Summary
Распространенность ожирения растет и увеличивает риск развития хронических заболеваний легких. Для установления основных механизмов и превентивных стратегий, четко определенных животных необходимы модели. Здесь мы предоставляем три метода (тест на переносимость глюкозы, тело плетизмографии и легких фиксации) изучить влияние ожирения на легочных исходов у мышей.
Abstract
Ожирение и респираторных заболеваний являются серьезные проблемы со здоровьем. Ожирение становится новой эпидемии с ожидаемое количество тучных людей во всем мире более 1 миллиарда к 2030 году, таким образом представляя растущее социально-экономическое бремя. Одновременно связанных с ожирением сопутствующих заболеваний, включая диабет, а также сердце и хронические заболевания легких, постоянно находятся на подъеме. Хотя ожирения был связан с повышенным риском для обострений астмы, обострение респираторных симптомов и плохого управления, функциональная роль ожирения и возмущенных метаболизма в патогенезе хронического заболевания легких часто недооценивается, и глубинные механизмы остаются недостижимой. Эта статья стремится представить методы для оценки влияние ожирения на метаболизм, а также легких структуры и функции. Здесь мы опишем три техники для исследования мышей: (1) Оценка внутрибрюшинного глюкозе (ipGTT) для анализа влияния тучности на метаболизм глюкозы; (2) измерение сопротивления дыхательных путей (Res) и дыхательной системы соблюдения (Cdyn), чтобы проанализировать влияние ожирения на легочную функцию; и (3) подготовка и фиксации легких для последующего гистологического количественной оценки. Связанных с ожирением легочных заболеваний, вероятно многофакторного, вытекающих из системных воспалительных и метаболических регуляции, которые потенциально негативно влияют на функцию легких и ответа на терапию. Таким образом важно стандартизированной методологии для изучения молекулярных механизмов и эффект Роман лечения.
Introduction
По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в 2008 году, более чем 1,4 миллиарда взрослых, в возрасте 20 лет и старше, имели избыточный вес с индексом массы тела (ИМТ) больше или равен 25; Кроме того, более чем 200 миллионов мужчин и женщин почти 300 миллионов были ожирением (BMI≥30)1. Ожирение и метаболического синдрома являются основными факторами риска для множества заболеваний. При ожирении и соответствующее увеличение белой жировой ткани массового был тесно связан с тип 2 диабет2,3, сердечно сосудистые заболевания, в том числе ишемической болезни сердца (ИБС), сердечная недостаточность (ВЧ), фибрилляции4 и артроз5, их функциональной роли в патогенезе респираторных расстройств остаются плохо понимали. Однако эпидемиологические исследования показали, что ожирение является прочно ассоциируется с хронической дыхательной условий, включая напряжения одышка, синдром обструктивного апноэ сна (OSAS), ожирение гиповентиляции синдром (СГЯ), хронический обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), легочная эмболия, аспирационной пневмонии и бронхиальной астме6,,78,9. Потенциальные механизмы увязки ожирения и возмущенных метаболизма, например, сопротивление инсулина и тип диабета II, в патогенезе хронического заболевания легких не только включают механические и физические последствия вес но также получить на вентиляции вызвать хронические подострых воспалительных состояние10,11. Рост ожирения и легочных заболеваний в течение последнего десятилетия, в сочетании с отсутствием эффективных превентивных стратегий и терапевтических подходов, подчеркивает необходимость изучения молекулярных механизмов определить новые пути для управления связанных с ожирением легких заболевания.
Здесь мы опишем три стандартных тестов, которые являются важные основы для расследования ожирения и его влияние на легких структуры и функции в модели мыши: (1) внутрибрюшинного глюкозы терпимости (ipGTT) (2) измерение сопротивления дыхательных путей (Res) и дыхательных системы соблюдения (Cdyn); и (3) подготовка и фиксации легких для последующего гистологического количественной оценки. IpGTT-это надежный скрининг-тест на поглощение глюкозы мера и, таким образом, влияние ожирения на метаболизм. Простота метода позволяет хорошо стандартизации и поэтому сопоставимости результатов между лабораториями. Более сложные методы, такие как гипергликемической зажимы или исследования на изолированных островков, может использоваться для подробного анализа метаболического фенотипа12. Здесь мы оценить толерантности к глюкозе для определения ожирения связанные состояния системных и метаболические расстройства как основу для дальнейших исследований на легких решений. Чтобы оценить влияние ожирения и метаболических расстройств на легочную функцию, мы измерили сопротивление дыхательных путей (Res) и дыхательной системы соблюдения (Cdyn). Охарактеризовать болезнь легких, безудержный, равно как и сдержанной методы для оценки функции легких доступны. Безудержный плетизмографии в свободно перемещающихся животных имитирует естественное состояние, отражающие дыхание моделей; в отличие от этого инвазивные методы, такие как измерение входной импеданс Res и cDyn в глубоко осознающие мышей для оценки динамических легких механики, являются более точным13. Так как хронических респираторных заболеваний, отражены в гистологических изменений в легочной ткани, надлежащего легких фиксации для дальнейшего анализа является неизбежной. Выбор метода фиксации ткани и подготовки зависит от отсека легких, которые будут изучены, например, проведение airways или паренхимы легких14. Здесь мы описываем метод, который позволяет качественной и количественной оценки проведения дыхательных путей для изучения влияния тучности на развития астмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные процедуры были проведены в соответствии с протоколами, утвержденными органами местного самоуправления (Земля NRW, AZ: 2012.A424) и были в соответствии с немецкой животных закона и положений о благополучии животных, используемых для экспериментов или другие научные цели. Поскольку анализ функции легких может повлиять на структуру легких и поэтому последующего гистологического анализирует, измерение Res и Cdyn подготовки и фиксации легких для histomorphometry должны выполняться в разных животных. Однако измерение Res и Cdyn, после ipGTT возможна. Поскольку стресс во время ipGTT может мешать анестезии, необходимых для функции легких испытаний, восстановительный период примерно 2 недели после ipGTT рекомендуется разрешить мышей, чтобы оправиться от потери веса тела и изменения в крови параметры12.
1. Подготовка внутрибрюшинного тест на переносимость глюкозы (ipGTT)
Примечание: После 12 h поста, полный ipGTT занимает приблизительно 2Н.
- Поскольку стресс влияет на уровень глюкозы в крови значительно, обеспечить выполнение обоих адаптация мышей, а также подготовки ученого.
- Трансфер животных в области экспериментальных условиях тихо и без стресса.
- Рассмотрим приложение продажи диета чтобы вызвать ожирение у мышей. Смотрите секцию обсуждения для дальнейших консультаций.
- Быстрый животных для 12 h ночь, без ограничения доступа к воде. На следующий день, после того, как 12 h поста, подготовить крови глюкозы метр по заявлению производителя в протокол (см. таблицу материалов), вставив новый тест-полоску в порт полосы теста.
- Надрезать кончик хвоста, используя стерильными ножницами, бережно сохраняя указатель мыши на его хвост и сразу же измерить постились крови глюкозы, применяя сыпучих капли крови (минимальный пример размер 0,5 мкл) к испытательной полосы крови глюкозы метр.
Примечание: Таймер запускается на экране после достаточного применения образца крови. После 4 s, на экране отобразится результат теста. - Впоследствии взвесить и этикетки индивидуально с помощью цвета маркировки животных.
- Управление 2 g глюкозы/кг тела вес через внутрибрюшинной инъекции. Убедитесь, что объем впрыска 0,1 мл/10 g вес тела (27 G шприцев и игл 1 cc).
- Впоследствии измерения глюкозы в крови после 15, 30, 60 и 120 мин, применяя капли крови свободной на новой тест-полоски.
Примечание: Поток крови может быть увеличена нежный массаж кончик хвоста-подопечных. Если рана хвост encrusts, очистите его с помощью стерильный тампон, смоченный раствором натрия хлорида 0,9%. - Разрешить животных на отдых в их дома клетки с неограниченным доступом к воде между измерениями.
2. легких функция анализа для измерения Res и cDyn
Примечание: Для ненарушенных измерения Res и cDyn, мышей должны вентилироваться глубокую анестезию. Стресс свободной животных обработки и надлежащего мониторинга анестезии. Общие инструкции с использованием стерильных методов пожалуйста ознакомьтесь со статьей по Hoogstraten-Miller et al. 15
- Калибровки плетизмограф до каждого ряда экспериментов и подготовить исследование параметров в рамках программного обеспечения (см. Таблицу материалы).
- До операции, глубоко анестезировать животных через внутрибрюшинной инъекции Ксилазина (10 мг/кг массы тела) и кетамин (100 мг/кг веса тела) (27 G шприцев и игл 1 cc). Убедитесь, что объем впрыска 0,1 мл/10 грамм веса тела.
Примечание: Так как кетамин имеет надлежащего обезболивающий эффект в мышей, без дополнительных боль лечение является необходимым. Инвазивные трахеи катетер/плетизмограф процедура занимает приблизительно 5-7 минут, затем можно начать сбор данных. - Поместите указатель мыши в лежачем положении на грелку для поддержания температуры тела.
- Покрытия глаза с мазь для предотвращения сухости под наркозом.
- Постоянно контролировать глубины анестезии с помощью ног Пинч ответ.
Примечание: Дополнительного администрирования анестезии могут быть необходимы для поддержания хирургической плоскости анестезии. - Смочите мех хирургические области в регионе щитовидной железы с 70% этиловом спирте.
- Тщательно надрезать кожу в средней линии для примерно 1 см между шейный вырез грудины и клубней symphyses mentum, подняв ее с щипцами и обрезки кожи под визуальный осмотр, тупыми ножницами (рис. 1A).
- Визуализация базовых подкожной жировой клетчатки и щитовидной железы.
- Разоблачить трахеи тщательно тупым разделив обе щитовидной лопастями на перешейке и вскрытие sternothyroid и sternothyroid мышцы (рис. 1B). Будьте осторожны, чтобы не повредить любых судов и вызвать кровотечение, так как это может вызвать неблагоприятное воздействие на сердечно-сосудистой системы и в конечном итоге на измерениях.
- Впоследствии пройти 4-0 плетеные шовного между трахеи и пищевода, используя тупой щипцами. Тщательно надрезать трахеи недалеко от гортани между хрящи трахеи с микро ножницами.
- Интубации трахеи трубка (0,04 дюйма/1,02 мм диаметром) под визуальным контролем (рис. 1 c). Закрепите трубку через перевязки с шовного во избежание любой утечки в системе.
- Далее переместите животное с подогревом кровати тело камеры и подключите трахеи трубку к лицевой (рис. 1 d) и включите вентиляции, нажав кнопку вентиляции на передней панели контроллера (Рисунок 1E).
- Обследование вентиляции, наблюдая за движением грудной клетки одновременно с интенсивность вентиляции. Подтверждение правильного размещения трахеи трубку, чтобы одновременно переместить обе стороны грудной клетки.
- Смотреть давления сигнала на экране компьютера (Рисунок 1F). Обеспечить равномерное вентиляции кривых. Если это не так, отсоединить животного и проверьте на стороне операции. Остерегайтесь крови или слизь блокирует трахеи трубку.
Примечание: Для взрослых животных с массой тела 20-25 г, вентилятора настройки, как показано на рисунке 2 предложил в соответствии с рекомендациями производителя. - Для управления изменениями в транс легочного давления во время вентиляции, вставьте пищевода на глубине, что приближается уровни легких пищевода трубки (0,04 дюйма/1,02 мм в диаметре). Смотрите экрана при размещении трубки. Поместите трубки, где максимальное давление прогиб и минимальным сердце артефакты можно увидеть на экране.
- После операции готовить животных для измерения. Reinject анестезии через внутрибрюшинной инъекции кетамин (100 мг/кг массы тела) с помощью 27 G шприцев и игл 1 cc. Убедитесь, что объем впрыска 0,1 мл/10 грамм веса тела.
Примечание: Для оценки бронхиальной hyperreagibility, распылять метахолином, неселективной мускариновых рецепторов агонистов парасимпатической нервной системы, которая вызывает бронхоспазма. Сбор данных выполняется в четыре различных этапа (рис. 3). - Начало сбора данных по протоколу manufacturer´s.
Примечание: Программное обеспечение автоматически направляет пользователей с помощью процесса приобретения. - Применить 10 мкл PBS (автомобиль) на распылитель и начать распыления после 5 минут адаптационного. Далее выполните фазу реакции 3 мин, где измеряются Res (cmH2O/мл/сек) и cDyn (мл/КМЗ2O). В конце представить животное до следующего распыления этап восстановления 3 мин.
- Следуйте программного обеспечения путем поэтапного применения 10 мкл увеличения концентрации метахолином (2,5 мкг/10 мкл, 6.25 мкг/10 мкл и 12,5 мкг/10 мкл) на вентилятор.
- После того как все измерения были выполнены и записано, жертву животное, шейки матки дислокации.
3. легких изоляции для количественного анализа Histomorphometric взрослых мышей
- Глубоко анестезировать животных через внутрибрюшинной инъекции Ксилазина (10 мг/кг массы тела) и кетамин (100 мг/кг веса тела) (27 G шприцев и игл 1 cc). Объем впрыска должно быть 0,1 мл/10 грамм веса тела.
Примечание: После достижения состояния хирургического терпимости, подготовка занимает примерно 5 минут, затем перфузии органов и 30 минут для фиксации. - Как только животное достиг состояния хирургического терпимости (отрицательный мыс Пинч ответ), лечить животное с 70% этанола и исправить животное на площадку с хирургическая лента.
- Жертву животное сердечной прокол и кровотечение. Вкратце откройте живота с медиальной разрез через кожу и брюшины, тупыми ножницами.
- Найдите диафрагмы головы палаты печени и осторожно отделить печени от диафрагмы.
- Сделать небольшой надрез в диафрагмы, тупыми ножницами, и пунктата левого желудочка сердца с иглой 20 G придает шприц 2 мл. Медленно exsanguinate животное.
Примечание: Медленно и тщательно обескровливания имеет важное значение для предотвращения желудочков, рушится из-за отрицательного давления, ингибирующих спокойно кровообращение. - Вскрыть легких, открыв грудной клетки мягко через парастернальной разрез вдоль всей длины грудной клетки, изогнутые, тупыми ножницами.
- Впоследствии Поднимите грудную клетку подвергать плевральной полости (рис. 3 c). Удаление тимуса, чтобы увидеть сердце и легкие.
Примечание: Возможен дополнительный впрыск правого желудочка, следуют кровоснабжения легких сосудистой системы с ледяной PBS и затем раствором фиксирующие [например, параформальдегида 4% (масса/объем) (PFA)]. Имейте в виду, что существует повышенный риск разрыва альвеолярного септы и отрицательно сказаться на легких структуры, с помощью этого метода. - Вскрыть легкого сначала тщательно удаление сердце.
- Впоследствии пройти 4-0 плетеные шовного между трахеи и пищевода, используя тупой щипцами.
- Далее, тщательно надрезать трахеи недалеко от гортани между хрящи трахеи, интубации с внутривенной канюли (26 G) и надуть легких путем фиксации давления при постоянном давлении 20 см H2O с помощью фиксирующие агента [например, 4% (масса /Volume) PFA].
- Для фиксации PFA оставьте фиксатором для 30 мин при комнатной температуре. Впоследствии перевязать трахеи и удалить канюлю. Затем тщательно акцизных легких не повреждая ткани и хранить его в фиксирующие агента при температуре 4 ° C на ночь.
Примечание: Кроме того, согласно САР/ETS консенсуса документ 2,5% GA буферизации OsO4, урацила решение используется для стабилизации надлежащего ткани. Для дальнейшей подготовки ткани обратитесь к документу консенсус по Hsia et al. 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель результаты теста на толерантность внутрибрюшинного глюкозы (ipGTT) (рис. 4), легких функция тест (Рисунок 5) и представитель изображениями иллюстрирующие гематоксилином и эозином витражи легких (рис. 6).
IpGTT была исполнена в ожирением мышей (синий) после 7 недель высоких жиров (HFD). Стандартный диета кормили мышей, служил в качестве контроля (черный). Ожирением мышей показало увеличение сыворотке глюкозы уровнях 15 и 30 мин после инъекции внутрибрюшинного глюкозы, указанием снижается усвоение сотовой глюкозы (рис. 4).
Изучить влияние ожирения на легочную функцию, был проведен анализ функции инвазивных легких ожирением мышей (синий) после 7 недель высоких жиров (HFD). Ожирением мышей показало увеличение до 1,5 раза сопротивления дыхательных путей, по сравнению с управления мыши (черный) (Рисунок 5).
Чтобы визуализировать эффект фиксации давления во время трахею инстилляции фиксативов на паренхиму легких, представитель изображения гематоксилином и эозином, окрашенных легких разделы отображаются (рис. 6). Слишком мало давления приводит к несколько ООН завышенные районы, толстые септы альвеол и многоугольной формы альвеолы (A), при слишком много давления приводит к чрезмерно завышенным эмфиземы как районы с разрушение альвеолярных септы (C). Применение соответствующего давления во время фиксации легких приводит к полностью завышенным легких с круглой формы альвеолы (B).
Рисунок 1: Схематическое представление инвазивных легочной функции. (A-C) Шаги трахеотомию. (D) подключение животного к лицевой плетизмограф. (E) установка оборудования для инвазивных легочной функции. Скриншот (F) сбора данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: схема сбора данных для оценки бронхиальной hyperreagibility. Сбора данных включает в себя первоначальный адаптационного периода (5 мин), следуют 30 s вещество распыления, 3 мин фазы ответа и 3 минуты восстановления этап предварительного распыления следующего концентрации вещества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Схематическое представление подготовительных шагов. (A-D) Шаги трахеотомию. (A) разрез кожи. (B) Situs грудной полости. (C) вид после удаления грудной клетки. (D) вид после удаления сердца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: тест на переносимость представитель внутрибрюшинного глюкозы (ipGTT). Мышей C57Bl/6Н кормили высоким содержанием жиров диеты для 6-8 недель; мышь управления получил стандартной диете. n = 3; Означать ± SEM; двусторонний теста ANOVA и Бонферрони posttest статистический анализ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: test. функции представителя легких Мышей C57Bl/6Н кормили высоким содержанием жиров диеты для 6-8 недель; мышь управления получил стандартной диете. n = 3; Означать ± SEM; двусторонний теста ANOVA и Бонферрони posttest статистический анализ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: представитель изображения, иллюстрирующие гематоксилином и эозином окрашенных легких. Три различных сорта трахею инфляции: (A) слишком мало давления, соответствующего давления (B) и (C) слишком много давления. МАУ; свернутые области, УВР; завышенные площади; Изображения были взяты под 20 кратным увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Параметры вентилятора | Spalte1 |
| Макс. Ударный объем | 0,25 мл |
| Макс. рот давление | 30cmH2O |
| Глубокая инфляции Макс. объем | 0,5 мл |
| Глубокая инфляции Макс. давление | 30cmH2O |
| Ставка | 160 дыхание в минуту |
Таблица 1: параметры вентилятора для взрослых мышей. Для мелких животных параметры вентиляции должны быть скорректированы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот отчет содержит три протоколы для трех различных методов для анализа влияния тучности на метаболизм глюкозы и легочных исходов. Во-первых тест на переносимость глюкозы дает возможность анализировать внутриклеточных глюкозы и может быть показателем сопротивление инсулина. Во-вторых тело плетизмографии методика измерения функции легких и таким образом полезно для тестирования эффективности Роман лечения. В-третьих стандартизированных фиксации протокол имеет важное значение для количественного морфометрический анализ для оценки влияния тучности на структурные изменения.
Диета индуцированной ожирения в исследования животных
Значение в отношении существующих методов и будущих приложений: чтобы имитировать человека есть привычки, которые приводят к ожирению, диета индуцированной ожирения (DIO) модели широко используются в грызунов. По сравнению с использованием генетически измененных мышей, подражая метаболических заболеваний DIO модели позволяют выполнять анализ этиологии, патологии и будущих вариантов терапии. Недавний обзор, Heydemann et al., обзор моделей разных мышиных высоким содержанием жиров диеты в Диабет исследований16. Конкретные изменения питательных компонентов обеспечивают возможность будущих исследований воздействия на микро - и макро-питательных веществ на молекулярных механизмов ожирения и тем самым на легких структуры и функции.
Модификации и устранение неполадок: различные доклады показывают, что ожирение может быть вызвана различных изменений в составе диетических питательных веществ16, знаний, которая, в свою очередь, привело к разработке различных диет в последние годы, например, диеты с высоким содержанием жиров или углеводов или сочетание обоих диеты, которая является так называемая Западная диета16. В конце концов выбор диеты для исследования зависит от исследования вопроса и цели исследования. Помимо контроля за этими важными факторами, выбор надлежащего управления диета имеет первостепенное значение; в противном случае интерпретация результатов будут ограничены. Тем не менее фенотип вызвано не только тип питания но также в результате кормления периода, пола и мыши штамм17.
Ограничения метода: рядом с состава различных питательных веществ рациона, реакции животного и штамм фона может приходится результаты и фенотип, отмеченные индукции ожирения. Например доказано, что мышей BALB/C более подвержены стеатоз печени, по сравнению с мышей C57Bl/618. Небольшое генетических вариаций, например, из-за генетического дрейфа (C57Bl/6J против C57Bl/6Н), может также повлиять на восприимчивость к тучности19. Это подчеркивает ограничения метода работы с генетически измененных мышей с различными генетический фон штаммов, поскольку даже деформации и поставщика, от которого были получены мышей может повлиять на результаты.
Важнейшие шаги в рамках протокола: для надежных, воспроизводимые и сопоставимых результатов между экспериментальной и контрольные группы, предпочтительно однопометники должны использоваться для создания элемента управления и экспериментальной мышей, экологические факторы и стресс должен быть избегать, и мышь контроля должны быть изучены параллельно с экспериментальной мышей12.
Внутрибрюшинное глюкозы терпимости испытания (ipGTT)
Значение в отношении существующих методов и будущих приложений: чтобы определить влияние Дио на мышиных метаболизма, существуют различные Скрининговые тесты. Консорциум мыши центр метаболического фенотипа (MMPC) была создана предложить стандартные методы для оценки метаболической фенотипов мышей и опубликовал стандартные оперативные процедуры для описания и выполнение метаболических тестов глюкозы гомеостаз в мышей12. ОПС является глобальный подход к измерить, насколько хорошо клетки организма способны поглощение глюкозы после проглатывания определенное количество сахара, который в свою очередь свидетельствует о секреции инсулина и эффект инсулина. Различия в сыворотке крови инсулин уровнях часто приходится изменены глюкозе. Таким образом ГЦГ стал одним из наиболее широко используемых физиологических тестов для характеристики мыши модели сахарного диабета и ожирения. Поскольку ipGTT является быстрый и простой подход, она может использоваться в будущих исследованиях как стандартизированный метод для анализа влияния диеты и/или лечения на метаболизм.
Модификации и устранение неполадок: ГЦГ регулярно проводится после ночи быстро выровнять уровень глюкозы в крови мышей20. Поскольку продолжительность периода голодания имеет сильное воздействие на исследуемых параметров и поэтому большое значение для сравнения и интерпретации результатов, поста период должны быть адаптированы к возрасту и тела вес мышей. Принимая во внимание, что мышей ночных животных и две трети от общего ежедневного рациона питания расходуется на ночь, ночь поста провоцирует катаболических государства. Таким образом точки время начала и продолжительность голодания имеют важное влияние на результаты, и таким образом эти параметры должны быть стандартизированной12. Кроме того длительное голодание истощает печени гликогена и таким образом снижает изменчивость в базовый уровень глюкозы в крови. В заключение поскольку утилизацию глюкозы, инсулина стимулирует мышей усиливается после длительного поста периодов21, 5-6 часов, продолжительность голодания рекомендуется оценить действия инсулина; принимая во внимание, что на ночь поста достаточно для тестирования глюкозы использования12,20,22. Глюкоза является обычно управляемых через инъекции и.п. и дозы глюкозы корректируется на тело вес (обычно вес тела 1 или 2 г/кг)20,22. В модели DIO увеличивается масса тела, главным образом из-за выше жировой массы; поглощение глюкозы, однако, преимущественно происходит в мышцах, мозге и печени. Поскольку количество этих тканей является обычно не изменены DIO, ожирением мышей получают непропорционально высокое количество глюкозы, по сравнению с худой мышей, которые в свою очередь может повлиять на интерпретацию данных и привести к диагноз глюкозе22 . По этой причине голодая периоды должны быть стандартизированы и состава тела необходимо учитывать при интерпретации результатов ГЦГ23. Таким образом компьютерная томография (КТ) и магнитно-резонансная imaging(MRI) сканирование применимы. Например доступны измерения глюкозы ручные цельной крови глюкозы наблюдателей (см. Таблицу материалы), и эти мониторы используются чаще чем анализаторы глюкозы плазмы. Из-за малой кровью тома требуется - обычно 5 мкл или меньше - они более практичным, чем плазма анализаторов.
Ограничения метода: постились мышей экспонат зависимость продолжительности поста и показывают значительную потерю веса, температуры тела, объем крови и сердечного ритма, а также изменения в сыворотке параметров, как уровень свободных жирных кислот и кетоновых тел 24. это метаболический стресс срабатывает тот факт, что жилье температуры мышей в животных зал является стандартным для приблизительно 23 ° C и поэтому ниже их термо нейтральный температуры 30 ° C25. Продолжительного поста subthermo нейтральной температуре может привести к оцепенения, характерно снижение метаболизма26,27.
Важнейшие шаги в рамках протокола: как уже упоминалось выше, для надежных результатов между экспериментальных и контрольных групп, однопометники предпочтительно должны использоваться в периоды голодания и исследования, и моменты времени должны быть стандартизированы.
Анализ функции легких
В этом протоколе плетизмограф непосредственно измеряет изменения давления, которые являются движущей дыхания и результирующая потоки и из дыхательных путей. Потоки измеряются pneumotachograph, расположенный в стене плетизмограф. Чтобы исключить сопротивления из грудной стенки, измеряются сократимость открытия давление (давление рот) и транспульмональной (пищевода трубки) и расчет сопротивления дыхательных путей и динамического соответствия. Динамические соответствия-вычисляемые через разница минимальная и максимальная легких тома разделены через поток.
Значение в отношении существующих методов и будущих приложений: плетизмографии является стандартной процедурой для анализа механических свойств легких и может, таким образом, использоваться в будущих исследований для анализа параметров патологии и лечение легких. Для сравнения групп и исследования, стандартизированный подход является необходимым.
Модификации и устранение неполадок: В целом, этот метод может быть классифицировано как плетизмографии безудержной и сдержанной всего тела. Безудержный методы определяют расширение паузы (Пномпень) и включить анализ моделей нормального дыхания, в то время как сдержанный, инвазивные методы непосредственно измерить давление, поток или тома. Механические свойства легких определяются сопротивления и elastance; в то время как сопротивление рассчитывается как отношение давления потока, elastance отражает отношение давления на объем28. В отличие от безудержной всего тела плетизмографии только измерения давления внутри плетизмографа, и поэтому невозможно вычисление сопротивления и elastance. В 2007 году Lundblad et al. заявили, что Пномпеня не правильный параметр для измерения сопротивления дыхательных путей, но представляет неспецифических отражением шаблон дыхания29. Таким образом для надлежащей оценки механики легких, инвазивные плетизмографии является незаменимым29,30,31.
Так как дыхание параметры зависят от возраста и размера мышей, параметры вентиляции должны быть скорректированы. Например дыхательный объем связанных с веса тела и должно быть присвоено 10 мкл/г веса тела с частотой дыхания 120-250 вдохов в минуту. Настраивая эти параметры, следователь следует учитывать, что средняя дыхательный объем пропорционален частота дыхания32. Так как спонтанное дыхание влияет на давление, интенсивность и объем, глубина анестезии должен контролироваться и вентиляции кривые должны соблюдаться постоянно. Однако анестезии, сама может непосредственно повлиять на функции легких. К примеру пропофола и кетамин частично защищают от индуцированного дыхательных путей сужения, по сравнению с тиопентал33. Кроме того клинические исследования показали, что кетамин эффект антихолинергических и может использоваться в качестве потенциального бронходилататоров в тяжелой формой астмы34. Ингаляционных анестетиков, например изофлюрановая в сочетании с лечения боли, рассматриваются в качестве управляемой альтернативой для анестезии инъекции; Однако раздражение дыхательных путей после летучих анестетиков сообщается и поэтому исключает ингаляционных анестетиков в качестве альтернативного35.
Ограничения метода: сдержанные инвазивный метод для измерения механических свойств легких из-за необходимости трахеотомии, окончательная процедура и тем самым ограничивает исследования для анализа одной точки, без параметра расследовать болезни прогрессии. Чтобы уменьшить уровень инвазии, может выполняться измерение импеданса передачи в сознательных животных, что тем самым позволяет продольных исследований. Однако при измерении дыхательных механики в не назальной животных, сопротивление носа способствует общее сопротивление дыхания и тем самым затрудняет измерений после метахолином провокация13.
Важнейшие шаги в рамках протокола: здесь мы показываем только один метод инвазивных легочной функции. Поскольку существует несколько методов функции установленной инвазивной легких, стандартизации в рамках исследования и детальное описание метода используется, групп, и цистит режима в публикациях необходимо сравнить исследования.
Иссечение легких для histomorphometric анализа
Значение в отношении существующих методов и будущих приложений: анализ количественных histomorphometric может использоваться для изучения последствий ожирения на легких структуры (бронхов и альвеолы), интерпретировать результаты, полученные инвазивных плетизмографии и изучить варианты возможного лечения на легких решений. Данные от гистологической оценок могут отличаться в зависимости от фиксирующие агентов и процедуре используется фиксации. Так, как было показано, что ожирение влияет на альвеол и бронхиальной структуры, как хорошо внеклеточная матрица и сотовых композиция, необходимо определить соответствующий метод, основанный на вопрос исследования в будущих исследованиях. Для объективной количественной морфометрия, ткани, обработки после фиксации должны выполняться согласно стандартам американского общества торакальный (САР) / Европейского дыхательных общества (ERS) для количественной оценки легких структуры14 .
Модификации и устранение неполадок: В 2010 году Hsia et al. представил официальное заявление о САР/ERS установление стандартов для количественной оценки структуры легких, который следует принимать во внимание до легких изоляции и фиксации 14. Помимо трахею инстилляции фиксаторы, в месте крепления, фиксированный объем фиксации или вакуумные инфляции может выполняться надуть легочной ткани36. Инфляция, и тем самым расширения воздушного пространства, зависит от процедур фиксации и класс давления во время фиксации. Например, высокое давление, может привести к разрыв стенки альвеол и таким образом повлиять на результаты. Аналогичные параметры вентиляции, идеальной фиксации параметров зависят от возраста, размера и фенотип мышей. Фиксация может быть достиган химических или физических средств, включая химические агенты и/или криоконсервирования. Инстилляции трахею подходящего фиксативов имитирует ткань инфляции во время дыхания, отражающие условия в естественных условиях и поэтому широко используется37. 20-25 см выше самой высокой точки легких рекомендуется для достаточного давления, используя широкие и короткие трубы позволяет быстрое и равномерное проникновения14. Основная цель фиксации — для предотвращения процесса дегенерации и сохранение клеток и тканей в состоянии «life-like» при сохранении архитектурной целостности паренхимы легких. Кроме того ткани должны сохранять его реактивность антител, пятна и зонды нуклеиновых кислот. Помимо эффекта нормальной Автолиз неблагоприятные эффекты ткани, обработки, включая проникновение с горячим воском, нарезки и депарафинизации, должны быть предотвращены. Выбор фиксатором, а также дальнейшей обработки ткани, например через встраивание, могут вызвать усадка ткани, опухоль и упрочнения различных компонентов и привести к артефактам, таким как увеличение аутофлюоресценция38. Например фиксация в 10% буфер формалином и дальнейшей обработки может привести к усадки от до 20% - 30% по сравнению с39первоначального объема. Таким образом Hsia et al. в их 2010 консенсуса бумага САР/ERS рекомендовать использование 2,5% глютаральдегид буферизации с осмия тетраоксид и уранила ацетат, чтобы избежать усадки ткани. Объем легких, внутренней архитектуры, тонкой структуры тканей и клеток структура сохранилась после инстилляции сократимость этой фиксирующие реагент14. Денатурация белков и перекрестных ссылок формирования являются два основных механизмов, которые имеют важное значение для фиксации ткани. Обезвоживания соединений или коагулянтов, такие, как спирты или ацетон, вызывают денатурации белков, в результате изменения структуры высшего белков, дестабилизируя гидрофобные привязок. Non коагулянта закрепители как параформальдегида или глютаральдегид химически реагируют с белками и формы между молекулярной и внутри молекулярная cross-links. Поскольку несколько пятнать процедур, таких как гематоксилином и эозином, зависит от взаимодействия между молекулярной, пятнать результаты может быть бедным, в зависимости от фиксирующие агента. Антиген извлечения методы иммуногистохимии показали, что некоторые из реакций фиксации обратимы, особенно те из формальдегида40.
Ограничения метода: поскольку альвеолярного поверхности накладки удаляется на трахею инстилляции фиксаторы, толкование, например с, переднеязычный микроархитектуры, накопление слизи, или миграции воспалительных клеток можно манипулировать 41 , 42 , 43.
Важнейшие шаги в рамках протокола: здесь мы покажем трахею инстилляции 4% PFA как широкий подход к визуализировать влияние ожирения на легочных исходов. Как упоминалось выше, протокол должен быть изменен в зависимости от исследования вопроса, согласно САР/ERS рекомендации14.
Помимо вышеупомянутых параметров стресс является одним из основных факторов, влияющих на результаты исследования. Таким образом, подготовка обеих мышей и ученый является незаменимым. Мышей должны быть адаптированы к сдерживанию и должна быть передана экспериментальные области под условия покоя44. Стресс влияет на метаболизм, например вследствие гормона стресса, выпущенные глюкозы увеличиваются, эффект, который может быть неправильно истолковано как нарушение толерантности к глюкозе. Гормон стресса также изменяет подверженность анестетики, в частности, дозу Анестетики увеличивают и длительное время, чтобы достичь хирургической терпимости. Как уже упоминалось, повышенное количество анестетики могут влиять бронхоспазма, хотя сам стресс может вызвать бронходилатацию.
Таким образом эта статья содержит три метода для оценки влияния тучности и метаболизм на легких структуры и функции у мышей. Все упомянутые методы могут быть переданы в другие модели заболеванием и грызунов видов, таких как ожирение вследствие генетических модификаций или крыса модели. Применение этих методов может быть полезным для определения новых молекулярных механизмов в модели DIO с абляции определенных генов, или проверить новые терапевтические подходы к лечить/предотвращения неблагоприятных последствий ожирения на хронические заболевания легких.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эксперименты были поддержаны Марга и Уолтер Болл-Stiftung, Керпен, Германия; Проект 210-02-16 (MAAA), проекта 210-03-15 (MAAA) и немецкого фонда научных исследований (DFG; AL1632-02; MAAA), Бонн, Германия; Центр Кельна молекулярной медицины (CMMC; Больница университета Кёльна; Программа развития карьеры; MAAA), Köln Fortune (факультет медицины, Кёльнский университет; KD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GlucoMen LX | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 38969 | blood glucose meter |
| GlucoMen LX Sensor | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 39765 | Test stripes |
| Glucose 20% | B. Braun, Melsung, Germany | 2356746 | |
| FinePointe Software | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-002 | |
| FinePointe RC Single Site Mouse Table | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-001 | |
| FPRC Controller | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1075-001 | |
| FPRC Aerosol Block | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1106-001 | |
| Aerogen neb head-5.2-4um | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-2306-001 | |
| Forceps | FST, British Columbia, Canada | 11065-07 | |
| Blunt scissors | FST, British Columbia, Canada | 14105-12 | |
| Micro scissors | FST, British Columbia, Canada | 15000-00 | |
| Perma-Hand 4-0 | Ethicon, Puerto Rico, USA | 736H | Surgical suture |
| Roti-Histofix 4% | Roth | P087.1 | 4% Paraformaldehyd |
| Ketaset | Zoetis, Berlin, Germany | 10013389 | Ketamine |
| Rompun 2% | Bayer, Leverkusen, Germany | 770081 | Xylazine |
References
- Kelly, T., Yang, W., Chen, C. S., Reynolds, K., He, J. Global burden of obesity in 2005 and projections to 2030. Int J Obes (Lond). 32, 1431-1437 (2008).
- Freemantle, N., Holmes, J., Hockey, A., Kumar, S. How strong is the association between abdominal obesity and the incidence of type 2 diabetes? International journal of clinical practice. 62, 1391-1396 (2008).
- Wassink, A. M. J., et al. Waist circumference and metabolic risk factors have separate and additive effects on the risk of future Type 2 diabetes in patients with vascular diseases. A cohort study. Diabetic Medicine. 28, 932-940 (2011).
- Oktay, A. A., et al. The Interaction of Cardiorespiratory Fitness with Obesity and the Obesity Paradox in Cardiovascular Disease. Progress in cardiovascular diseases. , (2017).
- Azamar-Llamas, D., Hernandez-Molina, G., Ramos-Avalos, B., Furuzawa-Carballeda, J. Adipokine Contribution to the Pathogenesis of Osteoarthritis. Mediators Inflamm. 2017, 5468023 (2017).
- Koenig, S. M. Pulmonary complications of obesity. The American journal of the medical sciences. 321, 249-279 (2001).
- Stunkard, A. J. Current views on obesity. The American journal of medicine. 100, 230-236 (1996).
- Murugan, A. T., Sharma, G. Obesity and respiratory diseases. Chron Respir Dis. 5, 233-242 (2008).
- Zammit, C., Liddicoat, H., Moonsie, I., Makker, H. Obesity and respiratory diseases. International journal of general medicine. 3, 335-343 (2010).
- Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).
- McArdle, M. A., Finucane, O. M., Connaughton, R. M., McMorrow, A. M., Roche, H. M. Mechanisms of obesity-induced inflammation and insulin resistance: insights into the emerging role of nutritional strategies. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 52 (2013).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease models & mechanisms. 3, 525-534 (2010).
- Bates, J. H., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J Appl Physiol. 94 (1985), 1297-1306 (2003).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- Heydemann, A. An Overview of Murine High Fat Diet as a Model for Type 2 Diabetes Mellitus. Journal of diabetes research. 2016, 2902351 (2016).
- Asha, G. V., Raja Gopal Reddy, M., Mahesh, M., Vajreswari, A., Jeyakumar, S. M. Male mice are susceptible to high fat diet-induced hyperglycaemia and display increased circulatory retinol binding protein 4 (RBP4) levels and its expression in visceral adipose depots. Archives of physiology and biochemistry. 122, 19-26 (2016).
- Jovicic, N., et al. Differential Immunometabolic Phenotype in Th1 and Th2 Dominant Mouse Strains in Response to High-Fat Feeding. PLoS One. 10, e0134089 (2015).
- Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to Background Strain Is Essential for Metabolic Research: C57BL/6 and the International Knockout Mouse Consortium. Diabetes. 65, 25-33 (2016).
- Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, E15-E26 (2008).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of lipid research. 46, 582-588 (2005).
- Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Current protocols in molecular biology. Chapter 29, Unit 29B.23 (2007).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E849-E855 (2009).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
- Lodhi, I. J., Semenkovich, C. F. Why we should put clothes on mice. Cell Metab. 9, 111-112 (2009).
- Swoap, S. J., Gutilla, M. J., Liles, L. C., Smith, R. O., Weinshenker, D. The full expression of fasting-induced torpor requires beta 3-adrenergic receptor signaling. J Neurosci. 26, 241-245 (2006).
- Geiser, F. Metabolic rate and body temperature reduction during hibernation and daily torpor. Annu Rev Physiol. 66, 239-274 (2004).
- Mead, J. Mechanical properties of lungs. Physiological reviews. 41, 281-330 (1961).
- Lundblad, L. K., Irvin, C. G., Adler, A., Bates, J. H. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J Appl Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Lundblad, L. K., et al. Penh is not a measure of airway resistance! Eur Respir J. 30, 805 (2007).
- Adler, A., Cieslewicz, G., Irvin, C. G. Unrestrained plethysmography is an unreliable measure of airway responsiveness in BALB/c and C57BL/6 mice. J Appl Physiol. 97, 286-292 (2004).
- Fairchild, G. A. Measurement of respiratory volume for virus retention studies in mice. Applied microbiology. 24, 812-818 (1972).
- Brown, R. H., Wagner, E. M. Mechanisms of bronchoprotection by anesthetic induction agents: propofol versus ketamine. Anesthesiology. 90, 822-828 (1999).
- Goyal, S., Agrawal, A. Ketamine in status asthmaticus: A review. Indian journal of critical care medicine: peer-reviewed, official publication of Indian Society of Critical Care Medicine. 17, 154-161 (2013).
- Doi, M., Ikeda, K. Airway irritation produced by volatile anaesthetics during brief inhalation: comparison of halothane, enflurane, isoflurane and sevoflurane. Canadian journal of anaesthesia = Journal canadien d'anesthesie. 40, 122-126 (1993).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 299, L843-L851 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 516-527 (1982).
- Rolls, G. Process of Fixation and the Nature of Fixatives. , (2017).
- Winsor, L. Tissue processing. Laboratory histopathology. Woods, A., Ellis, R. , 4.2-1-4.2-39 (1994).
- Histochemistry, theoretical and applied. Pearse, A. , Churchill Livingstone. London. (1980).
- Weibel, E. R. Morphological basis of alveolar-capillary gas exchange. Physiological reviews. 53, 419-495 (1973).
- Bur, S., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Lung fixation by airway instillation: effects on capillary hematocrit. Experimental lung research. 9, 57-66 (1985).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 528-533 (1982).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary topics in laboratory animal science. 43, 42-51 (2004).
