Summary
Cet article décrit un protocole pour réaliser des cartes 3D chimiques combinant énergie filtré d’imagerie et de la tomographie électronique. La distribution de produits chimiques de deux supports de catalyseurs, formé par les éléments qui sont difficiles à distinguer par d’autres techniques d’imagerie a été étudiée. Chaque application se compose de cartographie des éléments chimiques superposés - bords respectivement espacés-ionisation.
Abstract
Énergie filtrée transmission electron microscopy tomographie (tomographie EFTEM) peut fournir des cartes en trois dimensions (3D) chimique de matériaux à l’échelle nanométrique. Tomographie par EFTEM permet de séparer des éléments chimiques qui sont très difficiles à distinguer à l’aide d’autres techniques d’imagerie. Le protocole expérimental décrit ici montre comment créer des cartes 3D et chimiques pour comprendre la distribution de produits chimiques et de la morphologie d’un matériau. Étapes de préparation d’échantillon pour la segmentation des données sont présentées. Ce protocole permet l’analyse de la distribution 3D des éléments chimiques dans un échantillon nanométrique. Toutefois, il convient de noter qu’actuellement, les cartes 3D chimiques peuvent seulement être générés pour les échantillons qui ne sont pas sensibles, faisceau, étant donné que l’enregistrement des images filtrées exige de longs temps d’exposition à un faisceau d’électrons intense. Le protocole a été appliqué afin de quantifier la distribution de produits chimiques des composants de deux supports de différents catalyseurs hétérogènes. Dans la première étude, on a analysé la distribution de produits chimiques de l’aluminium et le titane dans les soutiens de titania-alumine. Les échantillons ont été préparés selon la méthode de swing-pH. Dans le second, la distribution de produits chimiques de l’aluminium et de silicium dans la prise en charge de silice-alumine qui ont été préparés à l’aide de la sol-poudre et les méthodes mécaniques de mélange a été examinée.
Introduction
Les propriétés de matériaux fonctionnels dépendent de leurs paramètres 3D. Pour bien comprendre leurs propriétés et améliorer leurs fonctions, il est important d’analyser leur morphologie et la distribution de produits chimiques en 3D. Electron tomography1 (HE) est l’une des meilleures techniques de fournir cette information à l’échelle nanométrique2,3. Il se compose de rotation de l’échantillon sur une grande plage angulaire et enregistrement d’une image à chaque étape angulaire. La série tilt obtenu est utilisée pour reconstruire le volume de l’échantillon en utilisant des algorithmes mathématiques basées sur la transformation de Radon4,5. Sélection de niveaux de gris dans le volume permet de modéliser l’échantillon en 3D et quantifier les paramètres 3D comme particule localisation6 et taille distribution7, pore position et taille distribution8, etc.
En général, ET est réalisée avec un microscope électronique en inclinant l’échantillon à l’angle maximal possible, de préférence plus de 70° dans les deux sens. Chaque angle d’inclinaison, une projection de l’échantillon est enregistrée en formant une série d’inclinaison des images. Cette série d’inclinaison est alignée et utilisée pour reconstruire le volume de l’échantillon qui sera segmenté et quantifiée. Parce que l’échantillon ne peut être tourné de 90 ° à + 90 °, le volume reconstruit a une résolution anisotrope le long de l' axe orthogonal9 en raison de l’angle de prise aveugle.
ET peut être effectuée dans les différents modes d’imagerie. Le mode TEM de champ lumineux (BF-TEM) est utilisé pour étudier les matériaux amorphes, les échantillons biologiques, les polymères ou catalyseur prend en charge avec des formes complexes. L’analyse d’image est basée sur la différenciation des niveaux de gris qui caractérisent la densité des composants10 (un composant dense sera plus sombre qu’un briquet, c'est-à-dire, moins dense composant). High angle rasant annulaire en mode TEM (HAADF-STEM) balayage sert à analyser des échantillons cristallins. Le signal fournit information chimique en fonction du nombre atomique ; une composante forte de l’échantillon paraîtra plus lumineuse qu’un briquet un9. Autres modes, tels que la spectroscopie x Dispersive en énergie (EDX), qui recueille les rayons x émis par la matière11et l’énergie filtré d’imagerie mode (EFTEM)12,13, sont également capables d’évaluer la distribution de produits chimiques 3D au sein de l’échantillon.
En imagerie EFTEM, les cartes 2D chimiques peuvent être enregistrées à l’aide d’un TEM avec un spectromètre à électrons énergétiques. Le spectromètre agit comme un prisme magnétique en dispersant les électrons en fonction de leur énergie. Une image est créée par les électrons selon l’énergie perdue d’interagir avec un atome spécifique. Si la même carte chimique 2D est calculée à des angles d’inclinaison différente, une inclinaison de la série de projections chimiques est obtenue, qui peut servir à reconstruire le volume 3D chimique.
Pas tous les matériaux peuvent être analysés par tomographie EFTEM. La technique est réservée aux échantillons avec des matériaux de faibles ou de troubles. Néanmoins, il peut être utilisé pour analyser des éléments légers qui sont très difficiles à différencier en utilisant d’autres techniques d’imagerie. En outre, pour obtenir des cartes chimiques 2D fiables, l’épaisseur du matériau doit être moins que le libre parcours moyen des électrons à travers la matière14. Dans ces conditions, la probabilité d’avoir un seul électron interagit avec un seul atome est le plus élevée. Deux méthodes sont utilisées pour calculer une carte chimique 2D. Le premier et le plus utilisé est la « méthode des trois-windows », où deux fenêtres énergie filtrées sont enregistrées avant le bord de l’ionisation de l’élément sous analyse et un troisième après l’ionisation bord13. Les deux premières images sont utilisées pour estimer l’arrière-plan, ce qui est extrapolé en utilisant une loi de puissance à la position de la troisième fenêtre et soustraite d’elle. L’image obtenue est la projection de la distribution 3D d’un élément chimique dans le volume de l’échantillon analysé. La deuxième méthode est appelée le « saut-ratio » ; Il utilise seulement deux images énergie filtré, un avant et un après le bord de l’ionisation. Cette méthode est qualitative, que l’image finale est calculée uniquement en effectuant le rapport entre ces deux images et ne tient pas compte de la variation d’énergie de fond.
En combinant EFTEM avec ET, la tomographie analytique de l’énergie filtré peut être obtenue. Tomographie par EFTEM et atom sonde tomographie (APT) sont des techniques complémentaires. Par rapport à APT, la tomographie EFTEM est une analyse de caractérisation non destructive ne nécessitant pas de préparation des échantillons complexes. Il peut être utilisé pour effectuer diverses caractérisations sur une NANOPARTICULE unique. Tomographie EFTEM permet d’analyser les matériaux isolants, tandis que l’APT a besoin à l’aide de laser tout le moins, de les mesurer. APT fonctionne à l’échelle atomique, tandis que la tomographie EFTEM effectue correctement avec une résolution inférieure. EFTEM la tomographie est pertinente uniquement pour les échantillons qui résistent à la dégradation de la poutre pendant l’expérience. Pour enregistrer toutes les images filtrées selon tous les angles inclinées, l’échantillon peut être exposé pour le faisceau d’électrons pour aussi longtemps que 2 h. En outre, pour enregistrer un signal chimique maximal dans les cartes 2D, les durées d’exposition plus longues à faisceau de haute intensité peuvent être nécessaires. Dans de telles conditions, les échantillons sensibles de faisceau subissent des changements morphologiques et chimiques. Par conséquent, un mesurage précis de la sensibilité de l’échantillon pour le faisceau d’électrons doit être établi avant l’expérience. En outre, la tomographie EFTEM est le résultat de l’enregistrement des tomographies autant que nécessaire pour déterminer l’emplacement dans l’espace et la nature des éléments chimiques présents dans l’échantillon. Néanmoins, la tomographie EFTEM peut fournir des informations importantes concernant la distribution de produits chimiques 3D pour les échantillons, tels que les supports de catalyseurs, de donner de nouvelles perspectives pour la modélisation de leurs applications catalytiques.
Aujourd'hui, il est possible d’utiliser un logiciel dédié qui peut choisir l’intervalle de l’énergie, enregistrement filtré images fenêtre énergie et calculer le produit chimique correspond à des angles d’inclinaison différentes. Ils permettent l’inclinaison de l’échantillon, suivi, en se concentrant et en enregistrant l’image filtrée en mode EFTEM. Les cartes chimiques 2D peuvent être calculées et puis la série d’inclinaison peut être alignée, le volume de produits chimique calculé à l’aide des algorithmes itératifs, et enfin la série peut être segmentée et quantifiés15,16.
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Protocol
1. préparation de l’échantillon
- Broyer l’échantillon dans un mortier et disperser dans l’alcool ou distillée ; Placez une goutte de l’échantillon sur une grille de microscopie et laissez-le sécher.
NOTE : Échantillons tels qu’alumine silice ou alumine titania peuvent être une poudre ou un matériau extrudé et peut être écrasés et dispersés dans une solution en utilisant des ultrasons. En général, pour l’analyse ET, il est important que la concentration de l’échantillon sur la grille est faible, afin d’éviter la superposition de l’échantillon et l’occultation en inclinant la grille aux grands angles. Les grilles de microscopie de 200 mailles qui prennent en charge un film de holey carbone ou carbone lacey sont recommandés. - À l’aide d’une pipette, mettre une goutte d’une solution colloïdale contenant des marqueurs fiducial sur l’échantillon. Absorber un excédent de solution et laisser sécher.
NOTE : Les marqueurs d’alignement sont bien calibré Au nanoparticules en suspension dans une solution. Les marqueurs d’alignement peuvent être également dispersés sur la grille avant d’ajouter l’échantillon. À titre d’exemple, si l’échantillon est composé de nanoparticules avec des tailles similaires comme les repères d’alignement, déposer les marqueurs d’alignement sur la grille afin de séparer bien au cours de la segmentation de données et de la quantification. Les marqueurs d’alignement sont des références de position utilisées lors de l’alignement des images inclinées.
2. enregistrement des Images filtrées Tilt série
- Au microscope électronique, Rechercher un exemple isolé au centre de la grille de la microscopie.
Remarque : Dans le microscope électronique, l’axe des X est le long de la porte de l’échantillon, l’axe des Y est perpendiculaire à la porte de l’échantillon et l’axe Z est le long du faisceau d’électrons. Pour être en mesure de l’échantillon, l’angle d’inclinaison maximal d’inclinaison, analyser un échantillon situé aussi près que possible de l’axe des X. - Une fois que l’échantillon est bien positionné, vérifier la composition chimique de l’échantillon. Effectuer une analyse chimique à l’aide de la spectrométrie de rayons x dispersive en énergie (EDS), ou spectrométrie de perte d’énergie électrons (EELS) en concentrant le faisceau sur l’échantillon choisi et enregistrer un spectre. Si l’échantillon contient des éléments chimiques d’intérêt, s’éloigner d’elle et exécuter les tests suivant sur un échantillon représentatif à proximité.
- Vérifiez l’électron du faisceau sur l’échantillon, la largeur des fenêtres énergie des images filtrées, intensité et le temps d’exposition de chaque filtré image. Trouver le meilleur compromis pour l’échantillon entre le dommage de la poutre et le signal chimique enregistrée dans les projections chimiques12,13,17.
Remarque : Pour enregistrer le signal chimique maximal dans les images filtrées, utiliser l’intensité du faisceau maximum. Cependant, un essai de l’irradiation doit être réalisé avant toute analyse pour vérifier les modifications apportées à l’échantillon de l’effet du faisceau d’électrons. Pour cela, calculer la dose d’électrons lors de l’enregistrement de la série d’inclinaison. En outre, un essai de facilité peut se faire en comparant une image avant et une image après l’expérience. - Le mode EFTEM du logiciel d’enregistrement permet de calculer une carte chimique 2D à l’aide de la méthode trois-windows et vérifiez si un signal chimique suffisant est enregistré.
Remarque : Le logiciel enregistre trois images filtrées ; les deux premiers servent à estimer l’arrière-plan de l’image.- Dans le logiciel, sélectionnez l’élément chimique sous enquête et son bord d’ionisation. Définissez la largeur de la fenêtre de l’énergie et le temps d’exposition. Enregistrer les images et ensuite calculer le plan chimique utilisant une loi de puissance pour extraire le fond. Dans un environnement 32 bits avec 512 x 512 pixels, le signal minimal est environ 300-400 coups par pixel dans une image chimique.
- Réglez l’angle d’inclinaison de l’échantillon à la hauteur d’eucentric et vérifiez l’angle d’inclinaison minimale, c'est-à-dire,-70 ° ou moins et maximale, c'est-à-dire, + 70 ° ou plus.
- Amener l’échantillon à doser dans vue et enregistrer une image (ce sera l’image avant acquisition). Puis enregistrez la série inclinée des images filtrées à l’aide de logiciels appropriés.
NOTE : Les plugins de tomographie EFTEM dédiés peut enregistrer plusieurs séries d’inclinaison en même temps. Cela signifie que, à chaque angle d’inclinaison, plusieurs images successives peuvent être enregistrées. La première image peut être une image filtrée centrée sur la perte de zéro et cette image est une image typique de lumineux-zone. Les images de bords avant, puis l’image de bord après le premier élément chimique sont suivis par les bords avant des images et l’image de bord après le deuxième élément chimique. La succession des éléments chimiques est donnée par leur bord ionisation sélectionnés.- Dans l’enregistrement EFTEM basculer logiciels de série, sélectionnez la largeur de chaque fenêtre d’énergie et de sa durée d’exposition, et ensuite les valeurs maximale et minimale angle d’inclinaison et l’étape angulaire de l’inclinaison. Compromis entre le nombre d’images dans cette série d’inclinaison et de la durée d’exposition totale de l’échantillon entre le faisceau d’électrons, utiliser une étape d’inclinaison de 4°, c'est-à-dire, 51 images par série d’inclinaison entre ± 71 ° ; Cependant, une plus petite étape inclinaison peut être choisie si l’échantillon ne se dégrade pas sous la poutre.
- Pour chaque élément chimique, enregistrer trois séries d’inclinaison des images filtrées pour calculer la projection chimique à l’aide de la méthode de trois fenêtres. Afin de quantifier la dérive naturelle de l’échantillon à chaque angle d’inclinaison tout en enregistrant les images filtrées (l’échantillon peut rester à certains angles d’inclinaison pendant plus de 1 min), la première image peut être une image filtrée sur signal zéro perte afin que la dernière image enregistrée sera une FINUL enregistré l’image formée par tous les électrons à toutes les énergies. Ces deux images peuvent être utilisées pour calculer le plan de l’épaisseur de l’échantillon. Par conséquent, pour l’observation de la distribution de produits chimiques de deux éléments à chaque angle d’inclinaison, enregistrer 7 images filtrées (1 zéro perte, 3 pour le premier élément chimique, 3 pour le deuxième élément chimique) et 1 image non filtré (au total, 8 séries de tilt enregistrés).
3. alignement et la Reconstruction de la série Tilt
- Aligner les trois images filtrées correspondant à chaque élément chimique pour chaque angle d’inclinaison et calculer le plan chimique à l’aide d’un plugin spécialisé de18 15,de EFTEMTJ de ImageJ. Dans le logiciel ImageJ, utilisez le chemin d’accès fichier | Ouvrir et sélectionnez les fichiers correspondant aux images filtre série tilt. Ouvrez les trois séries d’inclinaison filtrée : deux bord avant et une extrémité postérieure.
- Ouvrez le plugin EFTEMTJ dédié. Cliquez sur + | Image ou pile et sélectionnez la série tilt qui est déjà ouverte.
- Dans le tableau qui s’affiche, remplissez le changement d’énergie pour chaque série d’inclinaison, c'est-à-direl’énergie au cours de laquelle chaque série d’inclinaison a été enregistré. En outre, remplir la largeur de la fente, c'est-à-dire, les fenêtres de l’énergie. Remplir le « Temps d’exposition » de chaque image filtrée. Recherchez toutes les séries de trois tilt Mapping. Cliquez sur suivant.
- A choisi la première image comme l’image de référence puis cliquez sur appliquer. Cliquez sur suivante: une image d’aperçu du tracé proposé apparaît. Vérifier visuellement que les 3 images enregistrées sous le même angle d’inclinaison sont bien superposées (aucun décalage entre les images ne devrait être observé).
Remarque : Ce protocole a été réalisé sur la version 0.9 du plugin EFTEMTJ. En ce moment, les images filtrées enregistrement at le même angle d’inclinaison sont alignés. - Sélectionnez dans la fenêtre EFTEMTJ, les images correspondant à l' arrière-plan et du chimique Edge. Sélectionnez le modèle de l’extraction du signal comme puissanceet puis cliquez sur créer carte. ImageJ, sélectionnez fichier | Enregistrer et trouver le chemin pour sauver ce dernier fichier.
NOTE : La série de l’inclinaison de la carte chimique est obtenue. Plus d’informations sur la façon d’utiliser le plugin sont disponibles en ligne. - Répétez l’étape 3.1 pour toutes les séries chimiques tilt.
- Aligner la série tilt perte de zéro en utilisant une version du logiciel Imod19 sorti en 2009 pour harmoniser l’inclinaison de la série. Le logiciel permet à l’application des alignements calculés sur une série d’inclinaison pour une autre série d’inclinaison.
Remarque : Le logiciel d’alignement écrit sur les fichiers de disque contenant tous les déplacements appliqués à chaque image. La procédure d’alignement à l’aide de Imod20 est revue ailleurs et n’est pas dans le champ d’application du présent article. - Utiliser l’alignement calculée pour la série zéro perte tilt et l’appliquer à la série tilt chimiques précédemment calculée.
Remarque : Dans cette version du logiciel, il est possible de modifier le fichier inclinaison zéro perte de série avec un fichier de série chimique tilt en conservant le nom du fichier et en appliquant les précédents déplacements calculés. Sinon, pour le logiciel, le fichier aura le même nom, le même nombre d’images de même taille, mais il ne contiendra pas zéro images perte mais des images chimiques. - Quantifier la dérive de croix corrélant la première image enregistrée, c'est-à-dire, Centre sur la perte de zéro et le dernier (l’image non filtrée). L’échantillon peut passer plusieurs secondes à chaque angle d’inclinaison tandis que toutes les images filtrées sont enregistrées. Pendant ce temps, l’échantillon dérive naturellement une petite quantité.
- Sur les logiciels ImageJ, cliquez sur fichier | Ouvrez et sélectionnez alignée la zéro perte d’inclinaison série, puis ouvrir le produit chimique cartes alignées inclinaison série.
- Cliquez sur Edition | Couleur | Canaux de fusion. Sélectionnez le fichier correspondant à aucune perte pour la couleur rouge, le premier élément chimique pour le vert et le deuxième élément chimique pour le bleu, dans cet ordre. Décochez la case Créer des composites et vérifier Garder Source Image. Une pile est créée à chaque angles d’inclinaison pour toutes les images enregistrées.
- Cliquez sur Plugins | Aligner les plans RGB21. Le rouge est l’image de référence. Sélectionnez vert et en utilisant les flèches, il se chevauchent sur le rouge. Cliquez sur suivant et répétez pour tous les angles.
- Cliquez sur Edition | Couleur | Canaux Split et la pile de RVB sera scindée en trois piles : rouge correspondant à aucune perte et vert et bleu correspondant aux cartes chimiques avec la dérive corrigée. Cliquez sur fichier de | Enregistrer pour sauver la série tilt.
- Cliquez sur Plugins | Tomoj22,23 pour sélectionner le fichier de formulaire charge angle. Parce que toutes les séries d’inclinaison sont déjà alignés, accédez directement à la Reconstruction. Calculer le volume de perte de zéro, ainsi que les volumes produits chimiques, en utilisant des algorithmes de reconstruction comme ART, SIRT, OS-ART, etc..
Remarque : Il est recommandé d’utiliser un algorithme itératif pour la reconstruction des volumes chimiques. En utilisant ce logiciel, il est possible de reconstituer les volumes à l’aide du GPU. - Une fois que tous les volumes sont calculés, utilisez l’option de Fusion canaux d’appliquer différentes couleurs aux volumes obtenus et recouvrir ceux-ci en un seul volume, pour obtenir la carte 3D de produits chimique.
4. quantification et modélisation 3D
- Binarize le volume de ZL reconstitué en sélectionnant le niveau de gris correspondant, qui sera le volume obtenu en blanc (in 8 bit, l’intensité est 255) et noir (en 8 bits, l’intensité est 0). Dans ImageJ, utilisez l’option « Sélectionner seuil ». Sélectionnez tous les pixels correspondant à l’échantillon (dans une image BF, les pixels plus foncés correspondent à l’échantillon de masse) et faire un volume où l’échantillon est blanc et le vide est noir.
Remarque : Le volume de perte zéro fournit l’information morphologique de l’échantillon analysé, c'est-à-dire, la forme et la taille de l’échantillon. - Divisez le volume binaire de zéro perte par 255 et obtenir un volume où les intensités à l’intérieur de l’échantillon sont 1 et ailleurs sont 0. C’est le volume normalisé.
- Multipliez le volume normalisé par chacun des volumes chimiques calculées (étape 4.1) afin d’obtenir un volume où les intensités à l’intérieur de l’échantillon correspondant à l’information chimique, et ces intensités sont 0 ailleurs.
NOTE : L’information chimique est dérivée de l’échantillon et par conséquent, tous les artefacts sont exclues. - Dans ImageJ, calculer l’histogramme du volume chimique et importer les valeurs de l’histogramme dans un logiciel tabulé.
- Dans le logiciel tabulé, supprimez la ligne avec un nombre de Hold-up d’intensité de 0 (cette ligne correspond au vide).
- Dans une nouvelle colonne, calculer la proportion de chaque intensité du volume. Séparer le nombre de chaque intensité par la somme de tous les chefs d’accusation et le multiplier par 100.
- Dans une nouvelle colonne, calculer le pourcentage correspondant à l’intensité du volume total en ajoutant progressivement la proportion actuelle des comtes, calculé précédemment avec la proportion précédente.
Remarque : Dans les volumes de produits chimiques, les intensités élevées correspondent à l’information chimique. Toutefois, les intensités sont basses et le bruit du volume élevé. Le seuil est créé en sélectionnant les intensités plus élevées. - Connaissant la concentration relative d’un élément chimique de l’échantillon calculé à partir du spectre d’anguilles, sélectionnez les intensités de heist. Démarrer à partir de 255 (si existant) et diminuer l’intensité correspondant à la concentration de l’élément chimique.
- Pour trouver l’intensité la plus faible correspondant à la concentration chimique, accédez à la colonne où la proportion d’intensité correspondante a été calculée dans le volume total, le 100 % correspond normalement à l’intensité de 255. À partir de 100 %, extrayez la proportion relative calculée d’un élément chimique (à partir de l’éventail des anguilles) : le résultat correspondra à l’intensité minimale du seuil. De cette façon, volumes binarisées chimiques sont obtenus, où les voxels correspondent à l’élément chimique avec l’intensité de 255, et tout le reste est 0. Répétez l’opération pour le second élément et obtenir deux volumes binarisées chimiques.
- Se chevauchent les binarisées volumes chimiques à l’aide de l’option Merge Channels et attribuer une couleur différente à chaque volume de l’élément pour transformer un volume de RVB.
Remarque : En superposant les deux volumes binarisées chimiques, voxels qui se superposent, qui appartiennent à ces deux éléments chimiques (commune de voxels) et voxels qui n’appartiennent pas à l’un des éléments chimiques (voxels libre) sont mises en évidence. Par exemple, les volumes binarisées chimiques du rouge et du vert créent des voxels commune qui sont jaunes. - Transformer le volume RVB 8 bits volume ; les couleurs auront différentes intensités de gris. À l’aide de l’option seuil, sélectionnez les voxels qui appartiennent à deux espèces chimiques (jaunes dans le volume de RVB). Puis, à l’aide de l’option seuil même, sélectionnez les voxels qui n’appartiennent pas à n’importe quel élément chimique (ils ont des intensités plus faibles que les voxels précédemment délimité). Ne sélectionnez pas le vide avec une intensité 0.
- Normaliser les volumes de la commune de voxels et le volume de la voxels gratuit. Multipliez les volumes de la voxels gratuit par les volumes de produits chimiques, puis soustraire l’autre volume chimique.
NOTE : Calcule l’élément chimique dans chaque voxel qui a la plus haute intensité. - Ajouter les volumes de la voxels qui appartiennent et les voxels qui n’appartiennent pas au volume d’un élément chimique qui a la plus haute intensité dans les voxels.
Remarque : De cette façon, chaque voxel commune ou voxel gratuit est différenciée et attribuée au volume d’un élément chimique qui a la plus haute intensité dans ce voxel. Cela peut être effectuée par l’option « Calculatrice d’Image » :
- Afin de quantifier le nombre de voxels constituant l’échantillon, importer les volumes segmentés dans les logiciels de rendu de surface spécialisé, comme un segment 3D. Puis, multiplier le volume d’un voxel en nm3 pour obtenir le volume de l’échantillon en 3D.
- Avec l’option Bords trouver , quantifier les voxels formant la surface de l’échantillon et multiplier par la zone voxel nm2 pour obtenir la surface de l’échantillon.
- Calculer la surface spécifique en divisant la surface de l’échantillon par la masse de l’échantillon.
Remarque : On peut estimer la masse de l’échantillon, en utilisant la densité théorique de l’échantillon. En général, la surface spécifique calculée par ET est 10 moins de la surface spécifique calculée par des méthodes dédiés comme N2 adsorption la désorption. - Pour calculer la répartition porométrique, utiliser le volume binarisée de zéro la perte (le volume de la BF). Le volume binaire de la reconstruction de la BF est dilaté à l’aide de la 3D Toolkit/morphologiques se dilatent plugin 3D jusqu'à ce que tous les pores sont couverts et puis érodés à l’aide de la boîte à outils/morphologique 3D éroder 3D comme autant de fois que dilatée. Ensuite, le volume obtenu est multiplié par le volume inversé du volume binarisée BF, se traduire par le volume de distribution des pores qui peut être visualisé à l’aide d’un logiciel de rendu de surface dédiés.
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Representative Results
Un exemple de l’application du présent protocole est indiqué dans la référence13. Tomographie par EFTEM a été utilisé pour l’analyse de supports de catalyseurs alumine titania. Afin d’améliorer l’activité catalytique de la phase active de nanoparticules de2 MoS, dans des applications telles l’hydrodésulfuration (HDS), il est important que titania est prépondérant à la surface d’appui et par contact avec la phase active. On sait que titania a une plus petite surface spécifique que l’alumine. L’étude vise à construire titania pris en charge par l’alumine (et donc de créer une surface spécifique renforcée), puis de le tester comme un support de catalyseur. Ici, la tomographie EFTEM est utilisée pour analyser des support de catalyseur hétérogène de titania-alumine préparé par la méthode pH de swing. Dans cette étude, trois échantillons de différentes concentrations de titania sont analysées. Échantillon 1 est composé d’alumine de 50 % et 50 % titania, 2 de l’échantillon est composé d’alumine de 70 % et 30 % dioxyde de titane et 3 de l’échantillon est composé d’alumine de 90 % et 10 % titania. Figure 1 a–1C, figurent les sections efficaces des cartes chimiques parallèles au plan XY. Vert représente la distribution spatiale chimique de titania, rouge représente la distribution de l’alumine et bleu représente le vide. Les volumes de produits chimiques sont calculées à partir de la série tilt avec la méthode de trois fenêtres. Les fenêtres énergie filtré étaient comme suit : 10 eV large, centrée à 59 et 70 81 eV, avoir un temps d’exposition de 3 s pour le bord de23 Al L situé à 73 et 30 eV large, centrée à 415 et 445 482 eV, ayant une durée d’enregistrement de 15 s pour le Ti Bord de23 L situé à 455 eV. La position et la largeur, ainsi que la durée d’exposition des images filtrées ont été choisie afin d’obtenir une carte chimique avec un signal chimique détectable. La série d’inclinaison ont été enregistrée entre-71 et 71 ° avec une majoration de 4 ° dans mode24 à environ 119 min du Saxton.
Il a été constaté que titania à une concentration élevée est formant des grappes qui sont incorporés dans l’alumine. Les modèles sont affichés dans la Figure 1 d (exemple 1), 1e (exemple 2) et 1f (exemple 3). Dans les modèles, le titania s’affiche en bleu et l’alumine est affiché en rouge transparent. Ces modèles ont été quantifiés à l’aide de la distribution de produits chimiques de titania et d’alumine sur la surface des échantillons. Il a été constaté qu’indépendamment de la proportion de titania et d’alumine dans l’échantillon, la surface de l’échantillon est couverte de titania dans une proportion de 30 %. Toutefois, la surface spécifique de l’échantillon augmente, alors que la proportion de titania diminue pour atteindre la surface spécifique de l’alumine. Pour 3 échantillon contenant seulement 10 % titania, une couche d’environ 10 nm d’épaisseur se forme sur la surface de l’échantillon. Aussi, le plan chimique est formé par la superposition de trois volumes : silice en rouge, dioxyde de titane en vert et aucune perte en bleu. Le mélange entre le rouge et le vert sont des voxels jaunes. Les voxels jaunes sont attribués dans le modèle à l’élément ayant la plus haute intensité dans ce voxel. Il s’agit d’une limitation dans la résolution spatiale des cartes 3D de produits chimiques, qui est directement liée à la résolution anisotrope ET et la résolution des cartes chimiques 2D fournis par EFTEM. L’analyse est en corrélation avec d’autres techniques analytiques comme la fluorescence des rayons x, spectroscopie photoélectronique des rayons x et N2 porosimétrie. Il a été conclu que la différence entre les surfaces spécifiques pourrait jouer un rôle dans les applications catalytiques.
Comme deuxième exemple, l’étude détaillée dans17 s’affiche. Dans cette étude, nous avons analysé une série de supports de catalyseurs silice alumine. Ces supports de catalyseurs ont une acidité fournie par le mélange entre l’alumine et de silice, formant un aluminosilicate. L’étude visait à quantifier le mélange entre les deux composantes. Le défi expérimental a menti dans le fait que les bords de23 L d’Al et Si sont très proches, à 73 et eV 99 respectivement, et le bord de l’ionisation de Al chevauche le bord d’ionisation du Si. Dans ces conditions, la méthode de trois fenêtres est moins précise permettant d’extraire le signal chimique. Afin de différencier les deux signaux de Al et Si, la méthode de « R-ratio » a été développée, décrites en détail dans la référence12. Les images filtrées tilt series ont été enregistrées en inclinant l’exemple de formulaire-71 ° à 71 ° avec un pas d’incrémentation de 4 ° en mode de la Saxton à environ 83-104 min. Trois images filtrées ont été enregistrés pour isoler le signal du bord L23 ionisation de TR. Les images ont été centrées à eV 59 et 70 eV eV 81, étaient 10 eV large et exposée pendant 5 s. Pour le signal correspondant à la limite de23 L d’Al, seulement deux images filtrées ont été enregistrées, centrée à 99 et 110 eV, eV 10 larges et exposée pour 12 s.
Dans cette étude, nous avons analysé une série de quatre échantillons de Al et Si préparé par différentes méthodes. Figure 2 a est une coupe parallèle au plan XY carte chimique et le modèle de l’échantillon préparé par la méthode sol-poudre. Cet échantillon a été thermiquement traité sous pression, produisant le second échantillon, dont carte chimique et le modèle sont affichés dans la Figure 2 b. C de la figure 2 montre les cartes chimiques de l’échantillon préparé par mélange mécanique. De cet échantillon, après un traitement thermique à la vapeur chaude, nous avons obtenu le quatrième exemple, illustré à la Figure 2d. Le produit chimique cartes et modèles pour l’alumine sont rouges et de silice sont verts, tandis que le bleu renforcé représente la limite à la surface entre la silice et d’alumine. L’activité catalytique acide est donnée par le mélange entre l’alumine et de silice sur la surface de l’échantillon. Il se trouve qu’indépendamment de la méthode de préparation, la silice couvre seulement 30 % de la surface de l’échantillon. Après le traitement thermique, la distribution de produits chimiques est plus homogène, et la surface est couverte de 50 % de silice et d’alumine de 50 %. La méthode sol-poudre fournit des échantillons avec une grande homogénéité entre les composantes comparé avec le mélange mécanique. Petits domaines de silice incorporés dans l’alumine sont présents dans l’échantillon. Pour l’échantillon préparé par mélange mécanique, silice constitue le noyau de l’échantillon et alumine est présent sous forme d’une coquille. Comme une caractéristique générale des deux échantillons qui ne sont pas traitées thermiquement, la silice se trouve dans le centre et l’alumine se trouve sur la surface.
La densité de l’acide site fournie par la phase d’aluminosilicates formée par le mélange intime entre la silice et d’alumine, création de sites acides de Brønsted à sa surface, est mesurée en unités arbitraires (a.u.)/m2 par adsorption de CO. La quantification de la frontière entre la silice et d’alumine a été réalisée à2m/g ou m/m, qui sont connus des unités physiques. Bien sûr, l’interface entre la silice et d’alumine pourrait être plus épais, mais la résolution spatiale atteinte ne permettait pas le calcul d’une valeur exacte de la largeur correspondante. Cependant, cette étude ouvre la voie à une meilleure compréhension de l’interface entre la silice et d’alumine.
Figure 1 : coupes et modèles reconstruits des échantillons de titania et d’alumine. Les sections efficaces par le biais de la carte chimique en parallèle au plan XY, où sont représentées les distributions chimiques titania (en vert), alumine (en rouge) et le vide (en bleu) : (a) Sample 1, alumine 50 % et 50 % titania, (b) exemple 2, 70 % alumine et 30 % dioxyde de titane et alumine (c) échantillon 3, 90 % et 10 % titania. (d) (e) et (f) affiche les modèles d’échantillon 1, exemple 2 et 3 de l’échantillon, respectivement, titania en bleu et alumine en rouge transparent. Dans l’exemple 1 et exemple 2, l’alumine incorpore le titania. Dans l’exemple 3, une fine couche de 10 nm de titania est formée sur la surface de l’échantillon. Ce chiffre a été modifié par Roiban et al. 13 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : coupes et modèles reconstruits des échantillons de silice et d’alumine. Sur la gauche sont des coupes transversales parallèle au plan XY dans les volumes de produits chimiques, sur la droite sont les modèles reconstituées. Alumine est indiqué en rouge, la silice en vert et la limite entre la surface de la silice et d’alumine sont indiqués en bleu. Dans ces modèles, la limite est artificiellement dilatée par une sphère voxel-4 pour le rendre visible. (a) l’échantillon préparé par la méthode sol-poudre, (b) l’échantillon préparé par la méthode sol-poudre et traité thermiquement, (c) l’échantillon préparé par la méthode de mélange mécanique et (d) l’échantillon préparé par le méthode de mélange mécanique et traités thermiquement. Ce chiffre a été modifié par Roiban et al. 17 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le but de cet article est de décrire comment se procurer des cartes 3D chimiques en utilisant la tomographie EFTEM. Ce protocole est tout à fait original et a été développé par les auteurs.
Tomographie EFTEM tel que décrit ici a plusieurs inconvénients : échantillons de (i) seulement électron faisceau résistante peuvent être analysées, en raison du long temps de pose nécessaire à l’obtention des images filtrées. (ii) EFTEM la tomographie est sensible aux contrastes diffraction. (iii) un grand nombre des alignements ont été effectuées manuellement. Pour obtenir la carte 3D de produits chimique, le volume de perte de zéro et les volumes de produits chimiques doivent être dans un seul système de coordonnées. Cela nécessite que toutes les séries d’inclinaison être parfaitement alignés dans le même système de coordonnées. Il s’agit d’une période de travail longue d’au moins deux semaines par exemple. Bien qu’il soit de votre temps, ce protocole permet le calcul des cartes chimiques en 3D avec une résolution nanométrique. En outre, combiné avec d’autres techniques spectroscopiques et analytiques telles que, la fluorescence de rayons x, la spectroscopie photoélectronique des rayons x, spectroscopie FTIR ou RMN magie-angle-tournant (MAS), une description complète d’un matériau fonctionnel peut être créé.
L’intensité de faisceau d’électrons est généralement contrôlée par condensation le faisceau d’électrons. La largeur de la fenêtre de l’énergie à travers lequel les images filtrées sont enregistrées, et leur temps d’exposition aura une influence sur l’intensité du signal chimique enregistrée dans chaque projection chimique, qui servira de projections inclinées pour reconstruire le volume de produits chimique. La durée d’exposition des images filtrées influencera la durée d’exposition totale de l’échantillon sous un faisceau d’électrons intense lors de l’enregistrement de la série d’inclinaison. Si un échantillon reste trop longtemps sous la poutre, il peut souffrir des modifications drastiques. La largeur des fenêtres énergie influence le rapprochement de fond en utilisant une loi de puissance pour extraire le signal chimique de l’image filtrée après edge à l’aide de la méthode trois-windows.
Étant donné que c’est une technique difficile et chronophage, tomographie EFTEM n’est pas pratique pour la mise en œuvre de grande échelle. Toutefois, des améliorations techniques nouvelles telles que le développement des plus sensibles spectromètres25 et enregistrement rapide caméras26,27 (la liste de références de caméras est une liste partielle) permettra de réduire le temps total d’enregistrement de l’inclinaison série et permettra d’améliorer la résolution énergique des cartes chimiques. Comme mentionné précédemment, bon nombre des alignements sont manuelles, de l’extraction du signal et le calcul des projections chimiques à l’alignement de toutes les projections sur la même référence. Le développement de procédures automatiques créera une utilisation plus générale de la tomographie par EFTEM en analyse de routine.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants au Ministère Français de l’enseignement supérieur et de la recherche, Conventions Industrielles de Formation par la Recherche (CIFRE) et IFP Energies Nouvelles pour leur soutien financier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JEOL 2100f | JEOL | Electron microscope | |
| Tridiem Gatan Imaging Filter (GIF) | Gatan | Post colum energy filter | |
| Digital micrograph | Gatan | Software | |
| Gatan EFTEM tomography plugin | Gatan | Dedicated software to record filtered tilt series for EFTEM tomograohy | |
| Tomoj | Imagej plugin http://www.cmib.fr/en/download/softwares/ | Free software developed by Currie Institute in Paris, France for electron tomography | |
| EFTEM-Tomoj | Imagej plugin http://www.cmib.fr/en/download/softwares/ | Free software developed by Currie Institute in Paris, France , for EFTEM imaging | |
| Imod | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | Free software developed by University of Colorado, USA for electron tomography | |
| Imagej | https://imagej.nih.gov/ij/ | Free software developed by National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA for images treatment | |
| Merge channels | https://imagej.net/Color_Image_Processing | Fonction in Imagej allowing to give different colors to volumes while they are overlapped | |
| 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Free software developed by a large consortium lead by Ron Kikinis , Harvard Medical School, Boston, MA, SUA | |
| Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | Free software developed by the Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics at the University of California, San Francisco,for data segmentation, cuatification and visualisation of 3D models | |
| silica alumina support of catalyst | IFPEN | sample prepared for eleboration of this protocol | |
| titania alumina support of catalyst | IFPEN | sample prepared for eleboration of this protocol | |
| alcohol | |||
| water | |||
| Au nanoparticles of 5 nm | BBI Solutions | ||
| Holey carbn film 200 mesh microscopy grid | Agar | ||
| EDX sepctrometer | Oxford Instruments |
References
- Frank, J. Electron Tomography - Methods for Three-Dimensional Visualization of Structures in the Cell. , Springer-Verlag. New York. (2006).
- Midgley, P. A., Dunin-Borkowski, R. E. Electron tomography and holography in materials science. Nat. Mater. 8, 271-280 (2009).
- Carenco, S. The core contribution of transmission electron microscopy to functional nanomaterials engineering. Nanoscale. 8 (3), 1260-1279 (2016).
- Radon, J. Uber die Bestimmung von Funktionen durch ihre Integralwerte langs gewisser Mannigfaltigkeiten. Akad. Wiss. 69, 262-277 (1917).
- Radermacher, M. Radon transform techniques for alignment and three-dimensional reconstruction from random projections. Scanning Microscopy. 11, 171-177 (1997).
- Roiban, L., Sorbier, L., Pichon, C., Pham-Huu, C., Drillon, M., Ersen, O. 3D-TEM investigation of the nanostructure of a δ-Al2O3 catalyst support decorated with Pd nanoparticles. Nanoscale. 4 (3), 946-954 (2012).
- Georgescu, D., Roiban, L., Ersen, O., Ihiawakrim, D., Baia, L., Simon, S. Insights on Ag doped porous TiO2 nanostructures: a comprehensive study of their structural and morphological characteristics. RSC Adv. 2 (12), 5358 (2012).
- Shakeri, M., Roiban, L., Yazerski, V., Prieto, G., Gebbink, M. J. M. G., de Jongh, P. E., de Jong, K. P. Engineering and Sizing Nanoreactors To Confine Metal Complexes for Enhanced Catalytic Performance. ACS Catal. 4 (10), 3791-3796 (2014).
- Midgley, P. A., Weyland, M. 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).
- Ersen, O., Florea, I., Hirlimann, C., Pham-Huu, C. Exploring nanomaterials with 3D electron microscopy. Mater. Today. 18 (7), 395-408 (2015).
- Lepinay, K., Lorut, F., Pantel, R., Epicier, T. Chemical 3D tomography of 28nm high K metal gate transistor: STEM XEDS experimental method and results. Micron. 47, 43-49 (2013).
- Roiban, L., Sorbier, L., Pichon, C., Bayle-Guillemaud, P., Werckmann, J., Drillon, M., Ersen, O. Three-Dimensional Chemistry of Multiphase Nanomaterials by Energy-Filtered Transmission Electron Microscopy Tomography. Microsc. Microanal. 18 (05), 1118-1128 (2012).
- Roiban, L., Sorbier, L., Hirlimann, C., Ersen, O. 3 D Chemical Distribution of Titania-Alumina Catalyst Supports Prepared by the Swing-pH Method. ChemCatChem. 8 (9), 1651-1657 (2016).
- Egerton, R. F. Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , Springer. (2011).
- Messaoudi, C., Aschman, N., Cunha, M., Oikawa, T., Sorzano, C. O. S., Marco, S. Three-Dimensional Chemical Mapping by EFTEM-TomoJ Including Improvement of SNR by PCA and ART Reconstruction of Volume by Noise Suppression. Microscopy and Microanalysis. 19 (6), 1669-1677 (2013).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. UCSF Chimera-A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), (2004).
- Roiban, L., Ersen, O., Hirlimann, C., Drillon, M., Chaumonnot, A., Lemaitre, L., Gay, A. S., Sorbier, S. Three-Dimensional Analytical Surface Quantification of Heterogeneous Silica-Alumina Catalyst Supports. ChemCatChem. 9 (18), 3503-3512 (2017).
- EFTEM-TomoJ. , Available from: http://www.cmib.fr/en/download/softwares/EFTEM-TomoJ.html (2018).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- The IMOD Home Page. , Available from: http://bio3d.colorado.edu/imod/ (2018).
- Landini, G. Align RGB planes. ImageJ. , Available from: https://ImageJ.net/Align_RGB_planes (2018).
- Messaoudi, C. TomoJ. , Available from: http://www.cmib.fr/en/download/softwares/TomoJ.html (2018).
- MessaoudiI, C., Boudier, T., Sorzano, C., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinf. 8 (1), 288 (2007).
- Saxton, W. O., Baumeister, W., Hahn, M. Three-dimensional reconstruction of imperfect two-dimensional crystals. Ultramicroscopy. 13 (1-2), 57-70 (1984).
- Gatan, Inc. Quantum Energy Filters High Throughput Spectrometers. , Available from: http://www.gatan.com/products/tem-imaging-spectroscopy/gif-quantum-energy-filters (2018).
- Gatan, Inc. Direct Detection 16-Megapixel Camera. , Available from: http://www.gatan.com/products/tem-imaging-spectroscopy/k2-direct-detection-cameras (2018).
- Direct Electron, LP. DE-Series Cameras. , Available from: http://www.directelectron.com/products/de-series (2018).
