, opgemerkt moet worden dat op dit moment de 3D chemische kaarten kunnen alleen worden gegenereerd voor monsters die niet lichtbundel gevoelig liggen, aangezien de opname van gefilterde beelden lange belichtingstijden aan een intense elektronenstraal vereist. Het protocol werd toegepast om het kwantificeren van de chemische distributie van de componenten van twee verschillende heterogene katalysator ondersteunt. In de eerste studie, werd de chemische distributie van aluminium en titanium in titania-aluminiumoxide ondersteunt geanalyseerd. De monsters werden voorbereid met de swing-pH-methode. In de tweede, werd de chemische distributie van aluminium en silicium in kiezelzuur-aluminiumoxide ondersteunt die bereid waren met behulp van de sol-poeder en mechanische mengsel methoden onderzocht.
Introduction
De eigenschappen van functionele materialen zijn afhankelijk van hun 3D parameters. Om volledig begrijpen van hun eigenschappen en hun functies te verbeteren, is het belangrijk om hun morfologie en chemische distributie in 3D te analyseren. Elektron tomografie1 (ET) is één van de beste technieken om deze informatie bij de nanometer schaal2,3te verstrekken. Het bestaat uit draaien van het monster over een grote hoekige bereik en opname van één afbeelding op elke hoekige stap. De verkregen tilt-serie wordt gebruikt voor de wederopbouw van het volume van het monster met behulp van wiskundige algoritmen gebaseerd op de Radon transformatie4,5. Grijze niveaus selecteren in het volume helpt bij het model van het monster in 3D en 3D parameters zoals deeltje lokalisatie6 en grootte distributie7kwantificeren, porie positie en grootte distributie8, enz.
In het algemeen, wordt ET uitgevoerd met een elektronenmicroscoop door het kantelen van het monster, tot de maximale mogelijke hoek, bij voorkeur meer dan 70° in beide richtingen. Op elke hoek van de tilt, is een projectie van de steekproef opgenomen vormen een reeks beelden tilt. Dat tilt serie is uitgelijnd en gebruikt om te reconstrueren van het volume van het monster die zal worden gesegmenteerd en gekwantificeerd. Omdat het monster kan niet van-90 ° tot + 90 ° worden gedraaid, heeft het gereconstrueerde volume een anisotrope resolutie langs de orthogonale as9 als gevolg van de opname van de blinde hoek.
ET kan worden uitgevoerd in verschillende modi van de beeldvorming. De heldere veld TEM modus (BF-TEM) wordt gebruikt voor het bestuderen van amorfe materialen, biologische monsters, polymeren, of katalysator ondersteunt met complexe vormen. De beeldanalyse is gebaseerd op de differentiatie van de grijsniveaus karakterisering van de dichtheid van de onderdelen10 (een dichte onderdeel zullen meer donker dan een aansteker, dat wil zeggen, minder dichte component). Hoge-hoek ringvormige donker veld in de TEM scanmodus (HAADF-stam) is gebruikt om kristallijne monsters analyseren. Het signaal geeft chemische informatie als een functie van het atoomnummer; een zware component van het monster zal verschijnen helderder die een lichtere een9. Andere modi, zoals de Energy Dispersive X-ray spectroscopie (EDX), die de röntgenfoto wordt uitgestraald door de materiële11en energie verzamelt gefilterd imaging modus (EFTEM)12,13, zijn ook in staat zijn voor de beoordeling van de 3D chemische distributie binnen het monster.
EFTEM imaging, kunnen de 2D chemische kaarten worden vastgelegd met behulp van een TEM met een elektron energie spectrometer. De spectrometer fungeert als een magnetische prisma door de elektronen verspreiden als een functie van hun energie. Een afbeelding is gemaakt door de elektronen afhankelijk van de energie verloren van interactie met een specifieke atoom. Als dezelfde chemische 2D plattegrond wordt berekend op verschillende tilt hoeken, een tilt reeks chemische projecties wordt verkregen, kan die gebruikt worden voor de wederopbouw van het 3D-volume van de chemische.
Niet alle materialen kunnen worden geanalyseerd door EFTEM tomografie. De techniek is gereserveerd voor monsters met een zwakke of wanordelijke materialen. Echter kan het worden gebruikt voor het analyseren van lichte elementen die zeer moeilijk te onderscheiden van de bij het gebruik van andere beeldvormingstechnieken. Bovendien, voor het verkrijgen van betrouwbare 2D chemische kaarten, de dikte van het materiaal moet kleiner zijn dan de gemiddelde gratis weg van de elektronen door de materiële14. Onder deze voorwaarde is de waarschijnlijkheid van een één elektron interactie met een enkel atoom het grootst. Twee methoden worden gebruikt voor het berekenen van een 2D chemische kaart. De eerste, en de meest gebruikte is de "methode van drie-windows", waar twee gefilterde energie Vensters worden afgelezen voordat de ionisatie-rand van het element onder analyse en een derde na de behandeling door ionisering rand13. De eerste twee afbeeldingen worden gebruikt voor het schatten van de achtergrond, die met behulp van een machtswet op de positie van het derde venster en afgetrokken van het is geëxtrapoleerd. Het verkregen beeld is de projectie van de 3D-verdeling van de geanalyseerde scheikundig element in het monstervolume. De tweede methode heet de 'sprong-verhouding"; het maakt gebruik van slechts twee afbeeldingen van het energie-gefilterd, één voor en één na de behandeling door ionisering rand. Deze methode is kwalitatief, zoals de uiteindelijke afbeelding alleen door het uitvoeren van de verhouding tussen die twee beelden wordt berekend, en houdt geen rekening met achtergrond energie variatie.
Door te combineren met ET EFTEM, kan de analytische tomografie van de gefilterde energie worden verkregen. EFTEM-tomografie en Atoom sonde tomografie (APT) zijn complementaire technieken. In vergelijking met APT is EFTEM tomografie een niet-destructieve karakterisering analyse die niet complex monstervoorbereiding hoeft. Het kan worden gebruikt voor het uitvoeren van verschillende personages op een unieke nanoparticle. EFTEM tomografie kunt analyseren isolatiematerialen, terwijl APT op de minst laser-hulp moet voor het meten van hen. APT loopt op de atoomschaal, terwijl EFTEM tomografie naar behoren met een lagere resolutie presteert. EFTEM tomografie is relevant alleen voor monsters die bundel afbraak tijdens het experiment te weerstaan. Als u alle gefilterde afbeeldingen op alle gekanteld hoeken opnemen, kan het monster worden blootgesteld aan de elektronenbundel voor zo lang als 2 h. Bovendien, als u een maximale chemische signaal opnemen in de 2D-kaarten, langere duur van de expositie bij Verstraler intensiteit kunnen nodig zijn. In dergelijke omstandigheden lijden de lichtbundel gevoelige monsters drastische morfologische en chemische veranderingen. Daarom is een nauwkeurige meting van de gevoeligheid van de steekproef voor de elektronenbundel moet komen voordat het experiment. Daarnaast is EFTEM tomografie het resultaat van het opnemen van zoveel tomograms als dit nodig is om de ruimtelijke locatie en de aard van de chemische elementen die aanwezig in het monster. zijn Toch EFTEM tomografie kan belangrijke informatie verstrekken over de 3D chemische distributie voor monsters, zoals katalysator ondersteunt, zodat nieuwe inzichten voor het modelleren van hun katalytische toepassingen.
Vandaag is het mogelijk om te gebruiken speciale software die het energie-interval kunt selecteren, record gefilterd energie venster afbeeldingen en de chemische kaarten in verschillende tilt hoek te berekenen. Ze laten kantelen van het monster, bijhouden, richten en opnemen van de gefilterde afbeelding in EFTEM modus. De 2D chemische kaarten kunnen worden berekend, kan en vervolgens de tilt-serie kunnen worden uitgelijnd, het chemische volume berekend met behulp van iteratieve algoritmen, en uiteindelijk de serie gesegmenteerde en gekwantificeerde15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de monstervoorbereiding
- Het verpletteren van het monster in een mortier en het verspreiden in alcohol of gedistilleerd water; plaats een druppel van het monster op een grid microscopie en laat het drogen.
Opmerking: Monsters zoals siliciumdioxide aluminiumoxide of titania aluminiumoxide kunnen een poeder of een geëxtrudeerde materiaal, en kunnen worden verpletterd en gedispergeerd in een oplossing met behulp van echografie. In het algemeen, voor ET analyse is het belangrijk dat de concentratie van het monster op de grid laag is, monster superpositie en shadowing wanneer het raster onder een grote hoek kantelen te voorkomen. De 200-mesh microscopie rasters die ondersteuning bieden voor een film van een koolstof of lacey koolstof worden aanbevolen. - Met behulp van een precisiepipet, zet een droplet een colloïdale oplossing met fiducial markeringen over het monster. Absorberen van enige overtollige oplossing en laat het drogen.
Opmerking: De fiducial markers zijn goed gekalibreerde Au nanodeeltjes opgeschort in een oplossing. De fiducial markers kunnen ook worden verspreid over het raster voor het toevoegen van het monster. Als voorbeeld, kunnen de als het monster is gemaakt van nanodeeltjes met vergelijkbare grootte als de fiducial markeringen, de fiducial markers over het raster storten om te scheiden goed tijdens de gegevens segmentatie en kwantificering. De fiducial markers zijn positie verwijzingen gebruikt bij het uitlijnen van de scheve afbeeldingen.
2. opname van de gefilterde Tilt serie beelden
- Met de elektronenmicroscoop, een geïsoleerde monster te vinden in het midden van het raster microscopie.
Opmerking: In de elektronenmicroscoop, de X-as wordt langs de monsterhouder, de Y-as staat loodrecht op de monsterhouder en de Z-as wordt langs de elektronenbundel. Om te kunnen kantelen van het monster bij de maximale tilt hoek, analyseren van een steekproef die zich zo dicht mogelijk bij de X-as. - Zodra het monster goed gepositioneerd is, Controleer de chemische samenstelling van het monster. Een chemische analyse met energie dispersieve x-stralen spectrometrie (EDS), of verlies spectrometrie (EELS) van de energie van de elektronen door zich te concentreren het licht over de gekozen voorbeeld uitvoeren en opnemen van een spectrum. Als het monster de chemische elementen van belang bevat, het afstappen en de volgende tests uitvoeren op een nabijgelegen representatieve steekproef.
- Controleer de electron beam intensiteit over het monster, de breedte van de ramen van de energie van de gefilterde beelden, en de tijd van de expositie van elk gefilterd afbeelding. Vind het beste compromis voor de steekproef tussen lichtbundel schade en de chemische signaal opgenomen in de chemische projecties12,13,17.
Opmerking: Als u de maximale chemische signaal opnemen in de gefilterde beelden, gebruik de maximale straal intensiteit. Echter moet een bestraling test worden uitgevoerd voordat een analyse om te controleren op eventuele wijzigingen aan het monster van het effect van de elektronenbundel. Om dit te doen, berekenen het elektron dosis tijdens de opnames van de serie tilt. Daarnaast kan een ease-test worden gedaan door te vergelijken met een afbeelding voordat een afbeelding na het experiment. - De EFTEM-modus van de opnamesoftware gebruiken voor het berekenen van een 2D chemische kaart met behulp van de methode van drie-vensters en controleer als een voldoende chemische signaal is opgenomen.
Opmerking: De software registreert drie gefilterde beelden; de eerste twee worden gebruikt voor het schatten van de achtergrond van de derde afbeelding.- In de software, het chemische element onder het onderzoek en de behandeling door ionisering rand te selecteren. Stel de breedte van het venster van de energie en de blootstellingstijd. De beelden registreren en vervolgens berekent de chemische kaart gebruikend een machtswet uitpakken van de achtergrond. In een 32-bits omgeving met 512 x 512 pixels is de minimale signaal ongeveer 300-400 punten per pixel in een chemische beeld opgenomen.
- Stel de hoek van het monster op de hoogte van de eucentric en controleer de minimale tilt hoek, dat wil zeggen,-70 ° of minder en maximale tilt, dat wil zeggen, + 70 ° of meer.
- Breng het monster terug in de weergave worden geanalyseerd en het opnemen van een afbeelding (dit is het beeld voor de overname). Noteer de gekantelde serie van gefilterde beelden met behulp van de juiste software.
Opmerking: De toegewijde EFTEM tomografie plugins kunt opnemen verscheidene tilt serie op hetzelfde moment. Dit betekent dat op elke hoek van de tilt, verschillende opeenvolgende beelden kunnen opgenomen worden. De eerste afbeelding kan een gefilterde afbeelding gecentreerd op nul-verlies en dit beeld is een typisch beeld van helder-veld. De pre rand beelden en vervolgens de afbeelding na rand van de eerste scheikundig element worden gevolgd door de beelden van de pre rand en het beeld na rand van de tweede scheikundig element. De opvolging van de chemische elementen wordt gegeven door hun geselecteerde ionisatie rand.- Kantelen in de opname EFTEM reeks software, selecteer de breedte van elk venster van de energie en de belichtingstijd en vervolgens de maximum en minimum tilt hoek en de hoekige stap van de tilt. Om het compromis tussen het aantal beelden in de serie tilt en de totale blootstellingstijd van het monster tot de elektronenbundel, gebruik een tilt-step 4°, dat wil zeggen, 51 beelden per tilt series tussen ± 71 °; echter kan een kleinere tilt stap kan worden gekozen als het monster niet onder de balk degraderen.
- Opnemen voor elk chemisch element, drie tilt series van gefilterde beelden voor het berekenen van de chemische projectie met behulp van de methode van de drie vensters. Om te kwantificeren de natuurlijke drift van het monster in elke hoek van de tilt tijdens het opnemen van de gefilterde beelden (het monster kan blijven in een bepaalde hoek tilt voor meer dan 1 min), kan de eerste afbeelding een gefilterde afbeelding op nul signaal verlies worden zodat de laatste opgenomen beeld een unfil zullen liseerd beeld gevormd door alle elektronen bij alle energieën. Die twee afbeeldingen kunnen worden gebruikt voor het berekenen van de kaart van de dikte van het monster. Daarom, voor de waarneming van de chemische distributie van twee elementen in elke hoek van de tilt, 7 gefilterde beelden te registreren (1 verlies, 3 voor de eerste chemisch element, 3 voor de tweede scheikundig element nul) en 1 ongefilterde beeld (in totaal 8 tilt-serie opgenomen).
3. de uitlijning en de wederopbouw van de serie Tilt
- De drie gefilterde afbeeldingen overeenkomt met elke chemische element voor elke tilt hoek uitlijnen en de chemische kaart met behulp van een gespecialiseerde EFTEMTJ15,18 plugin voor ImageJ te berekenen. In de ImageJ software, gebruikt u het pad bestand | Open en selecteer de bestanden die overeenkomt met de filter beelden tilt serie. Open alle drie reeksen van de gefilterde tilt: twee pre rand en één post rand.
- Open de toegewijde EFTEMTJ plugin. Klik op + | Afbeelding of stapel en selecteer de tilt-serie die al geopend zijn.
- In de tabel dat verschijnt, werd Vul de energie shift voor elke tilt reeks, dat wil zeggen, de energie waarmee elke kantelen serie opgenomen. Ook, vult de breedte geslit, dat wil zeggen, de energie-windows. Vul de "Belichtingstijd" van elke gefilterde afbeelding. Check voor alle drie tilt serie Mapping. Klik op volgende.
- Koos de eerste beeld als de referentieafbeelding en klik vervolgens op toepassen. Klik op volgende: een voorvertoning van de voorgestelde aanpassing wordt weergegeven. Visueel controleren of de 3 beelden opgenomen onder dezelfde tilt hoek goed Kagel (geen verschuiving tussen de beelden moet worden nageleefd).
Opmerking: Dit protocol werd uitgevoerd op de versie 0.9 van het EFTEMTJ plugin. Op dit moment de gefilterde beelden opgenomen at dezelfde tilt hoek worden uitgelijnd. - Selecteer in het venster van de EFTEMTJ, de afbeeldingen op de achtergrond en op de chemische randovereenkomt. Selecteer het model van de signaal-extractie als macht, en klik vervolgens op Createkaart. Selecteer op ImageJ, bestand | Sla en vinden de weg naar dit laatste bestand opslaan.
Opmerking: De tilt-serie van de chemische kaart wordt verkregen. Meer informatie over het gebruik van de plugin is online beschikbaar. - Herhaal stap 3.1 voor alle chemische tilt reeksen.
- Uitlijnen van de nul-verlies tilt-serie met behulp van een versie van de Imod software19 uitgebracht in 2009 de tilt-serie worden uitgelijnd. De software maakt de toepassing van de berekende uitlijning op een reeks tilt aan een andere reeks van tilt.
Opmerking: De uitlijning software schrijft op de schijfbestanden met alle verplaatsingen toegepast op elke afbeelding. De alignement procedure met behulp van de Imod20 elders wordt herzien en is niet binnen de werkingssfeer van dit artikel. - Gebruik de uitlijning berekend voor de reeks van de nul-verlies tilt, en toe te passen op de eerder berekende chemische tilt-serie.
Opmerking: In deze softwareversie is het mogelijk om te veranderen van het bestand nul-verlies tilt serie met een chemische tilt serie bestand door behoud van de naam van het bestand en de toepassing van de vorige berekende verplaatsingen. Anders voor de software, het bestand heeft dezelfde naam, hetzelfde aantal beelden van dezelfde grootte, maar het bevat geen nul verlies beelden maar chemische beelden. - Kwantificeren van de drift door grensoverschrijdende correleren het eerste opgenomen beeld, dat wil zeggen, center op de nul verlies, en de laatste (de ongefilterde afbeelding). Het monster kunt doorbrengen enkele seconden op elke tilt hoek terwijl alle gefilterde beelden worden opgenomen. Gedurende deze tijd drijft het monster natuurlijk een klein bedrag.
- ImageJ software, tikken voort bestand | Open en selecteer de nul verlies uitgelijnd kantelen serie, dan openen de chemische kaarten uitgelijnd tilt serie.
- Klik op Edit | Kleur | Kanalen verenigen. Selecteer het bestand dat overeenkomt met de nul verlies voor de rode kleur, de eerste scheikundig element voor groen, en de tweede scheikundig element voor blue, in die volgorde. Uncheck Samengestelde maken en controleren van de Bronafbeelding houden. Een stapel is gemaakt op de hoeken van elke tilt voor alle de opgenomen beelden.
- Klik op Plugins | Uitlijnen van RGB plannen21. Rood is de referentieafbeelding. Selecteer groen en het over rode met behulp van de pijlen, overlappen. Klik op volgende en herhaalt u voor alle hoeken.
- Klik op Edit | Kleur | Kanalen splitsen en de RGB-stack zal worden verdeeld in drie stapels: rode overeenkomt met nul verlies en groene en blauwe overeenkomt met de chemische kaarten met de drift gecorrigeerd. Klik op bestand | Opslaan om op te slaan van de serie tilt.
- Klik op Plugins | Tomoj22,,23 belasting hoek formulierbestand te selecteren. Omdat alle de tilt-serie al zijn uitgelijnd, navigeer rechtstreeks naar wederopbouw. Berekenen van de volumes van nul-verlies, evenals de chemische volumes, met behulp van wederopbouw algoritmen zoals kunst, SIRT, OS-ART, enz.
Opmerking: Het wordt aanbevolen om te gebruiken een iteratief algoritme voor de wederopbouw van de chemische volumes. Met behulp van deze software, is het mogelijk om te reconstrueren de volumes met behulp van de GPU. - Zodra alle volumes worden berekend, de optie Kanalen verenigen verschillende kleuren toepassen op de verkregen hoeveelheden en overlappen ze in een enkel volume, te verkrijgen van de 3D chemische kaart.
4. 3D Modeling en kwantificering
- Binarize van het gereconstrueerde ZL volume door het selecteren van het corresponderende grijze niveau, die het volume verkregen in wit zullen (in 8 bits, de intensiteit is 255) en zwart (in 8 bits, de intensiteit is 0). In ImageJ, gebruikt u de optie "select drempel". Alle pixels die betrekking hebben op de steekproef selecteren (in een BF beeld, de donkerdere pixels correspondeert met het monster massa) en maak een volume waar het monster is wit en het vacuüm is zwart.
Opmerking: Het volume van de nul-verlies informatie morfologische van het geanalyseerde monster, dat wil zeggen, de vorm en de grootte van de steekproef. - Verdeel het binaire volume van nul verlies door 255, en verkrijgen van een volume waar de intensiteiten binnen het monster 1 en elders zijn 0. Dit is de genormaliseerde volume.
- Vermenigvuldig het genormaliseerde volume met elk van de berekende chemische volumes (stap 4.1) te verkrijgen van een volume waar de intensiteiten binnen het monster overeenstemmen met de chemische gegevens, en deze intensiteiten zijn 0 elders.
Opmerking: De chemische informatie is afgeleid van het monster en daarom alle artefacten zijn uitgesloten. - In ImageJ, berekenen het histogram van de chemische volume en importeer de waarden van het histogram in een tabulate software.
- In de tabulate software, verwijder de regel met een intensiteit heist telling van 0 (deze regel komt overeen met het vacuüm).
- Bereken het percentage van elke intensiteit in het volume in een nieuwe kolom. Verdeel de graaf van elke intensiteit door de som van alle graven, en vermenigvuldigen met 100.
- Bereken het percentage dat overeenkomt met de intensiteit van het totale volume door stapsgewijs toe te voegen het huidige aandeel van de graven, eerder berekend met het vorige deel in een nieuwe kolom.
Opmerking: In de chemische volumes, de hoge intensiteiten komen overeen met de chemische informatie. De intensiteiten zijn echter laag en het lawaai in het hoge volume. De drempel is gemaakt door het selecteren van de hoogste intensiteit. - Het kennen van de relatieve concentratie van een chemisch element in de steekproef berekend op basis van de aal-spectrum, selecteer de heist-intensiteiten. Starten vanaf 255 (als bestaande) en afnemen van de intensiteit die overeenkomt met de concentratie van het scheikundig element.
- Om te zoeken naar de laagste intensiteit die overeenkomt met de chemische concentratie, navigeer naar de kolom waar het aandeel van de overeenkomstige intensiteit werd berekend in het totale volume, de 100% komt gewoonlijk overeen met de intensiteit van 255. Van 100%, extract het berekende relatieve aandeel van het chemische element (uit het spectrum van de aal): het resultaat komt overeen met de minimale intensiteit in de drempel. Op deze manier, worden chemische binarized volumes verkregen, waar de voxels het chemische element correspondeert met de intensiteit van 255 en al rest is 0. Herhaal de procedure voor het tweede element en twee chemische binarized volumes te verkrijgen.
- Overlappen de binarized chemische volumes met behulp van de optie Kanalen verenigen en een andere kleur toewijzen aan het volume van elk element te maken van een RGB-volume.
Opmerking: Door de samenloop van de twee binarized chemische volumes, voxels die zijn bovenop, die behoren tot de beide chemische elementen (gemeente voxels) en voxels die niet tot een van de chemische elementen (gratis voxels behoren) worden gemarkeerd. Bijvoorbeeld maken de binarized chemische hoeveelheid rood en groen gemeente voxels die geel zijn. - Transformeren van het volume van de RGB-in 8 bits volume; de kleuren zullen hebben verschillende grijs intensiteiten. Selecteer de voxels die deel uitmaken van beide chemische soorten (geel in het RGB-volume) met de optie drempel. Met de optie drempel dezelfde Selecteer de voxels die geen deel van een chemisch element uitmaken (ze hebben lagere intensiteit dan de eerder geselecteerde voxels). Selecteer het vacuüm niet met intensiteit 0.
- Normaliseren van de volumes van de gemeente voxels en het volume van de vrije voxels. De volumes van de gratis voxels door de chemische volumes vermenigvuldigen en aftrekken van het andere chemische volume.
Opmerking: Dit wordt berekend met het chemische element in elke voxel die de hoogste intensiteit heeft. - Het toevoegen van de volumes van de voxels die deel uitmaken van en de voxels die geen deel uitmaken van het volume van het chemische element, dat de hoogste intensiteit in die voxels heeft.
Opmerking: Op deze manier elke gemeente voxel of gratis voxel is gedifferentieerd en toegewezen aan het volume van het chemische element, dat de hoogste intensiteit in dat voxel heeft. Dit kan worden uitgevoerd door de optie "Afbeelding calculator":
- Om te kwantificeren van het aantal voxels die vormen van het monster, de gesegmenteerde volumes in gespecialiseerde oppervlakte rendering software, zoals een 3D Slicer te importeren. Vervolgens vermenigvuldigt u de omvang van een voxel in nm3 te verkrijgen van het volume van het monster in 3D.
- Met behulp van de optie Randen zoeken , kwantificeren van de vorming van het oppervlak van het monster voxels en vermenigvuldigen met de oppervlakte van de voxel in nm2 te verkrijgen van het oppervlak van het monster.
- De specifieke oppervlakte berekenen door het verdelen van het oppervlak van het monster door de massa van het monster.
Opmerking: De massa van het monster kan worden geschat met behulp van de theoretische dichtheid van het monster. In het algemeen, is de specifieke oppervlakte berekend door ET 10 minder dan het specifieke oppervlak berekend door speciale methoden zoals N2 adsorptie desorptie. - Berekent de grootteverdeling van de porie, u het binarized volume van de nul verlies (het volume dat BF). De binaire volume van de BF wederopbouw is uitgezet met behulp van de 3D Toolkit/morfologische verwijden 3D plugin totdat alle de poriën vallen en vervolgens zo vaak als uitgezet 3D geërodeerde met behulp van de 3D-Toolkit/morfologische eroderen. Het verkregen volume wordt vervolgens vermenigvuldigd met de omgekeerde volume van het binarized BF volume, tot in de poriën distributie volume die kan worden gevisualiseerd met behulp van een speciale oppervlakte rendering software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld van de toepassing van dit protocol wordt weergegeven in de verwijzing13. EFTEM tomografie werd gebruikt voor het analyseren van titania aluminiumoxide katalysator ondersteunt. Ter verbetering van de katalytische activiteit van de actieve fase van Mnd2 nanodeeltjes, in toepassingen zoals hydrodesulfurization (HDS), is het belangrijk dat titania preponderant aan het oppervlak van de steun, en bij aanraking met de actieve fase. Het is bekend dat titania een kleinere specifieke oppervlakte dan aluminiumoxide heeft. Het doel van de studie is om te bouwen van titania ondersteund door aluminiumoxide (en dus het maken van een verbeterde specifieke oppervlak), en dan het te testen als een katalysator-ondersteuning. Hier, wordt de EFTEM-tomografie gebruikt voor het analyseren van titania-aluminiumoxide heterogene katalysator ondersteuning bereid door de swing pH-methode. In deze studie, worden drie monsters van verschillende titania concentraties geanalyseerd. Monster 1 bestaat uit 50% alumina en 50% titania, monster 2 bestaat voor 70% alumina en 30% titania en monster 3 is samengesteld uit 90% alumina en 10% titania. In Figuur 1a-1 c, worden doorsneden van de chemische kaarten parallel aan de XY-oppervlakte getoond. Groen vertegenwoordigt de ruimtelijke chemische spreiding van titania, rood toont de verdeling van aluminiumoxide en blauw vertegenwoordigt het vacuüm. De chemische volumes zijn berekend op basis van de tilt-serie met de methode van drie-vensters. De gefilterde energie ramen waren als volgt: 10 eV breed, gecentreerd op 59, 70 en 81 eV, met een tijd van de expositie van 3 s voor de Al L23 rand gelegen bij 73 eV en 30 eV breed, gecentreerd op 415, 445 en 482 eV, hebben een opnametijd van 15 s voor de Ti L23 rand gelegen op 455 eV. De positie en de breedte, evenals de belichtingstijd van de gefilterde beelden werden gekozen om het verkrijgen van een chemische kaart met een chemische opspoorbaar signaal. De tilt-serie werden opgenomen tussen-71 ° en +71 ° met een toename van 4 ° in de de Saxton modus24 in ongeveer 119 min.
Bleek dat titania met een hoge concentratie is het vormen van clusters die zijn ingesloten in de aluminiumoxide. De modellen worden weergegeven in Figuur 1 d (voorbeeld 1), 1e (voorbeeld 2) en 1f (voorbeeld 3). In de modellen, de titania wordt weergegeven in het blauw en de aluminiumoxide in transparant rood wordt weergegeven. Deze modellen werden gekwantificeerd aan de hand van de chemische distributie van titania en aluminiumoxide op het oppervlak van de monsters. Bleek, dat onafhankelijk is van het aandeel van titania en aluminiumoxide in de steekproef, het oppervlak van het monster is bedekt met titania in een concentratie van 30%. Echter groeit de specifieke oppervlakte van het monster, terwijl het aandeel van titania afneemt om te bereiken van de specifieke oppervlakte van aluminiumoxide. Voor monster 3 met slechts 10% titania, een laag van ongeveer 10 nm dik wordt gevormd op het oppervlak van het monster. Ook de chemische kaart wordt gevormd door de samenloop van de drie delen: silica in het rood, titania in het groen, en nul verlies in blauw. Het mengsel tussen rood en groen zijn gele voxels. De gele voxels toegeschreven aan het element met de hoogste intensiteit in dat voxel in het model. Dit is een beperking in de ruimtelijke resolutie van 3D-chemische kaarten, die rechtstreeks verband houdt met het anisotrope resolutie in ET en de resolutie van de 2D chemische kaarten geleverd door EFTEM. De analyse is gecorreleerd met andere analytische technieken zoals röntgen fluorescentie, X-ray photoelectron spectroscopy en N2 porosimetrie. Geconcludeerd werd dat het verschil tussen de specifieke oppervlakken een rol in de katalytische toepassingen spelen kan.
Als een tweede voorbeeld is de studie gedetailleerde in17 komt te staan. In dit onderzoek geanalyseerd wij een reeks van silica aluminiumoxide katalysator ondersteunt. Deze katalysator ondersteunt hebben een zuurgraad die geboden door het mengsel tussen de aluminiumoxide en siliciumdioxide, vormen een aluminosilicaat. Het doel van de studie was te kwantificeren van het mengsel tussen de twee componenten. De experimentele uitdaging gelogen in het feit dat de randen van de23 L van Al en Si heel dichtbij, op 73 eV en 99 eV respectievelijk, en de ionisatie rand van Al met de rand van de ionisatie van Si overlapt. Onder deze omstandigheden is de drie-venster-methode minder nauwkeurig voor het extraheren van de chemische signaal. Om te differentiëren van de twee signalen van Al en Si, werd de "R-ratio" methode ontwikkeld, gedetailleerde in referentie12. De gefilterde beelden tilt serie werden geregistreerd door het kantelen van het voorbeeldformulier-71 ° +71 ° met de stap van een toename van 4 ° in de de Saxton modus in ongeveer 83-104 min. Drie gefilterde beelden werden opgenomen om te isoleren van het signaal van de L23 ionisatie rand van Si. De beelden waren gecentreerd op 59 eV, 70 eV en 81 eV, waren 10 eV breed en blootgestelde voor 5 s. Voor het signaal overeenkomt met de L23 rand van Al, slechts twee gefilterde beelden waren opgenomen, gecentreerd op 99 eV en 110 eV, 10 eV breed en blootgestelde voor 12 s.
In dit onderzoek geanalyseerd wij een serie van vier monsters van Al en Si door verschillende methoden bereid. Figuur 2a is een dwarsdoorsnede van de chemische kaart parallel aan de XY-oppervlakte en het model van het monster dat is bereid volgens de methode van de sol-poeder. In dit voorbeeld werd thermisch behandeld onder stoom, opbrengst van het tweede monster, waarvan de chemische kaart en model worden weergegeven in Figuur 2b. Figuur 2 c toont de chemische kaarten van het monster door mechanische mengsel bereid. In dit voorbeeld verkregen na een thermische behandeling onder de hete stoom, we het vierde monster, getoond in figuur 2d. De chemische stof maps en modellen voor aluminiumoxide zijn rood en silica zijn groen, terwijl de verbeterde blauwe vertegenwoordigt de grens aan het oppervlak tussen de silica en aluminiumoxide. De zure katalytische activiteit wordt gegeven door het mengsel tussen aluminiumoxide en siliciumdioxide op het oppervlak van het monster. Het komt voor dat onafhankelijk is van de methode van de voorbereiding, de silica slechts 30% van het oppervlak van de steekproef dekt. Na de thermische behandeling, de chemische distributie meer homogeen is, en het oppervlak bedekt is met 50% silica en aluminiumoxide van 50%. De sol-poeder-methode biedt monsters met een hoge homogeniteit tussen de onderdelen in vergelijking met het mechanische mengsel. Kleine domeinen van silica ingebed in aluminiumoxide zijn aanwezig in het monster. Voor de steekproef bereid door mechanische mengsel, silica vormt de kern van het monster en aluminiumoxide is aanwezig als een schelp. Als een algemeen kenmerk van beide monsters dat niet thermisch behandeld, de siliciumdioxide ligt in het centrum, en de aluminiumoxide is op het oppervlak.
De dichtheid van de zure site geboden door de fase van de aluminosilicaat gevormd door het intieme mengsel tussen silica en aluminiumoxide, Brønsted zure sites maken aan zijn oppervlak, wordt gemeten in willekeurige eenheden (a.u.)/m-2 door CO adsorptie. De kwantisatie van de grens tussen silica en aluminiumoxide werd uitgevoerd in m/g of m/m2, die fysieke eenheden zijn bekend. Natuurlijk, het raakvlak tussen silica en aluminiumoxide zou dikker, maar de ruimtelijke resolutie bereikt stond niet toe dat de berekening van een exacte waarde van het overeenkomstige breedte. Echter, deze studie opent de weg naar een dieper begrip van de interface tussen silica en aluminiumoxide.
Figuur 1: kruissecties en gereconstrueerde modellen van de monsters titania en aluminiumoxide. Doorsneden door de chemische kaart parallel aan de XY-oppervlakte, waar de chemische distributies worden getoond voor titania (in groen), alumina (in rood) en de onderdruk (in blauw): (een) voorbeeld 1, 50% alumina en 50% titania, (b) monster 2, 70% alumina en 30% titania, en (c) monster 3, 90% alumina en 10% titania. (d) (e) en (f) de modellen van voorbeeld 1, voorbeeld 2 en monster 3, respectievelijk, met aluminiumoxide in transparant rood en titania in blauw worden weergegeven. In voorbeeld 1 en voorbeeld 2 Sluit de aluminiumoxide de titania. In voorbeeld 3, een dun laagje van 10 nm van titania wordt gevormd op het oppervlak van het monster. Dit cijfer is gewijzigd van Roiban et al. 13 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: kruissecties en gereconstrueerde modellen van de monsters silica en aluminiumoxide. Aan de linkerkant zijn kruissecties parallel aan de XY-oppervlakte van de chemische volumes, aan de rechterkant zijn de gereconstrueerde modellen. Alumina in rood wordt weergegeven, worden silica in het groen, en de grens tussen de oppervlakken van de silica en aluminiumoxide aangeduid in blauw. In deze modellen, is de grens kunstmatig uitgezet door een 4-voxel bol met deze zichtbaar te maken. (een) het monster bereid door de methode van de sol-poeder, (b) het monster bereid volgens de methode van de sol-poeder en thermisch behandeld, (c) het monster opgesteld door de mechanische mengsel methode, en (d) het monster voorbereid door de mechanische mengsel methode en thermisch behandeld. Dit cijfer is gewijzigd van Roiban et al. 17 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van deze paper is om te beschrijven van het verkrijgen van 3D-chemische kaarten met behulp van EFTEM tomografie. Dit protocol is volledig origineel en werd ontwikkeld door de auteurs.
EFTEM tomografie zoals signaleren hiernaartoe heeft meerdere nadelen: (i) alleen monsters die electron beam resistent kunnen worden geanalyseerd, als gevolg van de lange belichtingstijd nodig voor het verkrijgen van gefilterde beelden. (ii) EFTEM tomografie is gevoelig voor het contrast van diffractie. (iii) veel van de aanpassingen werden handmatig uitgevoerd. Voor het verkrijgen van de 3D chemische kaart, moeten en de chemische volumes op het volume nul-verlies in een enkel systeem van coördinaten. Dit vereist dat alle tilt reeksen worden perfect uitgelijnd in het hetzelfde coördinatensysteem. Dit vertegenwoordigt een lange werkperiode van ten minste twee weken per monster. Ondanks dat het tijdrovend, staat dit protocol de berekening van de 3D-chemische kaarten bij een resolutie van nanometric. Bovendien, in combinatie met andere spectroscopische en analytische technieken zoals, Röntgen fluorescentie, X-ray photoelectron spectroscopy, FTIR spectroscopie, of magic-hoek-spinning (MAS) NMR spectroscopie, een volledige beschrijving van een functioneel materiaal kan worden gemaakt.
De intensiteit van de bundel elektronen wordt over het algemeen beheerd door condenserend van de elektronenbundel. De breedte van het venster van de energie waarmee de gefilterde beelden worden opgenomen en hun blootstellingstijd zal invloed hebben op de chemische signaal intensiteit opgenomen in elke chemische projectie, die zal worden gebruikt als gekanteld projecties te reconstrueren van het chemische volume. De belichtingstijd van de gefilterde beelden beïnvloedt de totale blootstellingstijd van het monster onder een intens elektronenstraal tijdens de opnames van de serie tilt. Als een monster te veel tijd onder de balk blijft, kan het drastische wijzigingen nadelig beïnvloeden. De breedte van de energie-windows beïnvloedt de achtergrond onderlinge aanpassing uitpakken met een machtswet het chemische signaal uit de gefilterde afbeelding van post rand met behulp van de methode van drie-vensters.
Aangezien het is een uitdagende techniek en tijdrovend, EFTEM tomografie niet praktisch voor grootschalige uitvoering is. Echter, nieuwe technische verbeteringen zoals de ontwikkeling van meer gevoelige spectrometers25 en snelle opname camera's26,27 (de camera's verwijzingen lijst is een gedeeltelijke lijst) zal verminderen de totale recordtijd van de tilt serie en de resolutie van de energetische van de chemische kaarten zullen verbeteren. Zoals eerder vermeld, zijn veel van de uitlijning manual, signaal winning en berekening van de chemische prognoses aan de uitlijning van alle projecties op de dezelfde verwijzing van. De ontwikkeling van automatische procedures maakt een meer algemeen gebruik van EFTEM tomografie in routine analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar aan het Franse Ministerie van hoger onderwijs en onderzoek, conventies Industrielles de Formation par la Recherche (CIFRE) en IFP energieën Nouvelles voor hun financiële steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JEOL 2100f | JEOL | Electron microscope | |
| Tridiem Gatan Imaging Filter (GIF) | Gatan | Post colum energy filter | |
| Digital micrograph | Gatan | Software | |
| Gatan EFTEM tomography plugin | Gatan | Dedicated software to record filtered tilt series for EFTEM tomograohy | |
| Tomoj | Imagej plugin http://www.cmib.fr/en/download/softwares/ | Free software developed by Currie Institute in Paris, France for electron tomography | |
| EFTEM-Tomoj | Imagej plugin http://www.cmib.fr/en/download/softwares/ | Free software developed by Currie Institute in Paris, France , for EFTEM imaging | |
| Imod | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | Free software developed by University of Colorado, USA for electron tomography | |
| Imagej | https://imagej.nih.gov/ij/ | Free software developed by National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA for images treatment | |
| Merge channels | https://imagej.net/Color_Image_Processing | Fonction in Imagej allowing to give different colors to volumes while they are overlapped | |
| 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Free software developed by a large consortium lead by Ron Kikinis , Harvard Medical School, Boston, MA, SUA | |
| Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | Free software developed by the Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics at the University of California, San Francisco,for data segmentation, cuatification and visualisation of 3D models | |
| silica alumina support of catalyst | IFPEN | sample prepared for eleboration of this protocol | |
| titania alumina support of catalyst | IFPEN | sample prepared for eleboration of this protocol | |
| alcohol | |||
| water | |||
| Au nanoparticles of 5 nm | BBI Solutions | ||
| Holey carbn film 200 mesh microscopy grid | Agar | ||
| EDX sepctrometer | Oxford Instruments |
References
- Frank, J. Electron Tomography - Methods for Three-Dimensional Visualization of Structures in the Cell. , Springer-Verlag. New York. (2006).
- Midgley, P. A., Dunin-Borkowski, R. E. Electron tomography and holography in materials science. Nat. Mater. 8, 271-280 (2009).
- Carenco, S. The core contribution of transmission electron microscopy to functional nanomaterials engineering. Nanoscale. 8 (3), 1260-1279 (2016).
- Radon, J. Uber die Bestimmung von Funktionen durch ihre Integralwerte langs gewisser Mannigfaltigkeiten. Akad. Wiss. 69, 262-277 (1917).
- Radermacher, M. Radon transform techniques for alignment and three-dimensional reconstruction from random projections. Scanning Microscopy. 11, 171-177 (1997).
- Roiban, L., Sorbier, L., Pichon, C., Pham-Huu, C., Drillon, M., Ersen, O. 3D-TEM investigation of the nanostructure of a δ-Al2O3 catalyst support decorated with Pd nanoparticles. Nanoscale. 4 (3), 946-954 (2012).
- Georgescu, D., Roiban, L., Ersen, O., Ihiawakrim, D., Baia, L., Simon, S. Insights on Ag doped porous TiO2 nanostructures: a comprehensive study of their structural and morphological characteristics. RSC Adv. 2 (12), 5358 (2012).
- Shakeri, M., Roiban, L., Yazerski, V., Prieto, G., Gebbink, M. J. M. G., de Jongh, P. E., de Jong, K. P. Engineering and Sizing Nanoreactors To Confine Metal Complexes for Enhanced Catalytic Performance. ACS Catal. 4 (10), 3791-3796 (2014).
- Midgley, P. A., Weyland, M. 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).
- Ersen, O., Florea, I., Hirlimann, C., Pham-Huu, C. Exploring nanomaterials with 3D electron microscopy. Mater. Today. 18 (7), 395-408 (2015).
- Lepinay, K., Lorut, F., Pantel, R., Epicier, T. Chemical 3D tomography of 28nm high K metal gate transistor: STEM XEDS experimental method and results. Micron. 47, 43-49 (2013).
- Roiban, L., Sorbier, L., Pichon, C., Bayle-Guillemaud, P., Werckmann, J., Drillon, M., Ersen, O. Three-Dimensional Chemistry of Multiphase Nanomaterials by Energy-Filtered Transmission Electron Microscopy Tomography. Microsc. Microanal. 18 (05), 1118-1128 (2012).
- Roiban, L., Sorbier, L., Hirlimann, C., Ersen, O. 3 D Chemical Distribution of Titania-Alumina Catalyst Supports Prepared by the Swing-pH Method. ChemCatChem. 8 (9), 1651-1657 (2016).
- Egerton, R. F. Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , Springer. (2011).
- Messaoudi, C., Aschman, N., Cunha, M., Oikawa, T., Sorzano, C. O. S., Marco, S. Three-Dimensional Chemical Mapping by EFTEM-TomoJ Including Improvement of SNR by PCA and ART Reconstruction of Volume by Noise Suppression. Microscopy and Microanalysis. 19 (6), 1669-1677 (2013).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. UCSF Chimera-A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), (2004).
- Roiban, L., Ersen, O., Hirlimann, C., Drillon, M., Chaumonnot, A., Lemaitre, L., Gay, A. S., Sorbier, S. Three-Dimensional Analytical Surface Quantification of Heterogeneous Silica-Alumina Catalyst Supports. ChemCatChem. 9 (18), 3503-3512 (2017).
- EFTEM-TomoJ. , Available from: http://www.cmib.fr/en/download/softwares/EFTEM-TomoJ.html (2018).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- The IMOD Home Page. , Available from: http://bio3d.colorado.edu/imod/ (2018).
- Landini, G. Align RGB planes. ImageJ. , Available from: https://ImageJ.net/Align_RGB_planes (2018).
- Messaoudi, C. TomoJ. , Available from: http://www.cmib.fr/en/download/softwares/TomoJ.html (2018).
- MessaoudiI, C., Boudier, T., Sorzano, C., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinf. 8 (1), 288 (2007).
- Saxton, W. O., Baumeister, W., Hahn, M. Three-dimensional reconstruction of imperfect two-dimensional crystals. Ultramicroscopy. 13 (1-2), 57-70 (1984).
- Gatan, Inc. Quantum Energy Filters High Throughput Spectrometers. , Available from: http://www.gatan.com/products/tem-imaging-spectroscopy/gif-quantum-energy-filters (2018).
- Gatan, Inc. Direct Detection 16-Megapixel Camera. , Available from: http://www.gatan.com/products/tem-imaging-spectroscopy/k2-direct-detection-cameras (2018).
- Direct Electron, LP. DE-Series Cameras. , Available from: http://www.directelectron.com/products/de-series (2018).
