Summary
Die Inzidenz der Adipositas steigt und erhöht das Risiko von chronischen Lungenerkrankungen. Die zugrunde liegenden Mechanismen und Präventionsstrategien, wohldefinierte Tier sind Modelle erforderlich. Hier bieten wir drei Methoden (Glukose-Toleranz-Test, Body-Plethysmographie und Lunge Fixierung), um die Wirkung der Fettleibigkeit auf die pulmonale Ergebnisse bei Mäusen untersuchen.
Abstract
Adipositas und Erkrankungen der Atemwege sind große gesundheitliche Probleme. Adipositas ist mit einer erwarteten Zahl von mehr als 1 Milliarde übergewichtige Personen weltweit bis 2030, stellvertretend für eine zunehmende sozioökonomische Belastung einer aufstrebenden Epidemie. Gleichzeitig sind Adipositas verbundenen Komorbiditäten, einschließlich Diabetes sowie Herz- und chronische Lungenerkrankungen, kontinuierlich auf dem Vormarsch. Übergewicht mit einem erhöhten Risiko für Asthma-Exazerbationen in Verbindung gebracht hat, zwar Verschlechterung der respiratorischen Symptomen und mangelhafte Kontrollen, die funktionale Rolle der Fettleibigkeit und gestörten Stoffwechsel in der Pathogenese der chronischen Lungenerkrankungen oft unterschätzt, und zugrunde liegenden molekulare Mechanismen bleiben schwer. Dieser Artikel zielt darauf ab, Methoden zur Beurteilung der Wirkung von Fettleibigkeit auf Stoffwechsel, sowie Lunge Struktur und Funktion zu präsentieren. Hier beschreiben wir drei Techniken für Mäuse-Studien: (1) Beurteilung der intraperitonealen Glukosetoleranz (IpGTT) analysieren die Auswirkungen der Fettleibigkeit auf Glukose-Stoffwechsel; (2) Messung des Atemwegswiderstandes (Res) und Atemwege Compliance (Cdyn) zu analysieren, die Wirkung der Fettleibigkeit auf die Lungenfunktion; und (3) Vorbereitung und Fixierung der Lunge für anschließende quantitative histologische Bewertung. Adipositas Lungenerkrankungen sind wahrscheinlich multifaktoriell, aus systemische entzündliche und metabolische Dysregulation, die Lungenfunktion und das Ansprechen auf die Therapie möglicherweise negativ beeinflussen. Daher unbedingt eine standardisierte Methode zur molekularen Mechanismen und die Wirkung von neuartigen Behandlungen zu studieren.
Introduction
Laut der Weltgesundheitsorganisation (WHO) im Jahr 2008, waren mehr als 1,4 Milliarden Erwachsene, im Alter von 20 und älter, Übergewicht mit einem Body mass Index (BMI) größer als oder gleich 25; Weitere, mehr als 200 Millionen Männer und fast 300 Millionen Frauen waren übergewichtig (BMI≥30)1. Adipositas und metabolisches Syndrom sind Hauptrisikofaktoren für eine Vielzahl von Krankheiten. Bei der Adipositas und damit einhergehenden erhöhten weißen Fettgewebe Masse eng verknüpft wurde um 2 Diabetes2,3, Herz-Kreislauf Erkrankungen, wie koronare Herzkrankheit (KHK), Herzinsuffizienz (HF), Vorhofflimmern4 geben und Arthrose5, ihre funktionelle Rolle in der Pathogenese der Erkrankungen der Atemwege bleiben schlecht verstanden. Epidemiologische Studien haben jedoch gezeigt, dass Übergewicht stark verbunden mit chronischen Atemwegserkrankungen ist, einschließlich exertional Dyspnoe, obstruktive Schlafapnoe-Syndrom (OSAS), Adipositas Hypoventilation Syndrom (OHS), chronische obstruktive Lungenerkrankung (COPD), Lungenembolie, Aspirationspneumonie und Asthma bronchiale6,7,8,9. Mögliche Mechanismen Verknüpfung von Fettleibigkeit und gestörten Stoffwechsel, z.B., Insulinresistenz und Typ-II-Diabetes, zur Pathogenese der chronischen Lungenerkrankungen umfassen nicht nur mechanische und physikalische Konsequenzen des Gewichts zu gewinnen sondern auch über be-und Entlüftung induzieren Sie eine chronische subakute entzündliche Zustand10,11. Der Anstieg von Adipositas und Lungenerkrankungen während des letzten Jahrzehnts, gekoppelt mit dem Mangel an wirksame Präventionsstrategien und Therapieansätze, betont die Notwendigkeit, untersuchen die molekularen Mechanismen zu definieren, neue Wege zur Verwaltung von Adipositas Lunge Krankheiten.
Hier beschreiben wir drei standard-Tests, die wichtige Grundlagen, Adipositas und ihre Auswirkungen auf Lunge Struktur und Funktion in Mausmodellen zu untersuchen sind: (1) intraperitoneal Glukose Toleranz (IpGTT) (2) Messung des Atemwegswiderstandes (Res) und der Atemwege System-Compliance (Cdyn); und (3) Vorbereitung und Fixierung der Lunge für anschließende quantitative histologische Bewertung. Die IpGTT ist eine robuste Screening-Test Maßnahme Glukoseaufnahme, und damit die Wirkung von Adipositas auf den Stoffwechsel. Die Einfachheit der Methode ermöglicht gute Standardisierung und damit die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen den Labors. Ausgefeiltere Methoden, z. B. hyperglykämischen Klemmen oder Studien auf isolierte Inseln können für eine detaillierte Analyse der metabolischen Phänotyp12verwendet werden. Hier bewerten wir Glukosetoleranz um eine Adipositas-assoziierten Staat der systemischen und metabolische Störung als Grundlage für weitere Studien auf eine pulmonale Ergebnis zu definieren. Um die Auswirkungen von Übergewicht und Stoffwechselstörungen auf die Lungenfunktion zu beurteilen, haben wir Atemwegswiderstand (Res) und Atemwege Compliance (Cdyn) gemessen. Zur Charakterisierung von Lungenerkrankungen stehen hemmungslose sowie zurückhaltende Methoden zur Bewertung der Lungenfunktion. Hemmungslose Plethysmographie im frei beweglichen Tieren ahmt einen natürlichen Zustand, Atemmuster widerspiegelt; im Gegensatz dazu sind invasive Methoden, wie Eingangs-Impedanz-Messung von Res und cDyn in tief narkotisierten Mäuse dynamische Lungenmechanik bewerten genauer13. Da chronische Atemwegserkrankungen durch histologischen Veränderungen des Lungengewebes übernommen werden, droht richtige Lunge Fixierung zur weiteren Analyse. Die Wahl der Methode der Gewebe Fixierung und Vorbereitung hängt das Fach der Lunge die, beispielsweise untersucht werden Durchführung der Atemwege oder Lunge Parenchym14. Hier beschreiben wir eine Methode, die qualitative und quantitative Bewertung der Durchführung von Fluglinien, die Auswirkungen der Fettleibigkeit auf Asthma Entwicklung zu studieren zu können.
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Protocol
Alle tierische Verfahren wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Protokollen, die von lokalen Behörden genehmigt (Land NRW, AZ: 2012.A424), und wurden im Einklang mit dem deutschen Tierschutzgesetz und die Vorschriften über das Wohlergehen der Tiere für Experimente oder für andere wissenschaftliche Zwecke. Da Lunge Funktionsanalyse Lunge Struktur beeinflussen kann und deshalb nachfolgende histologische analysiert, sollte die Messung der Res Cdyn und die Vorbereitung und Fixierung der Lunge für Histomorphometrie bei verschiedenen Tieren durchgeführt werden. Messung von Res und Cdyn nach IpGTT ist jedoch möglich. Da Stress während der IpGTT stören könnten die Narkose benötigt für die Lungenfunktion tests, eine Erholungszeit von ca. 2 Wochen nach IpGTT empfiehlt sich die Mäuse von Körper-Gewicht-Verlust erholen können und Veränderungen in Blut Parameter12.
1. Vorbereitung für intraperitoneale Glucose-Toleranz-Test (IpGTT)
Hinweis: Nach 12 h Fasten, die komplette IpGTT dauert ca. 2 h.
- Da Stress Blutzucker maßgeblich beeinflusst, sicherzustellen Sie, dass beide Adaption von Mäusen sowie Ausbildung des Wissenschaftlers, durchgeführt.
- Übertragen Sie die Tiere auf der Versuchsfläche unter ruhigen und stressfreien Bedingungen.
- Halten Sie die Anwendung eine Hypercaloric Ernährung, Adipositas bei Mäusen zu induzieren. Siehe Abschnitt "Diskussion" für weitere Hinweise.
- Schnelle Tiere für 12 h in der Nacht, ohne Begrenzung des Zugangs zu Wasser. Am nächste Tag, ist nach 12 h Fasten, bereiten das Blutzuckermessgerät nach Angaben des Herstellers durch das Einfügen eines neuen Teststreifens in Streifen Testport Protokoll (siehe Tabelle der Materialien).
- Einschneiden der Schwanzspitze mit sterilen Schere sanft Beibehaltung der Maus am Heck, und sofort den nüchtern Blutzucker messen, indem ein rieselfähiges Blutstropfen (minimale Stichprobe Größe 0,5 µL) auf den Teststreifen für das Blutzuckermessgerät.
Hinweis: Ein Countdown-Timer startet auf dem Bildschirm nach ausreichender Anwendung der Blutprobe. Nach 4 s, das Testergebnis erscheint auf dem Bildschirm. - Danach wiegen Sie und beschriften Sie die Tiere einzeln mit Farbmarkierung.
- Verabreichen Sie 2 g Glukose/kg Körper Gewicht über intraperitoneale Injektion. Stellen Sie sicher, dass das Injektionsvolumen 0,1 mL/10 g Körpergewicht (27 G Nadel und 1 cc Spritze) ist.
- Anschließend Messen des Blutzuckers nach 15, 30, 60 und 120 min. durch die Anwendung frei fließende Blutstropfen auf einem neuen Teststreifen.
Hinweis: Blutfluss kann erhöht werden, durch die sanfte Massage der Schweif Tipp-Stationen. Wenn die Rute Wunde überkrustet, reinigen Sie es mit einem sterilen Tupfer mit 0,9 % Natriumchlorid-Lösung getränkt. - Lassen Sie die Tiere in ihrer Heimat Käfigen mit unbegrenztem Zugang zu Wasser zwischen den Messungen zu ruhen.
2. Lunge Funktionsanalyse Maßnahme Res und cDyn
Hinweis: Für ungestörte Messung von Res und cDyn Mäuse müssen Tiefe Narkose beatmet werden. Stressfreies Tier Behandlung und ordnungsgemäße Überwachung der Anästhesie sind unerlässlich. Lesen Sie für allgemeine Anweisungen sterile Techniken verwenden bitte den Artikel von Hoogstraten-Miller Et al. 15
- Kalibrieren der Plethysmogramm vor jeder Reihe von Experimenten und bereiten die Studie-Einstellungen in der Software (siehe Tabelle der Materialien).
- Vor der Operation, tief betäuben Tiere über intraperitoneale Injektion von Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht) und Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) (27 G Nadel- und 1 cc). Stellen Sie sicher, dass das Injektionsvolumen 0,1 mL/10 g pro Körpergewicht ist.
Hinweis: Da Ketamin eine ordnungsgemäße analgetische Wirkung bei Mäusen hat, ist keine zusätzliche Schmerzbehandlung notwendig. Der invasive trachealen Katheter/Plethysmogramm Eingriff dauert ca. 5-7 Minuten, dann Datenerfassung kann beginnen. - Platzieren Sie den Mauszeiger in die Rückenlage auf ein Heizkissen, die Körpertemperatur zu halten.
- Decken Sie die Augen mit Salbe, Trockenheit in Narkose zu verhindern.
- Die Tiefe der Narkose mit der Zehe Pinch-Reaktion ständig zu überwachen.
Hinweis: Zusätzliche Gabe von Betäubung kann weiterhin eine chirurgische Ebene der Narkose erforderlich sein. - Befeuchten Sie das Fell von der OP-Bereich in der Schilddrüse-Region mit 70 % Ethanol.
- Sorgfältig Einschneiden der Haut in der Mittellinie für ca. 1 cm zwischen der Vena Kerbe des Brustbeins und der Knolle Symphyses von der zögerlich durch mit der Pinzette anheben und die Haut unter Sichtkontrolle mit stumpfen Schere (Abbildung 1A) zuschneiden.
- Visualisieren Sie die zugrunde liegenden subkutanem Fettgewebe und Schilddrüse.
- Setzen Sie die Luftröhre durch sorgfältig stumpfen trennt beide Schilddrüsen-Lappen an der Landenge und Präparation des Sternothyroid und der Sternothyroid Muskeln (Abbildung 1 b). Achten Sie darauf, keine Schiffe zu Schaden und Blutungen, da dies negative Auswirkungen auf das Herz-Kreislauf-System führen kann und letztendlich auf die Messungen.
- Anschließend passieren Sie eine 4-0 geflochtenen chirurgischen Naht zwischen der Luftröhre und Speiseröhre mit stumpfen Pinzette. Sorgfältig die Luftröhre in der Nähe des Kehlkopfes zwischen die trachealen Knorpel mit Mikro Schere einzuschneiden.
- Intubation mit einer Trachealkanüle Röhre (0,04 Zoll/1,02 mm Durchmesser) unter Sichtkontrolle (Abbildung 1). Beheben der Röhre über Ligatur mit chirurgischen Nahtmaterials jedes Leck im System zu vermeiden.
- Als nächstes bewegen Sie das Tier zum beheizten Bett der Körper Kammer und schließen Sie die Trachealkanüle Schlauch an der Frontplatte (Abbildung 1) und schalten Sie die Lüftung mit der Belüftung-Taste an der Vorderseite des Controllers (Abbildung 1E).
- Überblick über die Belüftung durch die Beobachtung der Thorax-Bewegung zeitgleich mit der Belüftung. Um die richtige Platzierung der trachealen Röhre zu bestätigen, sicherzustellen Sie, dass beide Seiten des Thorax gleichzeitig bewegen.
- Sehen Sie sich den Druck auf dem Computerbildschirm (Abb. 1F) Signal. Sicherstellen Sie, dass die Lüftung Kurven einheitlich sind. Wenn dies nicht der Fall ist, das Tier zu trennen und die Chirurgie-Seite zu überprüfen. Hüten Sie sich vor Blut oder Schleim blockiert die trachealen Röhre.
Hinweis: Für Erwachsenen Tieren mit einem Körpergewicht von 20-25 g, werden die Ventilatoreinstellungen wie in Abbildung 2 gezeigt im Einklang mit den Empfehlungen des Herstellers empfohlen. - Um Änderungen in der Trans-pulmonale Druck während der Beatmung zu steuern, Einfügen einer Speiseröhrenkrebs Rohres (0,04 Zoll/1,02 mm Durchmesser) in die Speiseröhre in die Tiefe, die die Ebenen der Lunge nähert. Beobachten Sie den Bildschirm während des Einsetzens der Röhre. Legen Sie das Rohr wo maximale Druck Durchbiegung und minimale Herz Artefakte auf dem Bildschirm ersichtlich.
- Bereiten Sie nach der Operation das Tier zur Messung. Wiedereinleitung Anästhesie über intraperitoneale Injektion von Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) mit einer 27-G-Nadel und 1 cc Spritze. Stellen Sie sicher, dass das Injektionsvolumen 0,1 mL/10 g pro Körpergewicht ist.
Hinweis: Um bronchiale Hyperreagibility zu beurteilen, zerstäuben Sie Methacholine, einen nicht-selektive Muskarin-Rezeptor-Agonisten des parasympathischen Nervensystems, die Bronchokonstriktion induziert. Die Datenerfassung erfolgt in vier verschiedenen Phasen (Abbildung 3). - Datenerfassung nach dem letztgültigen Protokoll zu starten.
Hinweis: Die Software führt automatisch durch den Akquisitionsprozess. - Übernehmen Sie 10 µL PBS (Fahrzeug) auf den Zerstäuber, und starten Sie Vernebelung nach 5 min der Akklimatisierung. Befolgen Sie eine Antwort-Phase von 3 min, wo Res (CmH2O/mL/s) und cDyn (mL/CmH2O) gemessen. Am Ende bieten Sie eine Erholungsphase von 3 min um dem Tier vor der nächsten Vernebelung.
- Folgen Sie der Software durch schrittweise Anwendung von 10 µL des steigenden Konzentrationen von Methacholine (2,5 µg/10 µL, 6,25 µg/10 µL und 12,5 µg/10 µL) auf den Ventilator.
- Sobald alle Messungen durchgeführt und aufgezeichnet haben, das Tier durch zervikale Dislokation zu opfern.
(3) Lunge für Quantitative Analyse der Histomorphometric von Erwachsenen Mäusen isoliert
- Tief betäuben die Tiere über intraperitoneale Injektion von Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht) und Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) (27 G Nadel- und 1 cc). Das Injektionsvolumen sollte 0,1 mL/10 g pro Körpergewicht.
Hinweis: Nach dem Zustand der chirurgischen Toleranz zu erreichen, die Vorbereitung dauert ca. 5 min, gefolgt von Organ Perfusion und 30 min zur Fixierung. - Sobald das Tier den Stand der chirurgischen Toleranz (negative Zehe Pinch-Response) erreicht hat, desinfizieren Sie das Tier mit 70 % Ethanol zu und fixieren Sie das Tier auf ein Pad mit chirurgischen Klebeband.
- Opfern Sie das Tier durch Herzpunktion und Blutungen. Kurz, öffnen Sie den Bauch mit einer medialen Einschnitt durch die Haut und das Bauchfell mit stumpfen Schere.
- Suchen Sie die Membran Kopf Stationen der Leber, und trennen Sie vorsichtig die Leber von der Membran.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in die Membran mit einer stumpfen Schere und punctata der linke Ventrikel des Herzens mit einer 20 G Nadel an einer 2-mL-Spritze. Langsam aussaugen des Tieres.
Hinweis: Langsam und vorsichtig Entbluten ist wichtig, zu verhindern, dass die Ventrikel durch den Unterdruck, Hemmung einen ungestörten Blutfluss reduzieren. - Sezieren der Lungenkrebs durch den Brustkorb sanft durch einen Parasternal Schnitt über die gesamte Länge des Brustkorbes mit gebogenen, stumpfe Schere öffnen.
- Danach heben Sie den Brustkorb um den pleural Raum (Abbildung 3) verfügbar zu machen. Entfernen Sie die Thymusdrüse um zu sehen, das Herz und die Lunge.
Hinweis: Optionale Injektion des rechten Ventrikels, gefolgt von Perfusion der Lunge Gefäßsystem mit eiskaltem PBS und dann mit einem Fixativ Lösung [z.B.4 % (Masse/Volumen) Paraformaldehyd (PFA)] ist möglich. Beachten Sie, dass es ein erhöhtes Risiko besteht, alveoläre Septae Bruch und nachteilig auf die Lunge Struktur mit dieser Methode. - Sezieren die Lunge zuerst sorgfältig entfernen das Herz.
- Anschließend passieren Sie eine 4-0 geflochtenen chirurgischen Naht zwischen der Luftröhre und Speiseröhre mit stumpfen Pinzette.
- Als nächstes vorsichtig einschneiden die Luftröhre in der Nähe des Kehlkopfes zwischen die trachealen Knorpel, Intubation mit einer intravenösen Kanüle (26 G) und aufblasen die Lunge durch Druck Fixierung mit einem konstanten Druck von 20 cm H2O mit Fixativ Agent [z.B.4 % (Masse /Volume) der PFA].
- Zur Fixierung der PFA lassen Sie das Fixiermittel für 30 min bei Raumtemperatur. Danach verbinden Sie die Luftröhre und entfernen Sie die Kanüle zu. Dann, Verbrauchsteuern Sie die Lunge sorgfältig ohne Schädigung des Gewebes, und speichern Sie es über Nacht in Fixativ Agent bei 4 ° C.
Hinweis: Alternativ nach der ATS/ETS Konsens Papier 2,5 % GA gepuffert OsO4, Uracil-Lösung dient zur Stabilisierung der richtige Gewebe. Weitere Gewebe Vorbereitung finden Sie unter das Konsenspapier durch Hsia Et al. 14
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Representative Results
Repräsentative Ergebnisse der intraperitonealen Glucose-Toleranz-Test (IpGTT) (Abbildung 4), gebeizt Funktion Test (Abbildung 5) und Vertreter Lungenaufnahmen Hämatoxylin und Eosin veranschaulichen Lunge (Abbildung 6).
Die IpGTT wurde bei fettleibigen Mäusen (blau) nach 7 Wochen von High-Fat-Diät (HFD) durchgeführt. Standard-Diät gefüttert Mäuse diente als Steuerelemente (schwarz). Fettleibige Mäusen zeigten erhöhte Serum Glukose Niveaus 15 und 30 min nach Glukose intraperitoneale Injektion Angabe beeinträchtigt zellulären Glukoseaufnahme (Abbildung 4).
Um die Wirkung der Fettleibigkeit auf die Lungenfunktion zu prüfen, wurde bei fettleibigen Mäusen (blau) nach 7 Wochen von High-Fat-Diät (HFD) invasive Lunge Funktionsanalyse durchgeführt. Fettleibige Mäusen zeigten eine bis zu 1,5-facher Zunahme des Atemwegswiderstandes im Vergleich zu Kontroll-Mäusen (schwarz) (Abbildung 5).
Um die Wirkung von Druck-Fixierung während intratracheale Instillation von Fixiermittel auf Lungenparenchym visualisieren, werden repräsentative Bilder von Hämatoxylin und Eosin befleckt Lungen-Abschnitte (Abbildung 6) angezeigt. Zu wenig Druck führt zu mehrere un-überhöhten Bereichen, dicken alveolären Septae und polygonal geformte Alveolen (A), während zu viel Druckergebnisse in aufgeblasene Emphysem-ähnlichen Gebieten mit zerstoerte alveolären Septae (C). Anwendung den entsprechenden Druck während der Lunge Fixierung führt zu einer völlig überhöhten Lunge mit rund geformten Alveolen (B).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der invasiven Lungenfunktion. (A-C) Schritte der Tracheotomie. (D) die Verbindung des Tieres, die Stirnplatte der Plethysmogramm. (E) Hardware-Setup für invasive Lungenfunktion. (F) Screenshot der Datenerfassung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Schema der Datenerfassung einzuschätzen bronchiale Hyperreagibility. Die Datenerfassung beinhaltet eine anfängliche Akklimatisierung Periode (5 min), gefolgt von 30 s Substanz Vernebelung, 3 min Antwort Phase und 3 min Erholung Phase vorherige Vernebelung des nächsten Substanzkonzentration. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Vorbereitungsschritte. (A-D) Schritte der Tracheotomie. (A) Schnitt der Haut. (B) Situs von der Brusthöhle. (C) Ansicht nach Entfernung des Brustkorbes. (D) Ansicht nach Entfernung des Herzens. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: repräsentative intraperitoneale Glucose-Toleranz-Test (IpGTT). C57BL/6N Mäuse wurden eine fettreichen Diät für 6-8 Wochen gefüttert; Kontroll-Mäusen erhielt eine standard-Diät. n = 3; Meine ± SEM; statistische Analysen wurden die zwei-Wege-ANOVA-Test und Bonferroni Nachtest. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: repräsentative Lunge Funktion Test C57BL/6N Mäuse wurden eine fettreichen Diät für 6-8 Wochen gefüttert; Kontroll-Mäusen erhielt Standardkost. n = 3; Meine ± SEM; statistische Analysen wurden die zwei-Wege-ANOVA-Test und Bonferroni Nachtest. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: repräsentative Bilder illustrieren Hämatoxylin und Eosin befleckt Lungen. Drei verschiedene Sorten von intratrachealen Inflation: (A) zu wenig Druck, entsprechenden Druck (B) und (C) zu viel Druck. UIA; reduzierten Bereich, OIA; über aufgeblasenen Bereich; Bilder wurden unter 20 X Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Ventilatoreinstellungen | Spalte1 |
| Max. Schlagvolumen | 0,25 ml |
| Max. Mund-Druck | 30cmH2O |
| Max. Tiefe Inflation. Volumen | 0,5 ml |
| Max. Tiefe Inflation. Druck | 30cmH2O |
| Preis | 160 Atem pro minute |
Tabelle 1: Ventilatoreinstellungen für Erwachsene Mäuse. Für kleinere Tiere die Beatmungsparameter angepasst werden müssen.
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Discussion
Dieser Bericht enthält drei Protokolle für drei verschiedene Methoden, um die Auswirkungen der Fettleibigkeit auf Glukose-Stoffwechsel und pulmonale Ergebnisse zu analysieren. Erstens kann die Glukose-Toleranz-Test bietet die Möglichkeit, intrazelluläre Glukoseaufnahme analysieren und Hinweis auf Insulin-Resistenz. Zweitens: Ganzkörper-Plethysmographie ist eine Technik zur Messung der Lungenfunktion und ist dabei hilfreich, um die Wirksamkeit von neuen Behandlungsmethoden zu testen. Drittens ist eine standardisierte Fixierung-Protokoll für quantitative morphometrische Analyse zur Bewertung der Auswirkungen der Fettleibigkeit auf Strukturveränderungen unerlässlich.
Diät-induzierten Adipositas in Tierversuchen
Bedeutung im Hinblick auf die bestehenden Methoden und zukünftige Anwendungen: um menschlichen Ernährungsgewohnheiten zu imitieren, was zu Übergewicht führen, Diät-induzierten Adipositas (DIO) Modelle sind weit verbreitet bei Nagetieren. Im Vergleich zu der Verwendung von genetisch veränderten Mäusen imitiert Stoffwechselerkrankung ermöglichen DIO Modelle Analyse der Ätiologie, Pathologie und zukünftige Behandlungsmöglichkeiten. Eine kürzlich durchgeführte Überprüfung von Heydemann Et Al., gibt einen Überblick über verschiedene murinen fettreiche Diät Modelle in Diabetes Forschung16. Spezifische Anpassungen der Nährstoff Komponenten bieten die Möglichkeit der zukünftigen Studien über die Auswirkungen von Mikro und Makro-Nährstoffe auf die molekularen Mechanismen der Adipositas und damit auf Lunge Struktur und Funktion.
Modifikationen und Fehlerbehebung: verschiedene Berichte zeigen, dass Übergewicht durch verschiedene Veränderungen in der Zusammensetzung der Nahrung Nährstoffe16, wissen induziert werden kann, die wiederum führte zur Entwicklung einer Vielzahl von Diäten in den letzten Jahren, zum Beispiel Ernährung mit hohem Fett oder Kohlenhydrate Inhalte oder eine Kombination von beiden Diäten, die die so genannte westliche Ernährung16ist. Letztendlich hängt die Wahl der Diät für eine Studie über die Fragestellung und die Ziele der Studie. Neben der Kontrolle für diese wichtigen Faktoren, ist die Wahl einer ordnungsgemäßen Kontrolle Ernährung von größter Bedeutung; Andernfalls wird die Interpretation der Ergebnisse beschränkt. Der Phänotyp wird nicht nur durch die Art der Ernährung verursacht dennoch ist auch ein Ergebnis der Fütterung Zeitraum, Geschlecht und Maus belasten17.
Grenzen der Technik: Neben der Zusammensetzung der verschiedenen Nährstoffe der Nahrung, die Reaktion des Tieres und die Hintergrund-Belastung könnte entfallen auf die Ergebnisse und der Phänotyp durch die Induktion der Adipositas beobachtet. Zum Beispiel hat schon gezeigt, dass BALB/C Mäuse anfälliger für Leber Steatose im Vergleich zu C57Bl/6 Mäusen18sind. Leichte genetische Variationen, z.B.durch Gendrift (C57Bl/6J versus C57Bl/6N), können auch die Anfälligkeit für Übergewicht19beeinflussen. Dies zeigt die Grenzen der Technik arbeiten mit genetisch veränderten Mäusen mit unterschiedlichen genetischen Hintergrund Stämmen, da sogar die Belastung und der Verkäufer die Mäusen entnommen wurden die Ergebnisse beeinflussen können.
Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls: für zuverlässige, reproduzierbare und vergleichbare Ergebnisse zwischen experimentellen und Kontrollgruppen, vorzugsweise Wurfgeschwistern sollte verwendet werden, um Kontrolle zu generieren und experimentellen Mäuse, Umwelteinflüsse und Stress sollen vermieden, und parallel zu den experimentellen Mäuse12Kontroll-Mäusen untersucht werden.
Intraperitoneale Glukose-Toleranz-Tests (IpGTT)
Bedeutung im Hinblick auf die bestehenden Methoden und zukünftige Anwendungen: um die Wirkung von DIO auf murinen Stoffwechsel ermitteln, verschiedene Screening-Tests bestehen. Die Maus metabolische Phänotypisierung Center (MMPC) Consortium wurde gegründet, um die standard-Methoden für die Beurteilung der metabolische Phänotypen bei Mäusen vorschlagen und veröffentlichte Standardarbeitsanweisungen für die Beschreibung und Durchführung von metabolischen Tests von Glukose Homöostase in Mäusen12. Ein GTT ist ein globaler Ansatz zu messen, wie gut die Zellen des Körpers sind in der Lage, die Aufnahme von Glukose nach der Einnahme einer bestimmten Menge an Zucker, was wiederum bezeichnend für Insulinsekretion und Insulin-Wirkung. Unterschiede im Serum-Insulinspiegel entfallen oft veränderten Glukosetoleranz. Daher ist eines der am häufigsten verwendete physiologische Tests Mausmodelle von Diabetes und Fettleibigkeit zu charakterisieren die GTT geworden. Da die IpGTT einen schnellen und einfachen Ansatz ist, es in zukünftigen Studien als eine standardisierte Methode lässt sich die Wirkung von Ernährung und/oder Behandlung auf Stoffwechsel analysieren.
Modifikationen und Fehlerbehebung: The GTT erfolgt routinemäßig nach nächtlichem Fasten Blutzuckerspiegel in Mäusen20auszugleichen. Da die Dauer der Fastenzeit starke Auswirkungen auf die untersuchten Parameter hat und ist sollte daher von großer Bedeutung für den Vergleich und die Interpretation der Ergebnisse, der Fastenzeit angepasst werden, um das Alter und Körpergewicht von Mäusen. Unter Berücksichtigung, dass Mäuse nachtaktive Tiere sind und zwei Drittel der gesamten täglichen Nahrungsaufnahme über Nacht verbraucht wird, provoziert über Nacht Fasten einen katabolen Zustand. So, der Zeitpunkt der Einleitung und die Dauer des Fastens haben einen höchst relevanten Einfluss auf die Ergebnisse, und somit diese Parameter sollte standardisierte12. Darüber hinaus längeres Fasten Leber Glykogenspeicher erschöpft und reduziert somit die Variabilität in der Basislinie des Blutzuckers. Abschließend, da Insulin stimuliert Glucoseverwertung bei Mäusen nach verstärkt wird längeres Fasten Perioden21, ein 5 bis 6 Stunden Fasten Dauer wird empfohlen, die Insulinwirkung zu beurteilen; in der Erwägung, dass Fasten über Nacht ausreichend Glukose Verwertung12,20,22zu testen ist. Glukose ist normalerweise verabreicht über i.p.-Injektion und die Dosis von Glukose richtet sich nach den Körper Gewicht (in der Regel 1 oder 2 g/kg Körpergewicht)20,22. In DIO Modelle Körpergewicht erhöht, vor allem aufgrund einer höheren Körperfettmasse; Glukoseaufnahme, tritt jedoch überwiegend in Muskeln, Gehirn und Leber. Da die Höhe dieser Gewebe in der Regel nicht von DIO geändert wird, erhalten fettleibige Mäusen eine unverhältnismäßig hohe Menge an Glukose im Vergleich zu schlanken Mäusen, die wiederum könnte Auswirkungen auf die Interpretation der Daten und führen zu einer fehldiagnostiziert Glukoseintoleranz22 . Aus diesem Grund Fasten müssen standardisiert werden und Körperzusammensetzung bei der Interpretation der GTT Ergebnisse23berücksichtigt werden muss. Daher gelten die Computertomographie (CT) oder Magnet-Resonanz-Magnetresonanz-Tomographie(MRI)-Scans. Zum Beispiel Glukose-Messungen von handgeführten Vollblut Glukose Monitoren (siehe Tabelle der Materialien) stehen zur Verfügung, und diese Monitore werden häufiger verwendet als Plasma-Glukose-Analysatoren. Aufgrund der kleinen Blut Volumen erforderlich - in der Regel 5 µL oder weniger - sie sind praktischer als Plasma Analysatoren.
Grenzen der Technik: schnellste Mäuse zeigen die Abhängigkeit der Dauer des Fastens und zeigen einen erheblichen Verlust im Gewicht, Körpertemperatur, Blutvolumen, sowie Herzfrequenz und Veränderungen im Serum-Parameter, wie freier Fettsäuren und Ketonkörper 24. dieser metabolischen Stress wird durch die Tatsache, dass die Gehäusetemperatur von Mäusen in Tierhaltungen ist standardisiert auf etwa 23 ° C und ist daher unter ihren Thermo-neutrale Temperatur von 30 ° C25ausgelöst. Längeres Fasten bei Subthermo-neutrale Temperaturen führt zu Erstarrung, gekennzeichnet durch einen Rückgang der metabolische Rate26,27.
Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls: wie bereits erwähnt, für zuverlässige Ergebnisse zwischen experimentellen und Kontrollgruppen, Wurfgeschwistern sollte vorzugsweise während der Studie und Fasten Perioden verwendet werden, und Zeitpunkte müssen standardisiert werden.
Lunge-Funktionsanalyse
In diesem Protokoll misst die Plethysmogramm direkt Druckänderungen, die Atmung und das daraus resultierende fließt in die und aus den Atemwegen unterwegs sind. Ströme werden durch ein Pneumotachografen befindet sich in der Wand der Plethysmogramm gemessen. Um Widerstand aus der Brustwand auszuschließen, Atemwege öffnen (Mund Druck) und transpulmonale (Ösophagus Rohr) Druck gemessen und Atemwegswiderstand und dynamische Compliance werden berechnet. Dynamische Compliance ist berechnete über die Differenz von der minimalen und maximalen Lungenvolumen durch den Fluss geteilt.
Bedeutung im Hinblick auf die bestehenden Methoden und zukünftige Anwendungen: Plethysmographie ist das Standardverfahren zu analysieren die mechanischen Eigenschaften der Lunge, und kann daher, in zukünftigen Studien verwendet werden, um die Lunge Pathologie und Therapie-Optionen zu analysieren. Um Gruppen und Studien zu vergleichen, ist ein standardisiertes Vorgehen unerlässlich.
Modifikationen und Fehlerbehebung: im Allgemeinen kann diese Technik als hemmungslos und zurückhaltend Ganzkörper-Plethysmographie eingestuft werden. Hemmungslose Methoden bestimmen verbesserte Pause (Penh) und Analyse der normalen Atmung zu ermöglichen, während zurückhaltende, invasive Methoden direkt Druck, Flow oder Volumen messen. Lunge mechanische Eigenschaften werden durch Widerstand und Elastance bestimmt; während Widerstand als das Verhältnis von dem Druck der Strömung berechnet wird, spiegelt Elastance das Verhältnis von Druck, Volumen28. Im Gegensatz dazu hemmungslos Ganzkörper-Plethysmographie misst nur den Druck im Inneren der Plethysmogramm, und daher ist eine Berechnung des Widerstands und der Elastance unmöglich. Im Jahr 2007 haben Lundblad Et Al. erklärt, dass Penh ist nicht der richtige Parameter Atemwegswiderstand gemessen, sondern stellt eine unspezifische Reflexion der Atmung Muster29. So ist für richtige Einschätzung der Lungenmechanik, invasive Plethysmographie unverzichtbar29,30,31.
Da ATEMWERTE abhängig von Alter und Größe von Mäusen, Beatmungsparameter angepasst werden müssen. Zum Beispiel das Tidalvolumen ist im Zusammenhang mit Körpergewicht und sollte auf 10 µL/g Körpergewicht mit einer Atemfrequenz von 120-250 Atemzügen pro Minute eingestellt werden. Wenn diese Parameter einstellen, sollte der Prüfer berücksichtigen, dass die mittleren Tidalvolumen, Atemfrequenz32umgekehrt zusammenhängt. Da Spontanatmung Druck, Durchfluss und Lautstärke beeinflusst, die Tiefe der Narkose überwacht werden und Belüftung Kurven müssen immer beachtet werden. Jedoch kann Anästhesie selbst direkt Lungenfunktion beeinträchtigen. Z. B. schützen Propofol und Ketamin teilweise vor induzierten Atemwege Verengung im Vergleich zu Thiopental33. Darüber hinaus haben klinische Studien gezeigt, dass Ketamin eine anticholinerge Wirkung hat und als ein potenzieller Bronchodilator in schwerem Asthma34verwendet werden kann. Volatile Anästhetika, wie Isoflurane in Verbindung mit Schmerzbehandlung, gelten als eine steuerbare Alternative zur Injektion Anästhesie; jedoch Atemwegsreizungen nach volatile Anästhetika wird berichtet und daher schließt Inhalation Anästhetika wie eine alternative35.
Grenzen der Technik: die zurückhaltende invasive Methode Lunge mechanische Eigenschaften zu messen ist aufgrund der notwendigen Tracheotomie, eine endgültige Verfahren und schränkt dadurch die Studie einer Einpunkt-Analyse, ohne die Möglichkeit, die Krankheit zu untersuchen Fortschreiten. Um die Verringerung der Invasivität kann Messung der Transferimpedanz bei bewussten Tieren durchgeführt werden, damit ermöglicht, die Längsschnittstudien. Jedoch bei der Messung von respiratorischen Mechanik in nicht tracheotomized Tiere, der Widerstand der Nase trägt dazu bei, die Atemwege Gesamtwiderstand und dadurch erschwert Messungen nach Methacholine Provokation13.
Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls: Hier zeigen wir nur eine Methode der invasiven Lungenfunktion. Da gibt es mehrere etablierten invasiven Lunge Funktion Methoden, Standardisierung innerhalb der Studien und eine ausführliche Beschreibung der Methode verwendet, Gruppen, und eine Narkose-Regime in Publikationen ist notwendig, Studien zu vergleichen.
Lunge Exzision für Histomorphometric Analyse
Bedeutung im Hinblick auf die bestehenden Methoden und zukünftige Anwendungen: Quantitative Histomorphometric Analyse verwendet werden, zu untersuchen, die Auswirkungen der Fettleibigkeit auf Lunge Struktur (Bronchien und Alveolen), die durch invasive erzielten Ergebnisse zu interpretieren Plethysmographie, und mögliche Therapieoptionen auf pulmonale Ergebnis zu studieren. Daten aus histologischen Einschätzungen abweichen Je nach Fixativ Agenten und die verwendeten Fixierung-Verfahren. Da es erwiesen, dass Fettleibigkeit auf alveoläre und bronchiale Struktur, als auch als extrazelluläre Matrix und zellulären Zusammensetzung wirkt ist es notwendig, eine geeignete Technik basierend auf die Forschungsfrage in zukünftigen Studien zu bestimmen. Für unvoreingenommene quantitative Morphometrie Gewebe Verarbeitung nach Fixierung erfolgen soll, nach den Standards der American Thoracic Society (ATS) / European Respiratory Society (ERS) für die quantitative Bewertung der Lunge Struktur14 .
Modifikationen und Fehlerbehebung: im Jahr 2010 Hsia Et Al. stellten eine offizielle Erklärung von der ATS/ERS-Maßstäbe für die quantitative Bewertung der Lunge Struktur, die vor der Lunge Isolation und Fixierung berücksichtigt werden sollten 14. neben intratracheale Instillation von Fixiermittel, in Situ Fixierung, festen Volumen Fixierung oder Vakuum Inflation kann durchgeführt werden, um pulmonale Gewebe36aufzublasen. Inflation und damit Luftraum Erweiterung ist abhängig von der Fixierung Verfahren und der Grad der Druck während der Fixierung angewendet. Hoher Druck kann beispielsweise zu alveolären Wand Ruptur führen und dadurch Einfluss auf die Ergebnisse. Ähnlich wie bei der Beatmungsparameter, hängen die ideale Fixierung Parameter Alter, Größe und Phänotyp der Mäuse. Fixierung kann mit chemischen oder physikalischen Mitteln, einschließlich chemische Arbeitsstoffe bzw. Kryokonservierung erreicht werden. Intratracheale Instillation von geeigneten Fixiermittel imitiert Gewebe Inflation während der Atmung, die in Vivo Bedingungen und ist daher weit verbreitete37. 20-25 cm über dem höchsten Punkt der Lunge ist für ausreichenden Druck, mit einem breiten und kurzen Schlauch damit schnelle und gleichmäßige Durchdringung14empfohlen. Ein der Hauptziele der Fixierung wird verhindern, dass der Prozess der Degeneration und Zellen und Gewebe in einem "lebensechten Zustand" zu erhalten, unter Beibehaltung der architektonischen Integritätdes des Lungenparenchyms. Darüber hinaus muß Gewebe seine Reaktivität, Antikörper, Flecken und Nukleinsäure-Sonden. Neben dem Effekt der normalen Autolyse Nebenwirkungen von Gewebe Verarbeitung, einschließlich Infiltration mit heißem Wachs, aufteilen und entwachsen, müssen verhindert werden. Die Wahl des Fixiermittels sowie Weiterverarbeitung des Gewebes, z.B. durch einbetten, kann dazu führen, dass Gewebe schrumpfen, Schwellung und Verhärtung der verschiedenen Komponenten und führen zu Artefakte, wie erhöhte Autofluoreszenz38. Zum Beispiel Fixierung in 10 % Formalin gepuffert und Weiterverarbeitung kann dazu führen, dass Schrumpfung von bis zu 20 % - 30 % im Vergleich zu Ausgangsmenge39. Daher gepuffert Hsia Et Al. in ihrer 2010 Konsenspapier der ATS/ERS empfehlen die Verwendung von 2,5 % Glutaraldehyd mit Osmium ausgefällt und Uranyl Acetat, Schrumpfung des Gewebes zu vermeiden. Lungenvolumen, interne Architektur, feine Gewebestruktur und Zelle Struktur wurde nach der Atemwege Instillation von diesem Fixativ Reagenz14erhalten. Denaturierung der Proteine und Querverbindung entsteht Bildung sind zwei wichtige Mechanismen, die Fixierung des Gewebes wichtig sind. Austrocknende Verbindungen oder Gerinnungsmittel, wie Alkohol oder Aceton, verursachen Denaturierung von Proteinen, was zu Veränderungen der tertiären Proteinstruktur durch hydrophobe Bindungen zu destabilisieren. Non-Gerinnungsmittel Fixiermittel wie Paraformaldehyd oder Glutaraldehyd reagieren chemisch mit Proteinen und Form zwischen molekularer und intramolekularer Vernetzungen. Da mehrere Färbung Verfahren wie Hämatoxylin und Eosin Färbung, hängen zwischen molekularen Wechselwirkungen, kann Färbung Ergebnisse, abhängig von der Fixativ Agent sich verschlechtern. Antigen-Abrufmethoden in Immunohistochemistry haben gezeigt, dass einige der Reaktionen der Fixierung reversibel sind, insbesondere der Formaldehyd40.
Grenzen der Technik: da das alveoläre Oberfläche Futter durch intratracheale Instillation von Fixiermittel, die Auslegung, z. B. alveoläre Mikroarchitektur, Schleim Akkumulation entfernt wird oder entzündliche Zellwanderung manipuliert werden kann 41 , 42 , 43.
Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls: Hier zeigen wir die intratracheale Instillation von 4 % PFA als ein breiter Ansatz, die Auswirkungen der Fettleibigkeit auf pulmonale Ergebnisse zu visualisieren. Wie bereits erwähnt, muss das Protokoll abhängig von der Fragestellung nach der ATS/ERS Empfehlungen14geändert werden.
Zusätzlich zu den oben genannten Parametern ist Stress ein wichtiger Einflussfaktor für Forschungsergebnisse. Deshalb trainieren beide Mäuse und der Wissenschaftler ist unverzichtbar. Mäuse sollten auf einstweilige Verfügung angepasst werden und sollte auf den experimentellen Bereich unter ruhigen Bedingungen44übertragen werden. Stress beeinflusst Stoffwechsel, z. B. als Folge von Stress Hormonausschüttung, veröffentlichte Blutzuckerspiegel erhöht, ein Effekt, der als fehlinterpretiert werden kann beeinträchtigte Glukosetoleranz. Stress-Hormon-Version ändert auch Anfälligkeit für Anästhetika, speziell, die Dosis von Anästhetika und die chirurgische Toleranz zu erreichen ist verlängert. Wie bereits erwähnt, kann die erhöhte Menge von Anästhetika Bronchokonstriktion, beeinflussen, während der Stress selbst bronchialen Dilatation verursachen kann.
Zusammenfassend lässt sich sagen enthält dieser Artikel drei Methoden zur Bewertung der Auswirkungen von Übergewicht und Stoffwechsel auf Lunge Struktur und Funktion bei Mäusen. Alle genannten Methoden auf andere Krankheitsmodelle und Nagetierarten wie Fettleibigkeit durch Genveränderungen oder Ratte Modelle übertragen werden können. Die Anwendung dieser Techniken kann helfen, neue molekulare Mechanismen in DIO Modelle mit spezifischen Gen-Ablation zu definieren oder zu testen, neue therapeutische Ansätze, um die nachteiligen Auswirkungen der Fettleibigkeit auf chronische Lungenerkrankungen behandeln/verhindern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Experimente wurden durch die Marga und Walter Boll-Stiftung, Kerpen, Deutschland gestützt; Projekt-210-02-16 (MAAA) Projekt 210-03-15 (MAAA) und von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG; AL1632-02; MAAA), Bonn, Deutschland; Zentrum für Molekulare Medizin Köln (CMMC; Universitätsklinikum Köln; Karriere-Förderung-Programm; MAAA), Köln Fortune (medizinische Fakultät, Universität zu Köln; KD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GlucoMen LX | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 38969 | blood glucose meter |
| GlucoMen LX Sensor | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 39765 | Test stripes |
| Glucose 20% | B. Braun, Melsung, Germany | 2356746 | |
| FinePointe Software | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-002 | |
| FinePointe RC Single Site Mouse Table | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-001 | |
| FPRC Controller | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1075-001 | |
| FPRC Aerosol Block | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1106-001 | |
| Aerogen neb head-5.2-4um | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-2306-001 | |
| Forceps | FST, British Columbia, Canada | 11065-07 | |
| Blunt scissors | FST, British Columbia, Canada | 14105-12 | |
| Micro scissors | FST, British Columbia, Canada | 15000-00 | |
| Perma-Hand 4-0 | Ethicon, Puerto Rico, USA | 736H | Surgical suture |
| Roti-Histofix 4% | Roth | P087.1 | 4% Paraformaldehyd |
| Ketaset | Zoetis, Berlin, Germany | 10013389 | Ketamine |
| Rompun 2% | Bayer, Leverkusen, Germany | 770081 | Xylazine |
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