Summary
Forekomsten af fedme er stigende og øger risikoen for kroniske lungesygdomme. For at fastsætte de underliggende mekanismer og forebyggende strategier, veldefinerede dyre modeller er nødvendige. Her give vi tre metoder (glucose-tolerance-test, krop plethysmography og lunge fiksering) at studere effekten af fedme på pulmonal resultater i mus.
Abstract
Fedme og luftvejssygdomme er store sundhedsmæssige problemer. Fedme er blevet en ny epidemi med et forventet antal over 1 milliard overvægtige personer på verdensplan frem til 2030, således udgør en voksende samfundsøkonomisk byrde. Samtidig, er fedme-relaterede co-morbiditet, herunder diabetes og hjerte samt kroniske lungesygdomme, konstant stigende. Selv om fedme er forbundet med øget risiko for astma-eksacerbationer, forværring af respiratorisk symptomer og dårlig kontrol, funktionelle rolle fedme og foruroliget metabolisme i patogenesen af kronisk lungesygdom er ofte undervurderet, og underliggende molekylære mekanismer er fortsat undvigende. Denne artikel har til formål at præsentere metoder til at vurdere effekten af fedme på stofskifte, samt lunge struktur og funktion. Her, vi beskriver tre teknikker for mus undersøgelser: (1) vurdering af intraperitoneal glukosetolerance (ipGTT) at analysere effekten af fedme på glukosemetabolismen; (2) måling af luftvejene modstand (Res) og åndedrætsorganerne overholdelse (Cdyn) at analysere effekten af fedme på lungefunktion; og (3) forberedelse og fiksering af lunge for efterfølgende kvantitativ histologisk vurdering. Fedme-relaterede lungesygdom er sandsynligvis multifaktoriel, skyldes systemisk inflammatorisk og metaboliske dysregulering, der potentielt negativt påvirker lungefunktion og respons på terapi. En standardiseret metode til at studere molekylære mekanismer og effekt af nye behandlinger er derfor afgørende.
Introduction
Ifølge World Health Organization (WHO) i 2008, var mere end 1,4 milliarder voksne, i alderen 20 og ældre, overvægtig med et body mass index (BMI) større end eller lig med 25; yderligere, mere end 200 millioner mænd og næsten 300 millioner kvinder var overvægtige (BMI≥30)1. Fedme og metaboliske syndrom er vigtige risikofaktorer for en lang række sygdomme. Mens fedme og samtidig øget hvidt fedtvæv masse har været tæt forbundet med type 2 diabetes2,3, hjerte-kar sygdomme, herunder koronar hjertesygdom (CHD), hjertesvigt (HF), atrieflimren4 og slidgigt5, deres funktionelle roller i patogenesen af luftvejslidelser forbliver dårligt forstået. Dog har epidemiologiske undersøgelser påvist, at fedme er stærkt forbundet med kroniske luftvejslidelser, herunder anstrengelses dyspnø, obstruktiv søvnapnø syndrom (OSAS), fedme hypoventilation syndrom (OHS), kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), lungeemboli, aspirationspneumoni og bronkial astma6,7,8,9. Potentielle mekanismer forbinder fedme og foruroliget stofskifte, fx, insulinresistens og type II diabetes, til patogenesen af kronisk lungesygdom ikke kun omfatter mekaniske og fysiske konsekvenser af vægt gevinst ved ventilation men også fremkalde en kronisk subakutte inflammatorisk tilstand10,11. Stigningen i fedme og lungesygdomme i det sidste tiår, kombineret med manglen på effektive forebyggende strategier og terapeutiske tilgange, fremhæver nødvendigheden af at undersøge de molekylære mekanismer for at definere nye muligheder for at styre fedme-relaterede lungekræft sygdomme.
Her, vi beskriver tre standard tests, som er vigtige grundlæggende at undersøge fedme og dens indvirkning på lunge struktur og funktion i musemodeller: (1) intraperitoneal glukose tolerance (ipGTT) (2) måling af luftvejene modstand (Res) og respiratorisk systemets kompatibilitet (Cdyn); og (3) forberedelse og fiksering af lunge for efterfølgende kvantitativ histologisk vurdering. IpGTT er en robust screeningstest foranstaltning glukoseoptagelse, og dermed effekten af fedme på stofskiftet. Enkelheden i metoden tillader god standardisering, og derfor sammenlignelighed af resultaterne mellem laboratorier. Mere sofistikerede metoder, såsom hyperglykæmisk klemmer eller undersøgelser på isolerede småøer, kan bruges til detaljeret analyse af metabolisk fænotype12. Her vurderer vi glukosetolerance for at definere en fedme-associeret stat af systemisk og metabolisk lidelse som grundlag for yderligere undersøgelser af en pulmonal resultatet. For at vurdere effekten af fedme og stofskiftesygdom på lungefunktion, målte vi luftvejene modstand (Res) og åndedrætsorganerne overholdelse (Cdyn). For at karakterisere lungesygdom, er uhæmmet samt behersket metoder til vurdering af lungefunktion tilgængelige. Uhæmmede plethysmography i frit flytte dyr efterligner en naturlig tilstand, som afspejler vejrtrækning mønstre; invasive metoder, såsom Indgangsimpedans måling af Res og cDyn i dybt bedøvede mus at vurdere dynamisk lunge mekanik, er derimod mere præcis13. Da kroniske luftvejssygdomme afspejles af histologiske ændringer af lungevæv, er ordentlig lunge fiksering til yderligere analyse forestående. Valget af metode til væv fiksering og forberedelse afhænger rum i lungerne, som vil blive undersøgt, for eksempel, gennemføre airways eller lunge parenkym14. Her, beskriver vi en metode, der giver mulighed for kvalitativ og kvantitativ vurdering af de strømførende airways at studere effekten af fedme på astma udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr, der blev gennemført i overensstemmelse med protokoller godkendt af lokale myndigheder (delstaten NRW, AZ: 2012.A424), og var i overensstemmelse med den tyske dyrevelfærd lov og forordninger om velfærd for dyr, der anvendes for eksperimenter eller for andre videnskabelige formål. Da lunge-funktionen analyse kan påvirke lunge struktur og derfor efterfølgende histologisk analyserer, bør måling af Res og Cdyn og forberedelse og fiksering af lunge for histomorfometri udføres i forskellige dyr. Måling af Res og Cdyn efter ipGTT er imidlertid muligt. Da stress under ipGTT kunne blande sig med anæstesi behov for lungefunktion test, en restitutionsperiode ca 2 uger efter ipGTT anbefales at tillade mus hen til genoprette fra kroppen vægttab og ændringer i blod parametre12.
1. forberedelse til Intraperitoneal glukose Tolerance Test (ipGTT)
Bemærk: Efter 12 timer i fastende, den komplette ipGTT tager ca 2 h.
- Da stress påvirker blodsukkeret væsentligt, sørge for, at begge tilpasning af mus, samt uddannelse af videnskabsmanden, der udføres.
- Overføre dyr til det eksperimentelle område på stille og stressfri betingelser.
- Overveje anvendelsen af en hypercaloric kost til at fremkalde fedme hos mus. Se afsnittet diskussion for yderligere rådgivning.
- Hurtige dyr til 12 h natten over, uden at begrænse adgang til vand. Den næste dag,'s efter 12 h, fastende, forberede blodsukkerapparat ifølge producenten protokol (Se tabel over materialer) ved at indsætte en ny teststrimmel i test strip port.
- Incise halespidsen ved hjælp af steril saks, mens blidt bevarer musen på halen, og straks måle fastende blodglucose ved at anvende en letflydende blod drop (minimumsantal af stikprøver størrelse 0,5 µL) teststrimlen blod glucose meter.
Bemærk: En nedtælling starter på skærmen efter tilstrækkelig anvendelse af blodprøven. Efter 4 s, testresultatet vises på skærmen. - Bagefter, veje og mærke dyrene individuelt ved hjælp af farve mærkning.
- Administrere 2 g glucose/kg krop vægt via intraperitoneal injektion. Sikre, at Injektionsvolumen 0,1 mL/10 g kropsvægt (27 G kanyle og 1 cc sprøjte).
- Efterfølgende måle blodglukose efter 15, 30, 60 og 120 min ved at anvende en dråbe af fritflydende blod på en ny teststrimmel.
Bemærk: Blodgennemstrømning kan forhøjes med blid massere af Hale spids-menigheder. Hvis halen sår encrusts, rense det med en steril vatpind vædet med 0,9% natriumchlorid løsning. - Tillad dyr at hvile i deres hjem bure med ubegrænset adgang til vand mellem målingerne.
2. lunge-funktion analyser til foranstaltning Res og cDyn
Bemærk: For uforstyrret måling af Res og cDyn, mus skal være ventileret under dyb anæstesi. Stress-fri dyr håndtering og korrekt overvågning af anæstesi er afgørende. Generelle instruktioner med steril teknik, bedes du gennemlæse artiklen i af Hoogstraten-Miller et al. 15
- Kalibrere plethysmograph inden hvert sæt af eksperimenter og forberede undersøgelse indstillinger i softwaren (Se Tabel af materialer).
- Forud for operationen, dybt bedøver dyr via intraperitoneal injektion af xylazin (10 mg/kg kropsvægt) og ketamin (100 mg/kg kropsvægt) (27 G kanyle og 1 cc sprøjte). Sikre, at Injektionsvolumen 0,1 mL/10 g pr. kropsvægt.
Bemærk: Da ketamin har en ordentlig analgetisk effekt i mus, ikke yderligere smertebehandling er nødvendig. Invasive trakeal kateter/plethysmograph proceduren tager ca 5-7 minutter, derefter dataopsamling kan begynde. - Placere musen i den liggende stilling på en varmepude til at opretholde kropstemperaturen.
- Dække øjnene med salve til at forhindre tørhed under anæstesi.
- Konstant overvåge dybde af anæstesi ved hjælp af tå knivspids-svar.
Bemærk: Yderligere administration af anæstesi kan være nødvendige for at opretholde et kirurgisk fly af anæstesi. - Fugte pels af det kirurgiske område i regionen skjoldbruskkirtlen med 70% ethanol.
- Omhyggeligt incise huden i midterlinjen for ca. 1 cm mellem den jugularis notch af brystbenet og tuber symphyses af mentum ved at løfte det med pincet og klipning huden under visuel kontrol bruge sløv saks (figur 1A).
- Visualisere den underliggende subkutane fedtvæv og skjoldbruskkirtlen.
- Udsætte luftrøret ved omhyggeligt stump adskille begge skjoldbruskkirtlen lapper på Næs og dissektion af sternothyroid og sternothyroid muskler (figur 1B). Pas på ikke at skade nogen fartøjer og forårsage blødning, da dette kan forårsage uønskede virkninger på det kardiovaskulære system og i sidste ende på målingerne.
- Efterfølgende, passere en 4-0 flettet kirurgisk sutur mellem luftrøret og spiserøret ved hjælp af stump pincet. Omhyggeligt incise luftrøret tæt på strubehovedet mellem de trakeale brusk med micro saks.
- Intubate med en trakeal tube (0,04 tommer/1.02 mm diameter) under visuel kontrol (figur 1 c). Fix tube via ligatur med kirurgisk sutur at undgå enhver lækage i systemet.
- Næste, flytte dyret til opvarmet sengen af kroppen kammeret og forbinde de trakeal tube til forpladen (fig. 1 d) og tænd ventilationen ved at trykke på knappen ventilation på frontpanelet af controller (figur 1E).
- Undersøgelsen ventilation ved at observere thorax bevægelse samtidigt med ventilation sats. For at bekræfte korrekt placering af den trakeal tube, sikre, at begge sider af brystkassen flytte samtidigt.
- Se presset signal på skærmen (figur 1F). For at ventilationen kurver er ensartede. Hvis dette ikke er tilfældet, afmontere dyret og kontrollere kirurgi side. Pas på blod eller slim blokerer den trakeal tube.
Bemærk: For voksne dyr med en vægt på 20-25 g, ventilator indstillinger som vist i figur 2 er foreslået i henhold til producentens anbefalinger. - For at styre ændringer i trans-pulmonal pres under ventilation, skal du indsætte en esophageal tube (0,04 tommer/1.02 mm i diameter) i spiserøret på den dybde, der nærmer sig niveauer af lungerne. Se skærmen samtidig med at placere røret. Røret anbringes hvor maksimal pres afbøjning og minimal hjerte artefakter kan ses på skærmen.
- Efter kirurgi, forberede dyret til måling. Handler anæstesi via intraperitoneal injektion af ketamin (100 mg/kg kropsvægt) ved hjælp af en 27-G kanyle og 1 cc sprøjte. Sikre, at Injektionsvolumen 0,1 mL/10 g pr. kropsvægt.
Bemærk: For at vurdere bronkial hyperreagibility, nebulize methacholine, en ikke-selektiv muskarine receptor agonist af det parasympatiske nervesystem, som fremkalder bronchoconstriction. Dataopsamling udføres i fire forskellige faser (figur 3). - Start dataopsamling efter manufacturer´s protokol.
Bemærk: Softwaren automatisk guider brugerne gennem erhvervelse processen. - Anvend 10 µL af PBS (køretøj) på forstøver, og start nebulization efter 5 min i acclimation. Dernæst Følg en reaktion fase af 3 min, hvor Res (cmH2mL-O-s) og cDyn (mL/cmH2O) måles. I slutningen, give en opsvingsfasen af 3 min dyret før den næste nebulization.
- Følg softwaren ved trinvis anvendelse af 10 µL af stigende koncentrationer af methacholine (2,5 µg/10 µL, 6,25 µg/10 µL og 12,5 µg/10 µL) på ventilator.
- Når alle målingerne er blevet udført og registreret, ofrer dyret af cervikal dislokation.
3. lunge Isolation for kvantitative Histomorphometric analyse af voksen mus
- Dybt bedøver dyr via intraperitoneal injektion af xylazin (10 mg/kg kropsvægt) og ketamin (100 mg/kg kropsvægt) (27 G kanyle og 1 cc sprøjte). Injektionsvolumen bør være 0,1 mL/10 g pr. kropsvægt.
Bemærk: Efter at have nået tilstanden af kirurgisk tolerance, forberedelsen tager ca. 5 min. efterfulgt af orgel perfusion og 30 min til fiksering. - Når dyret har nået tilstanden af kirurgisk tolerance (negative tå knivspids-reaktion), desinficere dyr med 70% ethanol og lave dyret på en pad med kirurgisk tape.
- Ofre dyr af cardiac punktering og blødning. Kort, åbne maven med en medial snit gennem huden og bughinden bruger sløv saks.
- Find mellemgulvet hoved menigheder i leveren, og forsigtigt adskille leveren fra mellemgulvet.
- Gør et lille snit i mellemgulvet bruger sløv saks, og punktformet venstre hjertekammer af hjertet med en 20 G kanyle tilknyttes en 2 mL sprøjte. Langsomt exsanguinate dyret.
Bemærk: Langsom og forsigtig exsanguination er vigtigt at forhindre hjertekamrene kollapser på grund af undertryk, hæmme en uforstyrret blodgennemstrømning. - Dissekere lungen ved at åbne brystkassen forsigtigt gennem et parasternal snit langs hele længden af brystkassen ved hjælp af buede, sløv saks.
- Bagefter, hæve brystkassen for at udsætte den pleural hulrum (figur 3 c). Fjerne thymus for at se hjertet og lungerne.
Bemærk: Valgfri injektion af højre hjertekammer, efterfulgt af perfusion af lunge vaskulære system med iskold PBS og derefter med en Fikseringsvæske løsning [fx4% (masse/volumen) PARAFORMALDEHYD (PFA)] er muligt. Vær opmærksom på at der er en øget risiko for ruptur alveolær septae og forringe lunge struktur ved hjælp af denne metode. - Dissekere lunge af første omhyggeligt at fjerne hjertet.
- Efterfølgende, passere en 4-0 flettet kirurgisk sutur mellem luftrøret og spiserøret ved hjælp af stump pincet.
- Dernæst omhyggeligt incise luftrøret tæt på strubehovedet mellem de trakeale brusk, intubate med en intravenøs kanyle (26 G) og puste lungen ved pres fiksering ved et konstant tryk på 20 cm H2O ved hjælp af Fikseringsvæske agent [fx4% (mass /Volume) af PFA].
- PFA fiksering, forlade fiksativ i 30 min. ved stuetemperatur. Bagefter, ligate luftrøret og fjerne kanylen. Derefter, punktafgifter lungen omhyggeligt uden at skade vævet, og gemme det i Fikseringsvæske agent ved 4 ° C natten over.
Bemærk: Alternativt, ifølge ATS/ETS konsensus papir 2,5% GA buffered OsO4, Uracil opløsningen anvendes til korrekt væv stabilisering. For yderligere væv forberedelse, se konsensus papir af Hsia et al. 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative resultater af intraperitoneal glukose tolerance test (ipGTT) (figur 4), lunge-funktion test (figur 5), og repræsentant billeder illustrerer hæmatoxylin og eosin farves lungerne (figur 6).
IpGTT blev udført på overvægtige mus (blå) efter 7 uger af høj-fedt-kost (HFD). Standard kost-fed mus fungerede som kontrolelementer (sort). Overvægtige mus viste øget serum glukose niveau 15 og 30 min efter injektion af intraperitoneal glucose, der angiver nedsat cellulær glukoseoptagelse (figur 4).
For at undersøge effekten af fedme på lungefunktion, blev invasive lunge funktion analyse udført på overvægtige mus (blå) efter 7 uger af høj-fedt-kost (HFD). Overvægtige mus viste en op til 1.5-fold stigning af luftvejene modstand i forhold til kontrol mus (sort) (figur 5).
For at visualisere effekten af pres fiksering under intratrakeal instillation af fikseringsmidler på lunge parenkym, er repræsentative billeder af hæmatoxylin og eosin farves lunge sektioner vist (figur 6). For lidt pres fører til flere un-oppustet områder, tyk alveolær septae og polygonal formet alveolerne (A), mens du for meget pres resulterer i oppustet emfysem-lignende områder med destrueret alveolær septae (C). Anvendelsen af de relevante pres under lunge fiksering fører til en helt oppustede lunge med runde formet alveolerne (B).
Figur 1: skematisk fremstilling af invasive lungefunktion. (A-C) Trin af tracheotomi. (D) tilslutning af dyr til forpladen af plethysmograph. (E) Hardwareopsætning for invasive lungefunktion. (F) Screenshot af datafangst. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: ordning af datafangst at vurdere bronkial hyperreagibility. Dataopsamling omfatter en indledende acclimation periode (5 min), efterfulgt af 30 s stof nebulization, 3 min reaktion fase og 3 min af recovery fase forudgående nebulization af næste koncentration af stof. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: skematisk fremstilling af præparationstrin. (A-D) Trin af tracheotomi. (A) indsnit i huden. (B) Situs af brysthulen. (C) Vis efter fjernelse af brystkassen. (D) se efter fjernelse af hjertet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative intraperitoneal glukose tolerance test (ipGTT). C57Bl/6N mus blev fodret en fedtrig kost for 6-8 uger; Control mus modtaget en standard kost. n = 3; Betyde ± SEM; statistiske analyser udføres var to-vejs ANOVA test og Bonferroni posttest. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative lunge-funktion test C57Bl/6N mus blev fodret en fedtrig kost for 6-8 uger; Control mus modtaget standard kost. n = 3; Betyde ± SEM; statistiske analyser udføres var to-vejs ANOVA test og Bonferroni posttest. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: repræsentative billeder illustrerer hæmatoxylin & eosin farves lungerne. Tre forskellige kvaliteter af intratrakeal inflation: (A) for lidt pres, (B) relevante pres og (C) for meget pres. UIA; skjult område, OIA; over oppustede område; Billeder blev taget under 20 X forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Ventilator indstillinger | Spalte1 |
| Max. slagtilfælde volumen | 0,25 ml |
| Max. mund pres | 30cmH2O |
| Dyb inflation max. volumen | 0,5 ml |
| Dyb inflation max. pres | 30cmH2O |
| Sats | 160 åndedrag pr. minut |
Tabel 1: Ventilator indstillinger for voksne mus. For mindre dyr skal ventilation parametrene justeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne rapport indeholder tre protokoller for tre forskellige metoder til at analysere virkningen af fedme på glukosemetabolismen og pulmonal resultater. Først, den glukose tolerance test giver mulighed for at analysere intracellulære glukoseoptagelse og kan være vejledende for insulinresistens. Andet, hele kroppen plethysmography er en teknik til at måle lungefunktion og dermed nyttigt at teste effekten af nye behandlinger. For det tredje er en standardiseret fiksering protokol afgørende for kvantitative morfometrisk analyse til at vurdere virkningerne af fedme på strukturelle ændringer.
Kost-induceret fedme i dyreforsøg
Betydning med hensyn til eksisterende metoder og fremtidige programmer: for at efterligne menneskers spisevaner, hvilket resultere i fedme, kost-induceret fedme (DIO) modeller er meget udbredt i gnavere. I forhold til brugen af genmodificerede mus efterligne stofskiftesygdom, aktiverer DIO modeller analyse af ætiologi, patologi og fremtidige behandlingsmuligheder. En nylig gennemgang af Heydemann et al., giver et overblik over forskellige murine fedtrig kost modeller i diabetes forskning16. Særlige ændringer af næringsstof komponenter giver muligheden for fremtidige undersøgelser af virkningen af mikro - og makro-næringsstoffer på de molekylære mekanismer af fedme, og dermed på lunge struktur og funktion.
Ændringer og fejlfinding: forskellige rapporter viser, at fedme kan være fremkaldt af forskellige ændringer i sammensætningen af kosten næringsstoffer16, viden, som har til gengæld ført til udvikling af en række forskellige kost i de seneste år, for eksempel, kost højt i fedt eller kulhydrat indhold eller en kombination af begge diæter, som er de såkaldte vestlige kost16. I sidste ende afhænger valget af kost for en undersøgelse af problemformulering og målene for undersøgelsen. Udover kontrol for disse vigtige faktorer, er valg af en ordentlig kontrol kost af afgørende betydning; ellers, fortolkningen af resultaterne vil være begrænset. Ikke desto mindre fænotype skyldes ikke kun typen kost men er også et resultat af fodring perioden, køn og mus stamme17.
Begrænsninger af teknikken: ved siden af sammensætningen af forskellige næringsstoffer i kosten, dyret og baggrunden stamme reaktion kunne redegøre for resultaterne og fænotype observeret af induktion af fedme. For eksempel, har det vist sig, at BALB/C mus er mere modtagelige for leveren steatose i forhold til C57Bl/6 mus18. Små genetiske variationer, fxpå grund af genetisk drift (C57Bl/6J versus C57Bl/6N), kan også påvirke modtageligheden for fedme19. Dette understreger begrænsningerne af den teknik, der arbejder med genmodificerede mus med forskellige genetiske baggrund stammer, da selv stammen og kreditoren som musene blev fremstillet kan påvirke resultaterne.
Kritiske trin i protokollen: For pålidelige, reproducerbare og sammenlignelige resultater mellem den eksperimentelle og kontrolgrupper, helst littermates bør bruges til at generere kontrol og eksperimentelle mus, miljøfaktorer og stress bør være undgås, og kontrol mus bør undersøges parallelt med eksperimentelle mus12.
Intraperitoneal glukose tolerance test (ipGTT)
Betydning med hensyn til eksisterende metoder og fremtidige programmer: for at bestemme virkningen af DIO på murine metabolisme, forskellige screeningstest findes. Musen metaboliske fænotyper Center (MMPC) konsortiet blev etableret for at foreslå standardmetoder til vurdering af metaboliske fænotyper i mus og har offentliggjort standardprocedurer for beskrivelse og metaboliske test af glukose homøostase i mus12. En GTT er en global tilgang til at måle, hvor godt kroppens celler er i stand til optagelse glukose efter indtagelse af en given mængde af sukker, som igen er vejledende af insulinsekretion og insulin effekt. Forskelle i serum insulin niveauer udgør ofte ændret glukosetolerance. Derfor, GTT er blevet en af de mest udbredte fysiologiske tests til at karakterisere musemodeller af diabetes og fedme. Da ipGTT er en hurtig og nem tilgang, kan det bruges i fremtidige undersøgelser som en standardiseret metode til at analysere effekten af kost og/eller behandling på stofskiftet.
Ændringer og fejlfinding: The GTT udføres rutinemæssigt efter en overnatning hurtigt at udligne blod glucose niveauer i mus20. Da varigheden af de fastende periode har en stærk indvirkning på de undersøgte parametre og er bør derfor af stor betydning for sammenligning og fortolkning af resultaterne, den fastende periode tilpasses til alderen og kropsvægt af mus. Under hensyntagen til at mus er natdyr og to-tredjedele af de samlede daglige fødeindtagelse forbruges natten, provokerer overnight fastende en kataboliske stat. Således, tidspunkt for indledning og varigheden af fastende har en yderst relevant indvirkning på resultaterne, og dermed disse parametre skal være standardiserede12. Desuden, langvarig faste udtømmer lever glykogen butikker og derfor reducerer variabilitet i baseline blodglukose. Til sidst, da insulin-stimuleret glukose udnyttelse i mus er forbedret efter langvarig faste perioder21, en 5-6 timers fastende varighed anbefales at vurdere insulin handling; mens natten fastende er tilstrækkelig til at teste glukose udnyttelse12,20,22. Glucose er normalt administreres via i.p. injektion og dosis af glukose er justeret til kroppens vægt (som regel 1 eller 2 g/kg kropsvægt)20,22. I DIO modeller, er kropsvægt øget, primært på grund af en højere fedtmasse; glukoseoptagelse, dog opstår overvejende i muskel, hjernen og leveren. Da mængden af disse væv ikke er generelt ændret af DIO, modtage overvægtige mus en uforholdsmæssig stor mængde af glukose i forhold til lean mus, som igen kan påvirke fortolkningen af data og føre til en fejldiagnosticeret glukose intolerance22 . Af denne grund, fastende perioder skal være standardiseret og kropssammensætning skal blive betragtet under fortolkning af GTT resultater23. Derfor, computertomografi (CT) eller magnetisk resonans imaging(MRI) scanninger er gældende. For eksempel glukose målinger taget af håndholdte hele-blodsukker skærme (Se Tabel af materialer) er tilgængelige, og disse skærme er mere almindeligt anvendt end plasma glukose analysatorer. På grund af den lille blod diskenheder kræves - typisk 5 µL eller mindre - de er mere praktiske end plasma analysatorer.
Begrænsninger af teknikken: fastende mus udstille afhængighed af varigheden af fastende og vise et betydeligt tab i kropsvægt, kropstemperatur, blodvolumen, og puls samt ændringer i serum parametre, som frie fedtsyrer niveauer og ketonstoffer 24. denne metabolisk stress udløses af, at boliger temperatur af mus i animalsk faciliteter er standardiseret til ca 23 ° C, og er derfor under deres thermo-neutral temperatur på 30 ° C25. Langvarig fastende på subthermo-neutral temperaturer kan resultere i døs, karakteriseret ved et fald af stofskiftet26,27.
Kritiske trin i protokollen: som nævnt ovenfor, til pålidelige resultater mellem den eksperimentelle og kontrolgrupper, littermates bruges fortrinsvis i undersøgelse og faste perioder, og tidspunkter skal standardiseres.
Lunge funktion analyse
I denne protokol måler plethysmograph direkte trykændringer, der kører respiration, og de deraf følgende strømme ind og ud af luftvejene. Strømme er målt ved en pneumotachograph beliggende i væggen af plethysmograph. Og for at udelukke modstand fra brystvæggen, luftvejene åbne pres (mund pres) og transpulmonary (esophageal tube) pres måles luftveje modstand og dynamic overholdelse beregnes. Dynamisk overholdelse er beregnede via forskellen af den minimale og maksimale lungen mængde opdelt gennem strømmen.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder og fremtidige programmer: Plethysmography er den normale procedure for at analysere de mekaniske egenskaber af lungerne, og kan derfor, bruges i fremtidige undersøgelser til at analysere lunge patologi og behandling muligheder. For at sammenligne grupper og undersøgelser, er en standardiseret tilgang uundværlig.
Ændringer og fejlfinding: I almindelighed, denne teknik kan klassificeres som uhæmmet og behersket hele kroppen plethysmography. Uhæmmet metoder bestemme forbedret pause (Penh) og aktiverer analyse af normal vejrtrækning mønstre, mens tilbageholdende, invasive metoder direkte måle trykket, flow eller volumen. Lunge mekaniske egenskaber er bestemt af modstand og elastance; mens modstanden beregnes som forholdet mellem presset for at strømmen, afspejler elastance forholdet mellem tryk-volumen28. Derimod uhæmmet hele kroppen plethysmography kun måle trykket inde i plethysmograph, og derfor en beregning af modstand og elastance er umuligt. I 2007, har Lundblad et al. oplyste at Penh er ikke den rigtige parameter til at måle airway modstand, men repræsenterer en uspecifik afspejling af vejrtrækning mønster29. Således til korrekt vurdering af lunge mekanik er invasive plethysmography uundværlig29,30,31.
Da vejrtrækning parametre afhænger af alder og størrelse af mus, skal ventilation parametre justeres. For eksempel, tidalvolumen er relateret til kropsvægt og skal være indstillet til 10 µL/g kropsvægt med en vejrtrækning frekvens på 120-250 vejrtrækninger pr. minut. Når du justerer disse parametre, bør investigator tage i betragtning, at den gennemsnitlige tidalvolumen er omvendt relateret til respiratorisk frekvens32. Da spontan vejrtrækning påvirker trykket, flow og volumen, dybde af anæstesi skal overvåges og ventilation kurver skal overholdes konstant. Anæstesi, selv kan direkte negativt påvirker lungefunktion. For eksempel, beskytter Propofol og ketamin dels mod induceret luftvejs konstriktion i forhold til Thiopental33. Derudover har kliniske undersøgelser vist, at Ketamin har en antikolinerge effekt og kan bruges som en potentiel bronkodilatator i svær astma34. Halogenerede gasanæstetika, såsom isofluran i forbindelse med smertebehandling, betragtes som en kontrollerbar alternativ til injektion anæstesi; dog, luftvejene irritation efter flygtige anæstetika er rapporteret og derfor udelukker indånding anæstetika som en alternativ35.
Begrænsninger af teknikken: de beherskede invasiv metode til at måle lunge mekaniske egenskaber skyldes den nødvendige tracheotomi, en afsluttende procedure, og derved begrænser undersøgelsen til en single-point analyse, uden mulighed for at undersøge sygdommen progression. For at reducere niveauet af invasiv, kan måling af overførsel impedans i bevidst dyr udføres, hvilket dermed gør det muligt for longitudinelle studier. Men når du måler respiratorisk mekanik i ikke-tracheotomized dyr, modstanden i næsen bidrager til den samlede respiratoriske modstand, og komplicerer dermed målinger efter methacholine provokation13.
Kritiske trin i protokollen: her vi viser kun én metode til invasiv lungefunktion. Da flere etablerede invasive lunge funktion metoder findes, standardisering inden for undersøgelserne og en detaljeret beskrivelse af metoden, der anvendes, grupper, og et bedøvelsesmiddel regime i publikationer er nødvendigt at sammenligne studier.
Lunge excision for histomorphometric analyse
Betydning med hensyn til eksisterende metoder og fremtidige anvendelser: kvantitative histomorphometric analyse kan bruges til at undersøge virkningerne af fedme på lunge struktur (bronkier og alveolerne), til at fortolke resultaterne af invasive plethysmography, og til at undersøge mulige behandlingsmuligheder på pulmonal resultatet. Data fra histologiske vurderinger kan variere afhængigt af Fikseringsvæske agenter og den anvendte fiksering procedure. Da det har vist at fedme har en effekt på alveolær og bronchiale struktur, som godt som ekstracellulære matrix og cellulære sammensætning, er det nødvendigt at fastlægge en passende teknik baseret på problemformulering i fremtidige undersøgelser. For uvildig kvantitative morfometri, væv behandling efter fiksation bør udføres efter normer for den amerikanske thorax samfund (ATS) / europæiske Respiratory Society (ERS) til kvantitativ vurdering af lungen struktur14 .
Ændringer og fejlfinding: I 2010 Hsia et al. præsenteret en officiel udtalelse af ATS/ERS fastsættelse af standarder for kvantitativ vurdering af lunge-struktur, som bør tages i betragtning forud for lunge isolation og fiksering 14. ved siden af intratrakeal instillation af fikseringsmidler, i situ fiksering, fast volumen fiksation eller vakuum inflation kan udføres for at puste pulmonal væv36. Inflation, og dermed luftrum udvidelsen, er afhængig af fiksering procedurer og kvalitet af pres under fiksering. Højt tryk, for eksempel, kan føre til alveolær væg brud og dermed påvirke resultatet. Svarende til parametrene ventilation, ideel fiksering parametre afhænger af alder, størrelse og fænotype af mus. Fiksering kan opnås af kemiske eller fysiske metoder, herunder kemiske agenser og/eller kryopræservering. Intratrakeal instillation af egnet fikseringsmidler efterligner væv inflation i løbet af vejrtrækning, afspejler i vivo betingelser, og derfor er udbredte37. 20-25 cm over det højeste punkt i lungen anbefales for tilstrækkeligt pres, ved hjælp af en bred og korte slange til at give hurtig og ensartet penetration14. Et vigtigt mål for fiksering er at forhindre degeneration proces og at bevare celler og væv i en "liv-lignende tilstand", samtidig med at den arkitektoniske integritet af lunge parenkym. Derudover skal væv bevare sin reaktivitet antistoffer, pletter og nukleinsyre sonder. Udover normal autolysis virkning, bivirkninger af væv behandling, herunder infiltration med varm voks, udskæring, og dewaxing, skal forebygges. Valget af fiksativ og videreforarbejdning af væv, fx via indlejring, kan forårsage væv svind, hævelse, og hærdning af forskellige komponenter og føre til artefakter, såsom øget autofluorescence38. For eksempel fiksering i 10% buffered formalin og yderligere behandling kan forårsage svind af op til 20% - 30% i forhold til første bind39. Derfor, Hsia et al. i deres 2010 konsensus papir af ATS/ERS anbefaler brugen af 2,5% glutaraldehyd bufferet med osmium dinitrogentetraoxid og uranyl acetat at undgå væv svind. Lunge volumen, interne arkitektur, væv fine struktur og celle struktur blev bevaret efter luftvejene instillation af denne Fikseringsvæske reagens14. Denaturering af proteiner og cross-link dannelse er to store mekanismer, som er vigtige i fiksering af væv. Tørring forbindelser eller koaguleringsmidler, såsom alkohol eller acetone, forårsage denaturering af proteiner, hvilket resulterer i ændringer af tertiære protein struktur af destabiliserende hydrofobe bindinger. Non-koagulant fastsættelse agenter som PARAFORMALDEHYD eller glutaraldehyd reagerer kemisk med proteiner og form mellem molekylære og intra molekylære cross-links. Da flere farvning procedurer, såsom hæmatoxylin og eosin pletter, afhængige Inter molekylære interaktioner, kan farvning resultater være fattige, afhængigt af den Fikseringsvæske agent. Antigen-hentning metoder i Immunhistokemi har vist, at nogle af reaktionerne af fiksering er reversible, især dem af formaldehyd40.
Begrænsninger af teknikken: da alveolær overflade foring er fjernet ved intratrakeal instillation af fikseringsmidler fortolkning af, fx alveolær mikroarkitektur, Slim ophobning, eller inflammatoriske celle migration kan manipuleres 41 , 42 , 43.
Kritiske trin i protokollen: her viser vi intratrakeal instillation af 4% PFA som en bred tilgang til at visualisere effekten af fedme på pulmonal resultater. Som nævnt ovenfor, skal protokollen ændres afhængigt af problemformulering, ifølge ATS/ERS henstillinger14.
Ud over de tidligere nævnte parametre er stress en væsentlig faktor påvirker forskningsresultater. Derfor uddannelse både mus og videnskabsmanden er uundværlig. Mus bør tilpasses fastholdende og skal overføres til den eksperimentelle område under rolige forhold44. Stress påvirker stofskiftet, fx som følge af stress hormon frigivelse, frigivne glucose niveauer er steget, en effekt, der kan mistolkes som nedsat glukosetolerance. Stress hormon frigivelse også ændrer modtageligheden for bedøvende medicin, specielt, dosis af anæstetika øges og tid til at nå kirurgisk tolerance er forlænget. Som nævnt, kan den øgede mængde af anæstetika påvirke bronchoconstriction, mens stress, selv kan forårsage bronchiale dilatation.
I Resumé indeholder denne artikel tre metoder til at vurdere virkningerne af fedme og metabolisme på lunge struktur og funktion i mus. Alle nævnte metoder kan overføres til andre sygdomsmodeller og gnaver arter, såsom fedme skyldes genetiske modifikationer eller rotte modeller. Anvendelsen af disse teknikker kan være nyttigt at definere nye molekylære mekanismer i DIO modeller med bestemte gen ablation eller teste nye terapeutiske tilgange for at behandle/forebygge de negative virkninger af fedme på kroniske lungesygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forsøgene blev støttet af Marga og Walter Boll-Stiftung, Kerpen, Tyskland; Projekt 210-02-16 (MAAA), projekt 210-03-15 (MAAA) og af den tyske Forskningsfonds (DFG; AL1632-02; MAAA), Bonn, Tyskland. Center for Molekylær medicin Köln (CMMC; Universitetshospital Köln; Karriere avancement Program; MAAA), Köln formue (fakultetet for medicin, universitetet i Köln; KD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GlucoMen LX | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 38969 | blood glucose meter |
| GlucoMen LX Sensor | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 39765 | Test stripes |
| Glucose 20% | B. Braun, Melsung, Germany | 2356746 | |
| FinePointe Software | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-002 | |
| FinePointe RC Single Site Mouse Table | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-001 | |
| FPRC Controller | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1075-001 | |
| FPRC Aerosol Block | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1106-001 | |
| Aerogen neb head-5.2-4um | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-2306-001 | |
| Forceps | FST, British Columbia, Canada | 11065-07 | |
| Blunt scissors | FST, British Columbia, Canada | 14105-12 | |
| Micro scissors | FST, British Columbia, Canada | 15000-00 | |
| Perma-Hand 4-0 | Ethicon, Puerto Rico, USA | 736H | Surgical suture |
| Roti-Histofix 4% | Roth | P087.1 | 4% Paraformaldehyd |
| Ketaset | Zoetis, Berlin, Germany | 10013389 | Ketamine |
| Rompun 2% | Bayer, Leverkusen, Germany | 770081 | Xylazine |
References
- Kelly, T., Yang, W., Chen, C. S., Reynolds, K., He, J. Global burden of obesity in 2005 and projections to 2030. Int J Obes (Lond). 32, 1431-1437 (2008).
- Freemantle, N., Holmes, J., Hockey, A., Kumar, S. How strong is the association between abdominal obesity and the incidence of type 2 diabetes? International journal of clinical practice. 62, 1391-1396 (2008).
- Wassink, A. M. J., et al. Waist circumference and metabolic risk factors have separate and additive effects on the risk of future Type 2 diabetes in patients with vascular diseases. A cohort study. Diabetic Medicine. 28, 932-940 (2011).
- Oktay, A. A., et al. The Interaction of Cardiorespiratory Fitness with Obesity and the Obesity Paradox in Cardiovascular Disease. Progress in cardiovascular diseases. , (2017).
- Azamar-Llamas, D., Hernandez-Molina, G., Ramos-Avalos, B., Furuzawa-Carballeda, J. Adipokine Contribution to the Pathogenesis of Osteoarthritis. Mediators Inflamm. 2017, 5468023 (2017).
- Koenig, S. M. Pulmonary complications of obesity. The American journal of the medical sciences. 321, 249-279 (2001).
- Stunkard, A. J. Current views on obesity. The American journal of medicine. 100, 230-236 (1996).
- Murugan, A. T., Sharma, G. Obesity and respiratory diseases. Chron Respir Dis. 5, 233-242 (2008).
- Zammit, C., Liddicoat, H., Moonsie, I., Makker, H. Obesity and respiratory diseases. International journal of general medicine. 3, 335-343 (2010).
- Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).
- McArdle, M. A., Finucane, O. M., Connaughton, R. M., McMorrow, A. M., Roche, H. M. Mechanisms of obesity-induced inflammation and insulin resistance: insights into the emerging role of nutritional strategies. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 52 (2013).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease models & mechanisms. 3, 525-534 (2010).
- Bates, J. H., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J Appl Physiol. 94 (1985), 1297-1306 (2003).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- Heydemann, A. An Overview of Murine High Fat Diet as a Model for Type 2 Diabetes Mellitus. Journal of diabetes research. 2016, 2902351 (2016).
- Asha, G. V., Raja Gopal Reddy, M., Mahesh, M., Vajreswari, A., Jeyakumar, S. M. Male mice are susceptible to high fat diet-induced hyperglycaemia and display increased circulatory retinol binding protein 4 (RBP4) levels and its expression in visceral adipose depots. Archives of physiology and biochemistry. 122, 19-26 (2016).
- Jovicic, N., et al. Differential Immunometabolic Phenotype in Th1 and Th2 Dominant Mouse Strains in Response to High-Fat Feeding. PLoS One. 10, e0134089 (2015).
- Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to Background Strain Is Essential for Metabolic Research: C57BL/6 and the International Knockout Mouse Consortium. Diabetes. 65, 25-33 (2016).
- Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, E15-E26 (2008).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of lipid research. 46, 582-588 (2005).
- Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Current protocols in molecular biology. Chapter 29, Unit 29B.23 (2007).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E849-E855 (2009).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
- Lodhi, I. J., Semenkovich, C. F. Why we should put clothes on mice. Cell Metab. 9, 111-112 (2009).
- Swoap, S. J., Gutilla, M. J., Liles, L. C., Smith, R. O., Weinshenker, D. The full expression of fasting-induced torpor requires beta 3-adrenergic receptor signaling. J Neurosci. 26, 241-245 (2006).
- Geiser, F. Metabolic rate and body temperature reduction during hibernation and daily torpor. Annu Rev Physiol. 66, 239-274 (2004).
- Mead, J. Mechanical properties of lungs. Physiological reviews. 41, 281-330 (1961).
- Lundblad, L. K., Irvin, C. G., Adler, A., Bates, J. H. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J Appl Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Lundblad, L. K., et al. Penh is not a measure of airway resistance! Eur Respir J. 30, 805 (2007).
- Adler, A., Cieslewicz, G., Irvin, C. G. Unrestrained plethysmography is an unreliable measure of airway responsiveness in BALB/c and C57BL/6 mice. J Appl Physiol. 97, 286-292 (2004).
- Fairchild, G. A. Measurement of respiratory volume for virus retention studies in mice. Applied microbiology. 24, 812-818 (1972).
- Brown, R. H., Wagner, E. M. Mechanisms of bronchoprotection by anesthetic induction agents: propofol versus ketamine. Anesthesiology. 90, 822-828 (1999).
- Goyal, S., Agrawal, A. Ketamine in status asthmaticus: A review. Indian journal of critical care medicine: peer-reviewed, official publication of Indian Society of Critical Care Medicine. 17, 154-161 (2013).
- Doi, M., Ikeda, K. Airway irritation produced by volatile anaesthetics during brief inhalation: comparison of halothane, enflurane, isoflurane and sevoflurane. Canadian journal of anaesthesia = Journal canadien d'anesthesie. 40, 122-126 (1993).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 299, L843-L851 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 516-527 (1982).
- Rolls, G. Process of Fixation and the Nature of Fixatives. , (2017).
- Winsor, L. Tissue processing. Laboratory histopathology. Woods, A., Ellis, R. , 4.2-1-4.2-39 (1994).
- Histochemistry, theoretical and applied. Pearse, A. , Churchill Livingstone. London. (1980).
- Weibel, E. R. Morphological basis of alveolar-capillary gas exchange. Physiological reviews. 53, 419-495 (1973).
- Bur, S., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Lung fixation by airway instillation: effects on capillary hematocrit. Experimental lung research. 9, 57-66 (1985).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 528-533 (1982).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary topics in laboratory animal science. 43, 42-51 (2004).
