Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Создание высокопроизводительного скрининга платформы для оценки гетерогенности амплификации гена HER2 в опухоли молочной железы

doi: 10.3791/56686 Published: December 5, 2017

Summary

Гетерогенные распределение HER2-положительных клеток может наблюдаться в подмножестве рака груди и генерирует клинических дилеммы. Здесь мы представляем надежные и рентабельные протокол определить, количественно оценить и сравнить HER2 генетической гетерогенностью внутри опухоли в большой серии гетерогенно переработки молочной железы.

Abstract

Целевые терапии против человека эпидермального фактора роста рецепторов 2 (HER2) радикально изменили результаты у пациентов с раком груди HER2-положительных. Однако меньшинство случаев выводит гетерогенных распределение HER2-положительных клеток, который генерирует основных клинических проблем. На сегодняшний день, были предложены не надежных и стандартизированных протоколов для характеристик и количественной оценки HER2 гетерогенных амплификации генов в большой когорты. Здесь мы представляем высок объём методологии одновременно оценить HER2 статуса в различных топографических областях несколько случаев рака молочной железы. В частности мы иллюстрируем лабораторные процедуры для создания расширенной ткань microarrays (TMAs) Включение целевых сопоставление опухолей. Все параметры TMA был специально оптимизирован для серебра в situ гибридизация (SISH) формалин Исправлена парафин врезанных тканей молочной железы (FFPE). Иммуногистохимический анализ прогностические и интеллектуального биомаркеров (то есть, ER, PR, Ki67 и HER2) должны выполняться с помощью автоматизированных процедур. Настроить протокол SISH была выполнена разрешить высокого качества молекулярного анализа через нескольких тканей, которые прошли различные процедуры фиксации, обработки и хранения. В этом исследовании мы предоставляем доказательство из принцип что специфических последовательностей ДНК может быть одновременно локализованы в отдельных областях Топографическая множественных и гетерогенно обработанные молочной железы с использованием метода эффективной и рентабельной.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HER2 является протоонкоген, оверэкспрессировали и в 15-30% всех инвазивных груди Рак1,2. Гиперэкспрессия HER2 определяется наличием > 10% клеток с сильным мембраны иммуногистохимический (IHC) окрашивание (3 +), в то время как амплификации генов могут быть оценены когда либо соотношение HER2/центромер ≥2 или номер копии гена ≥6, на подсчет голосов на наименее 20 клеток в situ гибридизация (ISH)3.

Генетической гетерогенностью внутри опухоль была широко описана в молочной железы, потенциально неблагоприятных вклад биомаркеров оценки и лечения ответ4. Согласно колледж американских патологов (CAP), неоднородность HER2 существует если HER2 усиливается в > 5% и < 50% проникновения опухолевых клеток5. К сожалению фактическая заболеваемость пространственной гетерогенности рака груди HER2 остается предметом споров среди патологоанатомов, с некоторыми авторами, что поддержание это событие чрезвычайно редки, и другие о том, что до 40% случаев HER2-гетерогенных1,5,6,,78,9,10. Несмотря на биологические механизмы, лежащие в основе этого состояния не еще полностью уточняются, прогностические и клинических последствий неоднородности HER2 интра опухоли имеют решающее значение для больных раком молочной железы11.

Недавно ярко поле молекулярные методы, такие как хромогенных иш (CISH) и серебряные иш (SISH), появились как надежные методы для обнаружения HER2 гетерогенность в FFPE тканях, с некоторыми преимуществами по сравнению с флуоресцентные иш (рыба)12. К сожалению массового анализа единичных случаях остается непрактичным в больших когортных исследований. Несколько групп показали, что сочетание гистохимии, МХК и ISH с ТМА технологий может представлять ценные стратегии в исследовании рака биологии13,14,,1516. С этого широко распространенного метода образцы ткани из разных пациентов могут быть проанализированы одновременно, минимизации ткани и реагентов, используемых и способствуя единообразного анализа большой серии случаев14. Однако без протоколы доступны для одновременного высок объём молекулярные характеристики нескольких образцов тканей, которые прошли различные обработки с точки зрения реагентов, фиксации времени и методы сохранения занятости, таких как архивные блоки.

Учитывая прогностические и клинические последствия HER2 Пространственная гетерогенность рака молочной железы, мы разработали комплексную платформу молекулярной оценить его в большой серии гетерогенно переработанных случаев. Здесь мы изобразить Лаборатория стратегии для создания и анализа гетерогенности интра опухоль HER2 амплификации в высокодоходные TMAs рака молочной железы с помощью SISH. Следующий протокол был разработан для измерения опухоли > 5 мм (> pT1b согласно TNM 2017)17. Для небольших повреждениях мы рекомендуем проведение анализа на анфас последовательных участках. Наша процедура позволяет для одновременного анализа IHC и SISH рака груди до 30, охватывающих означает 6 различных областей (диапазон 4-8) для каждого случая. В общей сложности 180 сердечников ткани 1 мм в диаметре, с 500 мкм между ядрами и 2 мм между краями сетки и будет создаваться для каждого ТМА блока.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Это исследование было одобрено институциональные наблюдательные советы от IRCCS Ca' Granda фонд, больницы Поликлинико, Милан, Италия.

1. подбор больных и образцы тканей

  1. Извлечения архивных слайды всех случаев для анализа, включая все доступные гематоксилином и эозином (H & E) и IHC слайды из первоначального диагноза и, если присутствует, один H & E согласованы не неопластических груди ткани (например, хирургические маржа) .
  2. Выполните случае отзывов.
    Примечание: Для выполнения этой задачи, по крайней мере два патологоанатомов с опытом работы в патологии молочной железы следует обсудить диагностики слайды и урегулировать разногласия коллегиально. Используйте обычные микроскопа или переработанное инструменты (в пользу последнего в многоцентровые исследования). Если таковые имеются, исключите все несогласный случаев.
    1. Выполните гистологические реклассификации всех случаев согласно последней редакции классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) опухолей груди18.
    2. Убедитесь, что нормальной ткани для каждого случая, если они присутствуют в архивных клинических образцов, включает по крайней мере не неопластические терминала протоковой лобулярного единицу.
    3. Идентифицировать все неопластических районы, которые показывают гетерогенных цитологическим, архитектурные, или IHC функции с помощью микроскопа ярко поле (совместно выполняться патологоанатом и technician(s), кто построит TMAs).
  3. Выделите области дискретных Топографическая с маркером на слайде стекла или с помощью надлежащего инструмента на цифровой слайд программное обеспечение (рис. 1A).
  4. На основании выбранных слайдов, извлечь соответствующие блоки FFPE из архивов.
    Примечание: Для оптимизации ТМА строительства, чтобы избежать истощения ткани и для сохранения ТМА удар структурной целостности, случаи с < 1 мм остаточной ткани должны быть исключены.

2. Проектирование и строительство TMAs, основанный на методе Кононен

  1. Создать и открыть новый файл электронной таблицы, включения записи из различных областей в каждом случае. Включить следующие данные по отдельным столбцам, о чем свидетельствует таблица 1: случай ID, идентификатор блока, идентификатор области, ткани типа (например, нормальные ткани, инвазивные компонент histotype, в месте histotype компонент), топографии (например, опухоль ядро, инвазивные фронт), морфологии (например, ядерный класс, архитектура, митозов, цитологические особенности), Биомаркеры статус (т.е., эстрогеновый рецептор (Эр), рецепторы прогестерона (PR), Ki67 и HER2) и все другие функции IHC.
    1. Сохраните документ.
  2. Создайте проект TMA.
    1. Установить и открыть ТМА дизайн программного обеспечения.
    2. Определение получателя ТМА блок: доступ через меню Файл > Новый > блок или с помощью CTRL + B.
    3. Щелкните в первом поле для заполнения или нажмите клавишу Tab и введите размеры блока парафин: ширина 35 (мм), высота (мм) 20. Тип «2» как «маржа» значение (то есть, расстояние от края парафина в мм) (рис. 1B). Сохраните данные, нажав кнопку надлежащего. Новый шаблон получателей блока теперь сохраняется и готов к использованию в новых шаблонах массив ткани.
    4. Создайте проект массив ткани: доступ к меню Файл > Новый > ткани массива или с помощью CTRL + T.
    5. Заполните имя массива ткани, комментарии и автора, а затем нажмите кнопку «Далее». Щелкните значок «Импорт», выберите файл шаблона блока получателей ранее созданные и нажмите кнопку «Далее».
    6. Выберите 1 мм как размер пятна, нажав на круглую кнопку. Выберите пятно интервал, который представляет собой пространство между двумя центрами соседних пятен 500 мкм. Нажмите на значок калькулятора рассчитать общее количество пятен создана, которая должна быть 231. Нажмите кнопку «Далее».
    7. Определите место нумерации режиме, нажав один раз на нем. Нажмите на кнопку «определить» для создания сеток и вложенных сетках. Удаление центральной линии (линия 6) и столбцы 8 и 15. Поддерживать 3 пятна 1 линии для ориентации. Окончательная карта должна охватывать общее количество 183 пятна, как представлено на рисунке 2.
    8. Определить список типов тканей: доступ через меню Файл > Новый > список типов ткани или с помощью CTRL + L.
    9. Вставьте ранее определенного описания ткани. Нажмите клавишу Стрелка вниз или нажмите на кнопку +, чтобы добавить строку.
    10. Определение проекта: доступ через меню Файл > Новый > руля проекта или с помощью CTRL + P.
    11. Заполните имя массива ткани, комментарии и автор, а затем нажмите кнопку «Далее». Импортируйте файл электронной таблицы, список типов ткани и ткани массив модель ранее созданные, нажав надлежащего значки.
    12. Нажмите кнопку «Выбрать все» и определить количество мест для каждого типа ткани; Нажмите на кнопку «матч», чтобы применить настройки. Появится таблица с перечнем общее количество ядер, которые будут выборки и переданы получателей блоки в этом проекте. Сохраните проект и закрыть программу.
  3. Подготовьте акцептора блок (рис. 1B).
    1. Наполнить очищенную металлические формы эластичные парафина на 65 ° C.
    2. Оставьте парафиновые блоки остыть при комнатной температуре на ночь внутри металлических форм.
    3. Извлечь парафиновые блоки из металлических форм. Если отказы происходят, отменить блока и повторите шаги 2.3.1-2.3.3.
  4. Постройте ТМА, с использованием автоматических или полуавтоматических arrayer19.
    1. Извлечение всех выбранных блоков FFPE и в соответствующих разделах H & E с аннотациями.
    2. Включите arrayer и вставьте блок акцептор на карусель arrayer.
    3. Откройте программное обеспечение управления станции arrayer, нажмите на «Новый массив ткани» и загрузить ранее созданный проект (рис. 1 c).
    4. Нажмите кнопку «Продолжить» и выберите позицию доноров блок из меню.
    5. Определите начальную позицию на каждого получателя блока: Используйте клавиши со стрелками для перемещения лазерного света и привести его в соответствие с левого верхнего края на парафин заблокированных получателей.
    6. Нажмите кнопку «Далее» и повторите для вертикального выравнивания.
    7. Нажмите «Далее», чтобы автоматически создать дыру в ранее определенные координаты получателя (акцептор) блока.
    8. Пустые удар.
    9. Поместите блок доноров для отбора проб и удалить основной ткани из области ранее аннотированный интересов.
    10. Основные ткани доноров вставьте в отверстие в блоке получателя (акцептор).
    11. Удалите блок доноров из arrayer.
    12. Повторите шаги 2.4.5-2.4.11, пока не завершится TMA.
  5. Надел стерильные пустой слайд стороне ткани недавно созданного блока ТМА и поместите их в лаборатории духовку на 45 ° C за 5 мин.
  6. Аккуратно нажмите блок на слайде 5 s расплющивать сердечников ткани. Повторите один раз (для в общей сложности 2 раза).
  7. Удалите блок ТМА вместе с слайд из духовки, флип их и осторожно Отсоедините блок от слайда.
  8. Покрытие поверхности ткани TMA с тонким слоем эластичные парафина на 65 ° C.
  9. Оставьте на TMA блок при комнатной температуре в течение 2 ч.
  10. Передача ТМА блок на 4 ° C в течение 24 ч.
    Примечание: В TMA блок может храниться при температуре 4 ° C до изнеможения.

3. гистохимические и Иммуногистохимический анализ

  1. Вырежьте ТМА секций.
    1. Место ТМА акцептор вышивки с парафином стороной вниз на поверхность-10 ° C на 10 минут для охлаждения парафина.
    2. Заполните ванну размещения с ультрачистая вода и установите тепла до 38 ° C.
    3. Место нового лезвия на поворотный микротома и вставьте блок в патрон микротом так воск блок сталкивается лезвие и выравнивается в вертикальной плоскости.
    4. Тщательно подход блок с лезвием и вырезать несколько тонких секций для обеспечения правильности позиционирования; При необходимости отрегулируйте.
    5. Вырежьте 3 мкм толстые секции.
    6. Подобрать разделов с помощью пинцета и их плавают на поверхности воды ванна.
    7. Выберите разделы из водяной бани на регулярной и МГС/иш стеклянных скольжениях.
    8. Поместите слайды на стойку и хранить их в духовку на 45 ° C на ночь.
      Примечание: После подготовки, ТМА секции следует витражи в течение 24 ч.
  2. Выполнять, гистохимические окрашивание (H & E) с помощью autostainer.
    1. Вставить слайды в стойке autostainer и разместить их на 60 ° C в течение 10 мин.
    2. Откройте раздел загрузки autostainer и вставить стойки с ТМА слайды в одной из станций нагрузки с стандартным H & E клип наружу.
    3. После того, как ящик закрыт, клип будет автоматически распознается системой и начнется следующий протокол: станция печи при 37 ° C (6 мин), ксилол (2 мин), ксилол (2 мин), 100% этанола (2 мин), 100% этанола (2 мин), этанола 95% (2 мин), этанола 95% (2 мин) , дистиллированной воды (4 мин), в Carazzi гематоксилином (9 min), низкого давления проточной водой (2 мин), 1% эозина (1 мин), низкого давления проточной водой (2 мин), этанол 95% (20 s), этанол 95% (20 s), этанол 95% (20 s), этанол 95% (20 s), 100% этанола (15 s), 100% этанола (15 s) , ксилол (30 s), ксилол (30 s).
    4. Выгрузите стойки из ящика и смонтировать слайд с крышки выскальзования.
      1. Собирать капли гору с пипетки и положил его на внешний край крышки слайд.
      2. Место в мокрой части крышки выскальзования на слайде и пусть горе сухой в течение 30 мин.
  3. Выполняют IHC пятная для ER, PR, Ki67 и HER2 с помощью автоматических immunostainer.
    Примечание: Перед началом окрашивание запуска, запуск системы и проверьте бутылки реагент расходных материалов (Таблица материалов) и отходы контейнеров.
    1. Место скольжениях TMA для анализа на 60 ° C в течение 10 мин.
    2. Запустите инструмент immunostainer и программного обеспечения.
    3. В представлении Главная нажмите кнопку протоколы и затем нажмите кнопку Создать/редактировать протоколы.
    4. Выберите стандартный DAB (3, 3'-диаминобензидин) IHC процедурой изменять базовый шаблон.
    5. Флаг «Депарафинизации» в списке и установите температуру среды при 72 ° C.
    6. Флаг cc1 демаскирующих решение, установите температуру среды при 95 ° C и время инкубации в 36 мин.
    7. Пометить поле основное антитело, вставить ID ER Встроенный дозатор (инструмент программного обеспечения будет распознавать распылитель на карусель реагент) и установите время инкубации в 16 мин.
    8. Пометить поле Counterstaining, выберите гематоксилином я и установить время инкубации в 12 мин.
    9. Нажмите кнопку «Сохранить как» и имя протокола.
    10. Повторите шаги 3.3.3-3.3.9 для оставшихся антител, используя следующее время инкубации первичного антитела: PR 16 мин, Ki67 16 мин и HER2 12 мин использовать предварительно разбавленного готовых к использованию (RTU) антител.
    11. В представлении Главная нажмите кнопку Создать ярлык.
    12. Нажмите кнопку протоколы и добавьте ER, PR, Ki67 и HER2 протоколов для каждого ТМА анализа.
    13. Нажмите кнопку Закрыть /Print.
    14. Как шаблон метки появится, введите идентификаторы TMA для метки.
    15. Нажмите кнопку Печать, чтобы распечатать наклейки, а затем применить их на скольжениях TMA.
    16. Щелкните значок инструмента и установите режим запуска инструмента как «Готово».
    17. Откройте капот, который охватывает Карусель реагентов, системы обнаружения и первичных антител, затем закройте капот.
    18. Нажмите кнопку фронт на слайд ящик, чтобы открыть его, загрузить скольжениях TMA и закройте ящик, нажав ту же кнопку.
    19. Установите режим запуска инструмента как «работает» и следуйте инструкциям.
    20. В конце выполнения, выгрузки, ТМА слайдов, нажав все ящики с кнопку завершения слайды на инструмент управления с слайд и промойте их в теплой мыльной водой, чтобы удалить любые оставшиеся реагентов.
    21. Вымойте слайды под низким давлением холодной воды, обезвоживает скольжениях TMA и применить к каждому слайду стекла coverslip.
  4. Выполнить анализ IHC ER, PR и HER2 после американского общества клинической онкологии (ASCO) / крышка руководящие принципы и Ki67 согласно рекомендации международного Ki67 в рак молочной железы Рабочей группы (таблица 2).
    Примечание: Этот анализ должен быть выполнена отдельно в дискретных ткани пятна патологоанатом с опытом работы в молочных желез.
    1. Оцените выражение ER как позитивные, если ≥ 1% ядер клеток опухоли иммунореактивных20,21,,2223.
    2. Оцените выражение PR как позитивные, если ≥ 1% ядер клеток опухоли иммунореактивных20,21,,2223.
    3. Оценить HER2 выражение как:) Оценка 3 + если окружная мембраны окрашивание, является полной и интенсивным, b) Оценка 2 + Если окрашивание продольных мембраны является неполной и/или слабого/умеренной и в > 10% клеток инвазивные опухоли или полная и Окружная мембраны окрашивание является интенсивным и ≤ 10% инвазивных раковых клеток, c) Оценка 1 + Если окрашивание неполной мембраны слабый едва уловимое и в > 10% клеток инвазивной опухоли, d) отрицательным, если не пятнать или мембраны Окрашивание является неполной и слабый едва уловимое, и в пределах ≤ 10% инвазивные опухоли клетки3,24.
    4. Оценить Ki67 индекс как процент клеток с ядерными окрашивание по меньшей мере 1000 неопластических клеток случайно выбранных более 10 мощных поля (увеличение, 400 X)25.

4. SISH анализ HER2

  1. Вырежьте ТМА секций (повторите шаг 3.1).
  2. Выполните SISH для HER2 с использованием автоматических immunostainer.
    1. Место скольжениях TMA для анализа на 60 ° C в течение 10 мин.
    2. Запустите инструмент immunostainer и программного обеспечения.
    3. В представлении Главная нажмите кнопку протоколы и затем нажмите кнопку Создать/редактировать протоколы.
    4. Выберите «U двойной ISH CKT» процедуру для изменения базового шаблона.
    5. Флаг «Сушка» в списке поле и установите температуру на 63 ° C в течение 20 мин.
    6. Флаг «Мобильные принадлежности» в списке поле, затем «мобильный кондиционер CC2» и установите температуру во время 86 ° C и инкубации на 4 мин.
    7. Флаг мягкий CC2 (1 цикл), стандарт (2 цикла) и расширенной (цикл 3) для 8 мин, 12 мин и 8 мин, соответственно.
    8. Флаг «Иш-протеазы 3» в списке поле и установите время инкубации в 16 мин.
    9. Выберите зонды, HER2DNP и CHR17DIG и задайте время инкубации в 6 ч.
    10. Установка мытье на 76 ° C 8 мин.
    11. Установите время инкубации multimer (SIL иш DNP ПХ) SISH в 32 мин.
    12. Установите время инкубации Серебряный хромогена (SIL иш DNP КПЧК) на 4 мин.
    13. Установите время инкубации красный multimer (красный иш КОПАТЬ AP) в 24 мин.
    14. Установите время инкубации хромогена красный (красный иш КОПАТЬ FR) на 8 мин.
    15. Флаг «Counterstaining» в списке поле выберите «ГЕМАТОКСИЛИНОМ II» и установите время инкубации в 8 мин.
    16. Флаг «пост Counterstaining» в списке поле, выберите «РАСТОЧИТЕЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТ» и установите время инкубации в 4 мин.
    17. Повторите шаги от 3.3.11-3.3.15 (выберите изменение U двойной иш CKT протокол).
    18. Открыть капот, который охватывает реагентов карусель, мойки и систем обнаружения ISH, а затем закройте капот.
    19. Повторите шаги от 3.3.18-3.3.21.
  3. Анализ SISH для HER2: оценить амплификация гена HER2 как позитивные, если коэффициент /CEP17 HER2≥2.0 с средний HER2 копии номер ≥4.0 сигналов в клетку и отрицательным, если коэффициент /CEP17 HER2< 2.0 в среднем HER2 скопировать номер < 4.0 сигналов/ячейку3,24.
    Примечание: Аналогично IHC, этот анализ должен осуществляться отдельно в дискретных ткани пятна патологоанатом с опытом работы в молочных желез.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В целом, 444 инвазивных молочной железы, рака были включены в 15 TMAs, специально оптимизированный для анализа иш. Среди отобранных 2,664 пятна 2,651 (99,5%) были представитель ранее выделенных областей и поэтому считается поддаются для последующего анализа. Интра опухоль гетерогенности был определен посредством IHC и SIH, с особым упором на гетерогенных дистрибутивов HER2-позитивных клонов в различных топографических областях опухоли. Таблица 3 изображает биологические характеристики случаев анализируются, упором на ER, PR, Ki67 и HER2 статуса в различных histotypes. В частности, 18% случаев были найдены для отображения HER2-положительных клеток в > 10% клеток опухоли и поэтому соответствующие характеристики для оценки позитивность HER2. Интересно, что это значение является ближе к нижней части рака груди диапазон HER2-позитивных сообщенных случаев. С другой стороны HER2 статуса был переменной в отдельных областях HER2-позитивных и HER2-отрицательных рака молочной железы (рис. 3, Таблица 4), обеспечивая дальнейшее доверие к понятие, что рак молочной железы является чрезвычайно разнородных болезни на Геномный уровень. Провал SISH анализа составлял 0,8%, а общее количество пятен 2,629/2,651, в которых с тегами динитрофенола зонд привязан к последовательности.

Figure 1
Рисунок 1 : Представление краеугольным этапов в реализации высок объём платформы для анализа гетерогенности большой когорты рака груди HER2. (A) выбор областей для выборки должна включать определения и выделения всех районов с цитологическим, архитектурные, или IHC неоднородности. (B) одним из важнейших шагов этой процедуры является создание высокого качества акцептора блока, учитывая, что даже микроскопические трещины может вывести согласованности последующих в situ гибридизация анализов. (C) важно использовать цифровую экскурсии arrayer с иглой 1 мм в диаметре построить высокодоходные ТМА, основанный на методе Кононен. (D) Создание проекта ТМА должен начинаться с определения размеров и границ TMA. (E) все IHC и ISH анализы должны выполняться с помощью средств цифровой патологии, для того, чтобы быстро перемещаться через TMA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Планиметрических представление ТМА, понял для этого протокола. Общее количество 180 пятна диаметром 1 мм, 500 мкм друг от друга, позволяют оптимально в situ гибридизация. Плотнее TMAs обеспечивают непродуктивных результаты с точки зрения общего качества и единообразия реакций все пятна, с более высокой ставкой неудачи на основе одного спот. Обратите внимание, «ориентация» пятна в топ и среднего левом сетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Представитель микроскопии, показаны серебро на месте анализ гибридизации HER2-гетерогенных рака молочной железы. В этом парадигматический пример два отдельных пятен полноценного инвазивного рака молочной железы без специального типа (BR_121) показали разные результаты с точки зрения HER2 амплификации генов (черный), по сравнению с прицентромерного перечисления зонд 17 (красный). В частности одной из областей принадлежащих к основной опухоли и показывая что Цитокератины 7 нерегулярных пятнать шаблон HER2 усиленный (A), во время одного пятна от инвазивных фронта (т.е., край опухоли) отображается одичал тип HER2 шаблон (B). Масштаб баров = 50 мкм (20 мкм в вставки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Случае ID Идентификатор блока Идентификатор области Ткани Топография Морфология ER PR Ki67 HER2 Другие особенности IHC
BR_121 A5 a Нормальный Хирургическое маржа
BR_121 А1 a НСТ Основной опухоли G2 CK7 +
BR_121 А1 b НСТ Основной опухоли G3 CK7 + /-
BR_121 A3 a НСТ Основной опухоли Муцинозные Строма 90 100 12 2 +
BR_121 A3 b НСТ Инвазивные фронт Трубчатые 100 100 35 2 +
BR_121 A4 a НСТ Инвазивные фронт G3
BR_121 A3 c DCIS (ЕИЦ +) Прилегающих к инвазивным фронт Высококачественной 100 100 45 2 +

Таблица 1: представитель запись об одном случае, включенных в исследование. Этот случай (BR_121) был полноценный инвазивной карциномы без специального типа с фокуса миксоидная стромы, показаны мелкие трубчатые компонента на периферии очага поражения и потеря фокуса нерегулярные CK7 immunoexpression. Иммуногистохимическая функций, включая Биомаркеры отчетности, относится к анализов, выполненных на момент постановки диагноза. NST, инвазивной карциномы без специального типа; DCIS, протоковой карциномы в situ; ЕИЦ +, обширные внутрипротоковая компонент; CK7, Цитокератины 7.

Маркер Клон Компания Разбавление Депарафинизации Антиген поиска Антитело инкубации Система баллов
ER SP1 Вентана RTU EZ prep в 72 ° C CC1 при 95 ° C для 36 мин 16 мин ASCO/CAP рекомендации23
PR 1E2 Вентана RTU EZ prep в 72 ° C CC1 при 95 ° C для 36 мин 17 мин ASCO/CAP рекомендации23
HER2 4B5 Вентана RTU EZ prep в 72 ° C CC1 при 95 ° C для 36 мин 18 мин ASCO/CAP руководящие принципы3
Ki67 30-9 Вентана RTU EZ prep в 72 ° C CC1 при 95 ° C для 36 мин 12 мин Ki67 международной рабочей группы рекомендации25 рака молочной железы

Таблица 2: список антител, клоны, разведения, методы получения антигена и скоринговых систем, принятой для анализа иммуногистохимических. ER, эстроген рецептор; PR, рецепторы прогестерона; RTU, готовые к использованию.

Histotype n (%) ER + (%) PR + (%) Ki67-Лоу (%) Ki-67-высокий (%) HER2 + (%)
Инвазивной карциномы без специального типа 344 (77,5) 301 (87,5) 257 (74,7) 85 (24,7) 259 (75,3) 71 (20,6)
Инвазивного лобулярного рака 53 (11,9) 53 (100,0) 44 (83,0) 36 (67,9) 17 (32,0) 4 (7.5)
Инвазивной карциномы, смешанного типа 9 (2.0) 8 (88.9) 6 (66,7) 0 (0.0) 9 (100,0) 1 (11.1)
Трубчатые карцинома 8 (1,8) 8 (100,0) 8 (100,0) 8 (100,0) 0 (0.0) 0 (0.0)
Муцинозные карцинома 11 (2.4) 11 (100,0) 9 (81,8) 7 (63,6) 4 (36,4) 0 (0.0)
Micropapullary карцинома 7 (1.6) 7 (100,0) 7 (100,0) 5 (71,4) 2 (28,6) 2 (28,6)
Инвазивной карциномы с апокриновые featueres 5 (1.1) 3 (60.0) 1 (20,0) 1 (20,0) 4 (80.0) 3 (60.0)
Папиллярный рак 1 (0,2) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (100,0) 0 (0.0)
Медуллярная карцинома 4 (0,9) 0 (0.0) 1 (25.0) 0 (0.0) 4 (100,0) 0 (0.0)
Метапластических карцинома 2 (0,5) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100,0) 0 (0.0)
Итого 444 391 (88,0) 333 (75.0) 142 (32,0) 302 (68.0) 81 (18,2)

Таблица 3: груди Рак histotypes, рецептор и состоянии неоднородность HER2. ER, эстроген рецептор; PR, рецепторы прогестерона; Ki67-низкая, Ki67 индекс < 18%; Ki67-высокий, Ki67 > 18%.

Интерпретируемые неопластических пятна HER2-положительных пятна (%) Гормональный статус рецепторы HER2-гетерогенных случаи
6 5 (83) положительные 10
6 5 (83) негативные 1
6 4 (67) положительные 7
6 4 (67) негативные 1
6 2 (33) негативные 1
6 1 (17) положительные 1
5 3 (60) положительные 10
5 1 (20) положительные 2
4 3 (75) положительные 9
4 2 (50) положительные 8
4 1 (25) негативные 1
3 2 (67) положительные 5
3 1 (33) положительные 2
46 25 (54) 53 (93) 57

Таблица 4: HER2 выражение, статус рецептора гормона и HER2-гетерогенных случаев. Среди 57 случаев HER2-гетерогенных 4 (7%) случаи ER-отрицательных и PR-отрицательно, подтверждающий клиническое значение оценки гетерогенности HER2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Здесь мы подробно стратегии лаборатории для выполнения анализов SISH гена HER2 и его соответствующий центромер в высокодоходные TMAs гетерогенно переработки молочной железы. Этот метод является экономически эффективным и может осуществляться в большинстве лабораторий для исследования неоднородности амплификация гена HER2 в большой когорты груди Рак получены формы патологии архивов.

Благодаря клиническое значение HER2 тестирования в рак молочной железы и проблемы, порожденные ее гетерогенных выражение мы разработали Протокол тестирования высокой пропускной способности оценить интра - и Межамери - tumor генетической гетерогенностью HER2 . Проанализированы области включают компоненты неинвазивного и инвазивных, на основе конкретных цитологическим, архитектурные и IHC функции.

Есть несколько критических этапов, которые должны управляться тщательно в этом протоколе. Одним важным шагом является выбор областей, представляющих интерес. Мы определили, что аннотации различных топографических зон посредством многодисциплинарного подхода имеет решающее значение для обеспечения качества окончательной молекулярного анализа. В частности совместная редакция диагностики слайды патологоанатом и техник значительно увеличить количество адекватных пятна (например, пятна, отражающие области определены на слайде) и впоследствии сократить коэффициент отказа анализ одного пятна. Однако некоторые опухоли пятна могут быть потеряны после последовательных секций для нескольких IHC и ISH анализа. Для преодоления этого неудобства, мы рекомендуем строительство TMAs в двух экземплярах или в трех экземплярах, если вообще возможно на основе наличия ткани. Кроме того мы подчеркиваем важность определения строгого лабораторных процедур для создания акцепторной FFPE блоков для TMAs. Действительно мы заметили, что минимальный трещины в блоке ТМА может вывести весь иш анализа с точки зрения качества, воспроизводимость и четкость реакции. Если отказы происходят, блок доноров должны игнорироваться для TMA строительства. Следует признать, однако, что IHC может быть выполнено даже в неоптимальных TMAs, и никаких доказательств технических проблем в ходе такого анализа было отмечено в нашем опыте.

Несмотря на то, что этот протокол специально оптимизирован для анализа SISH HER2 высокодоходные груди TMAs, это следует отметить, что другие анализы, например рыбы и МГС, может быть надежно выполнена в нескольких типов тканей, как описано в14, 19,26. Однако мы определили здесь идеальное количество пятен и топографические характеристики ТМА обеспечить высокое качество и воспроизводимость анализов SISH HER2 гена в образцах рака молочной железы. Еще один важный момент представлена реорганизация стандартных автоматизированных SISH протоколов для соответствия особенность несколько образцов для анализа. Действительно производителей руководящие принципы являются, как правило, сделаны для молекулярного анализа обычных анфас секций и поэтому не в состоянии достичь высоких стандартов на образцах гетерогенно переработанных тканей, таких как в TMAs из архивных FFPE блоков. С этой целью мы предоставили пошаговое описание надежного настраиваемого протокола для SISH анализа в этих образцах, проблематично.

Было бы чрезвычайно полезно исследовать неоднородность HER2 выражение и амплификации генов в отношении разнородных распределения других клинически осуществимое молекулярных биомаркеров рака молочной железы. В этой связи необходимы дальнейшие трансляционного исследования изучить обоснованность нашего метода для других клинически значимых молекулярного анализа, например при содействии матрицы лазерной десорбции/ионизации масс-спектрометрии изображений (MALDI-MSI)27. Недавно Управление FFPE тканей для анализа MALDI-MSI стало возможным, хотя и сложной. Эта техника в situ proteomic позволяет для визуализации пространственного распределения белков и пептидов в разделах патологической ткани, включая рак груди.

Этот протокол имеет несколько важных шагов, которые потенциально могут вмешиваться в конечном счете. Во-первых, особое внимание должно уделяться созданию различных механизмов лежащие в основе усиления HER2 . К примеру хромосомы 17 polysomy является генетическим аберрации, которые могут возникнуть в груди Рак11, представляющий известные альтернативный механизм для увеличения числа копии HER2 . Это условие, хотя и не частой, может повлиять на не только биологические особенности рака и ведению пациентов, но и анализ ISH. Во-вторых она была описана, что генетической гетерогенностью внутри опухоли встречаются также на уровне одной ячейки и не только в разных районах опухолевой. Этот протокол не сможет увеличить мощность обнаружения этого конкретного состояния по сравнению с анфас секций. Кроме того важно подчеркнуть, что ТМА основанные исследование пространственной гетерогенности имеет некоторые встроенные ограничения, включая отсутствие всеобъемлющего анализа весь раздел. Это исследование, однако, следует рассматривать доказательства в принцип что неоднородность амплификация гена HER2 может оцениваться с помощью высокой пропускной способностью и экономически платформы, с помощью стандартного лабораторного оборудования. Чтобы проверить этот протокол потребуются дальнейшие исследования, анализ последовательных анфас разделы HER2-гетерогенных случаев, в сочетании с новейшим молекулярных исследований и клинических данных пациентов.

В заключение всеобъемлющее сопоставление HER2 статуса в гетерогенных образцов рака груди HER2 и расследование потенциальных драйверов генетических мутаций в HER2-отрицательных компонентов должны опираться на анализ нескольких неопластических регионов. Этот анализ потребует невыносимой расходы и усилия, используя стандартные средства диагностики. Этот метод представляет собой надежный инструмент для одновременного характеристика HER2 генетической гетерогенностью в больших наборов множественных и гетерогенно переработки молочной железы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы имеют без конфликта интересов.

Acknowledgments

Нет.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26x76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device - digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136, (6), 864-871 (2011).
  2. Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232, (2), 219-229 (2014).
  3. Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31, (31), 3997-4013 (2013).
  4. Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12, (8), 1021-1032 (2012).
  5. Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133, (4), 611-612 (2009).
  6. Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54, (3), 532-538 (2011).
  7. Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64, (12), 1112-1116 (2011).
  8. Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. 'Genetic heterogeneity' in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25, (5), 683-688 (2012).
  9. Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136, (2), 266-274 (2011).
  10. Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25, (7), 938-948 (2012).
  11. Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27, (1), 4-18 (2014).
  12. Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now? Expert Rev Mol Diagn. 15, (3), 385-398 (2015).
  13. Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10, (12), e0144923 (2015).
  14. Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies - a systematic literature review. Histopathology. 68, (3), 323-332 (2016).
  15. Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16, (8), 1266-1270 (2016).
  16. Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26, (6), 816-824 (2013).
  17. Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. Eight, Springer International Publishing. (2017).
  18. Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. WHO Classification of Tumours of the Breast. 4th, IARC press. (2012).
  19. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4, (7), 844-847 (1998).
  20. Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68, (2), 262-271 (2016).
  21. Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29, (11), 1292-1305 (2016).
  22. Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70, (6), 906-917 (2017).
  23. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28, (16), 2784-2795 (2010).
  24. Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22, (35), 7926-7937 (2016).
  25. Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103, (22), 1656-1664 (2011).
  26. Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14, (3), R93 (2012).
  27. De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11, (6), 1507-1514 (2015).
Создание высокопроизводительного скрининга платформы для оценки гетерогенности амплификации гена HER2 в опухоли молочной железы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).More

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter