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Immunology and Infection

Construcción de una plataforma de proyección de alto rendimiento para evaluar la heterogeneidad de la amplificación del gen HER2 en cáncer de mama

doi: 10.3791/56686 Published: December 5, 2017

Summary

Distribución heterogénea de células HER-2 positivo se puede observar en un subgrupo de cánceres de mama y genera dilemas clínicos. Aquí, presentamos un protocolo fiable y rentable para definir, cuantificar y comparar la heterogeneidad genética de la intra-tumor HER2 en una serie grande de los cánceres de mama heterogéneo procesados.

Abstract

Terapias dirigidas contra el receptor de factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2) han cambiado radicalmente el resultado de pacientes con cáncer de mama positivo para HER2. Sin embargo, una minoría de casos muestra una distribución heterogénea de células HER-2 positivo, que genera grandes desafíos clínicos. Hasta la fecha, no hay protocolos confiables y estandarizados para la caracterización y cuantificación de la amplificación del gen HER2 heterogénea en grandes cohortes se han propuesto. Aquí, presentamos una metodología de alto rendimiento para evaluar simultáneamente el estado de HER2 en diferentes áreas topográficas de múltiples cánceres de mama. En particular, nos ilustran el procedimiento de laboratorio para la construcción de microarreglos de tejido mejorado (TMAs) incorporando una asignación específica de los tumores. Todos los parámetros de TMA se han optimizado específicamente para la plata en situ hibridación (SISH) de formalina-fijo parafina-encajado (FFPE) tejidos del pecho. El análisis de Immunohistochemical de los biomarcadores pronósticos y predictivos (es decir, ER, PR, Ki67 y HER2) debe realizarse mediante los procedimientos automatizados. Se ha implementado un protocolo personalizado de SISH para permitir un análisis molecular de alta calidad a través de múltiples tejidos que experimentaron diferentes procedimientos de fijación, procesamiento y almacenamiento. En este estudio, le ofrecemos una prueba de principio que secuencias específicas de ADN podrían ser cánceres localizados simultáneamente en distintas zonas topográficas de múltiple y heterogéneo procesados usando un método eficiente y rentable.

Introduction

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HER2 es un proto-oncogene que se sobreexpresa y amplificado en 15-30% de todos cánceres de mama invasivo1,2. Sobreexpresión de HER2 se infiere por la presencia de > 10% células con membrana fuerte inmunohistoquímica (IHC) tinción (3 +), mientras que la amplificación del gen pueden ser evaluada cuando el número de copias del gen es ≥6, o el HER2/centrómero es ≥ 2 en el recuento en por lo menos 20 células por en situ hibridación (ISH)3.

Heterogeneidad genética intra-tumor ha sido ampliamente descrito en los cánceres de mama, siendo un colaborador potencialmente adverso para la evaluación de biomarcadores y tratamientos respuesta4. Según el Colegio de patólogos americanos (CAP), HER2 heterogeneidad existe si HER2 está amplificado en > 5% y < 50% del tumor de la infiltración de las células5. Lamentablemente, la incidencia real de la heterogeneidad espacial de HER2 en cáncer de mama sigue siendo un tema de controversia entre patólogos, con algunos autores mantienen es un evento extremadamente raro, y otros que sugieren que hasta un 40% de los casos son HER2-heterogénea1,5,6,7,8,9,10. A pesar de los mecanismos biológicos que sostienen esta condición no son todavía completamente aclarado, los impactos clínicos y pronósticos de la heterogeneidad de HER2 del tumor intra son cruciales para el de pacientes de cáncer de mama11.

Recientemente, técnicas moleculares de campo brillante, como ISH cromogénica (CISH) y ISH plata (SISH), han surgido como métodos confiables para detectar heterogeneidad de HER2 en los tejidos FFPE, con algunas ventajas en comparación con a fluorescente ISH (pescado)12. Lamentablemente, el análisis de a granel de casos individuales sigue siendo poco práctico en estudios de grandes cohortes. Varios grupos han sugerido que la combinación de histoquímica, IHC y ISH con tecnologías TMA podría representar una estrategia valiosa en el estudio de cáncer biología13,14,15,16. Con este método ampliamente adoptado, las muestras de tejido de diferentes pacientes pueden analizarse al mismo tiempo, minimizar el tejido y los reactivos empleados y así fomentar el análisis uniforme de una serie grande de casos14. Sin embargo, no hay protocolos están disponibles para la caracterización molecular simultánea de alto rendimiento de múltiples muestras de tejido que experimentó diferentes de procesamiento en cuanto a reactivos, fijación de tiempos y métodos de conservación empleados, tales como archivo bloques.

Dada las implicaciones clínicas y pronósticas de heterogeneidad espacial de HER2 en cáncer de mama, hemos desarrollado una plataforma integrada de molecular para evaluar en series grandes de casos procesados heterogéneo. Aquí, describen las estrategias de laboratorio para generar y analizar la heterogeneidad intra-tumor de amplificación de HER2 en TMAs de alto rendimiento de cáncer de mama por medio de SISH. El siguiente protocolo ha sido desarrollado para medir los tumores > 5 mm (> pT1b según el TNM 2017)17. Para lesiones más pequeñas, se recomienda realizar el análisis en las secciones seriales Full-Face. Nuestro procedimiento permite el análisis simultáneo de la IHC y SISH de hasta 30 cáncer de mama, que abarca una media de 6 zonas diferenciadas (rango 4-8) para cada caso. En conjunto, se generarán 180 núcleos de tejido de 1 mm de diámetro, con 500 μm entre los núcleos y de 2 mm entre la cuadrícula y los bordes de cada bloque TMA.

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Protocol

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Este estudio fue aprobado por las juntas de revisión institucional de IRCCS Ca' Granda Fundación, Hospital Policlínico, Milán, Italia.

1. selección de pacientes y muestras de tejido

  1. Recuperar el archivo diapositivas de todos los casos a ser analizados, incluyendo todas las disponible hematoxilina y eosina (H & E) y diapositivas IHC de la diagnosis original y, si está presente, un H & E de emparejar el tejido mamario no neoplásicas (p. ej., margen quirúrgico) .
  2. Realizar comentarios de caso.
    Nota: Para esta tarea, por lo menos dos patólogos con experiencia en patología mamaria deben discutir las diapositivas diagnóstico y resolver los desacuerdos colegialmente. Utilizar herramientas de telepatología (el último en estudios multicéntricos favorezcan) o un microscopio convencional. Eventualmente, excluir todos los casos discordantes.
    1. Realizar la reclasificación histológica de todos los casos según la última edición de la clasificación de la Organización Mundial de la salud (OMS) de tumores de mama18.
    2. Asegúrese de que el tejido normal para cada caso, si está presente en las muestras clínicas archivísticas, comprende al menos una unidad ductal lobular terminal no neoplásicas.
    3. Identificar todas las zonas neoplásicas que muestra un heterogéneas citológico, arquitectónico, o IHC utilizando un microscopio de campo brillante (a realizar conjuntamente por un patólogo y la realizada que construirá los TMAs).
  3. Resaltar las áreas topográficas discretas con un marcador de la diapositiva de cristal o con la herramienta adecuada en un software de diapositivas digitales (figura 1A).
  4. En base a las diapositivas seleccionadas, recuperar los bloques FFPE correspondientes de los archivos.
    Nota: Para optimizar el TMA de construcción, para evitar el agotamiento del tejido y para preservar el TMA punch integridad estructural, casos con < 1 mm de espesor tejido residual debe ser excluido.

2. diseñar y construir basados en la técnica de Kononen TMAs

  1. Crear y abrir un nuevo archivo de hoja de cálculo incorpora los registros de las distintas áreas de cada caso. Incluir los siguientes datos en columnas separadas, como se ejemplifica en la tabla 1: identificación de caso, bloque ID, ID de área, tipo de tejido (por ejemplo, tejido normal, histotype de componente invasor, en situ componente histotype), topografía (por ejemplo, núcleo de tumor, frente invasivo), morfología (p. ej., grado nuclear, arquitectura, mitosis, características citológicas), estado de biomarcadores (es decir, del receptor del estrógeno (ER), receptor de la progesterona (PR), Ki67 y HER2) y todas las demás IHC características disponibles.
    1. Guardar el documento.
  2. Crear un proyecto TMA.
    1. Instalar y abrir el software de diseñador de TMA.
    2. Definir el destinatario TMA bloques: acceso a través del menú Archivo > Nuevo > bloque o mediante CTRL + B.
    3. Haga clic en el primer campo a llenar o presione la tecla Tab y escriba en las dimensiones de los bloques de parafina: ancho 35 (mm), altura 20 (mm). Tipo "2" como el valor de "margen" (es decir, distancia del borde de la parafina en mm) (figura 1B). Guarde los datos pulsando el botón adecuado. La nueva plantilla de bloque receptor ahora está guardado y listo para ser utilizado en plantillas de matriz de tejido nuevo.
    4. Crear un proyecto de arreglo de discos de tejido: acceso al menú Archivo > Nuevo > matriz de tejido o mediante CTRL + T.
    5. Llenar en el nombre de la matriz tejido, comentarios y el autor, a continuación, haga clic en "siguiente". Haga clic en el icono "importar", elegir el archivo de plantilla de bloque destinatario creado anteriormente y haga clic en "siguiente".
    6. Elegir 1 mm como el tamaño del punto pulsando el botón redondo. Elegir 500 μm como punto espaciado es el espacio entre dos centros de lugares vecinos. Haga clic en el icono de la calculadora para calcular el número total de puntos creado, que debe ser 231. Haga clic en "siguiente".
    7. Definir el modo de numeración de punto haciendo clic una vez en él. Haga clic en el botón "definir" para crear redes y sub redes. Eliminar la línea central (línea 6) y las columnas 8 y 15. Mantener 3 puntos de la línea 1 para la orientación. El mapa final debe abarcar a un número total de 183 puntos, según lo representado en la figura 2.
    8. Definir la lista de tipos de tejidos: acceso a través del menú Archivo > Nuevo > lista de tipos de tejidos o mediante CTRL + L.
    9. Inserte las descripciones de tejido previamente definidas. Presione flecha abajo o haga clic en el botón + para añadir una línea.
    10. Definir el proyecto: acceso a través del menú Archivo > Nuevo > proyecto o mediante CTRL + P.
    11. Llenar en el nombre de la matriz de tejido, comentarios y el autor, a continuación, haga clic en "siguiente". Importar el archivo de hoja de cálculo, lista de tipos de tejido y el modelo de matriz de tejido previamente creado haciendo clic en los iconos apropiados.
    12. Haga clic en "seleccionar todo" y definir el número de puntos para cada tipo de tejido; Haga clic en el botón de "match" para aplicar la configuración. Aparecerá en una tabla el número total de núcleos que serán muestreados y transferida a los bloques receptores en este proyecto. Guarde el proyecto y cerrar el programa.
  3. Preparar el juego del aceptador (figura 1B).
    1. Llenar moldes metálicos limpios con parafina elástica a 65 ° C.
    2. Dejar los bloques de parafina se enfríe a temperatura ambiente durante la noche dentro de los moldes de metal.
    3. Extraiga los bloques de parafina de los moldes de metal. Si se producen grietas, deseche el bloque y repetir pasos 2.3.1-2.3.3.
  4. Construir el TMA con un automatizado o semiautomatizado arrayer19.
    1. Recuperar bloques FFPE todos seleccionados y las secciones correspondientes de la H & E con anotaciones.
    2. Encienda el arrayer e inserte el bloque de aceptador en el carrusel de arrayer.
    3. Abra el software de estación de control de arrayer, haga clic en "Nueva matriz de tejido" y cargue el proyecto creado anteriormente (figura 1).
    4. Haga clic en "Continuar" y seleccione la posición de los bloques de donantes en el menú.
    5. Definir la posición de partida en cada bloque receptor: Utilice las teclas de flecha para mover la luz láser y alinee con el borde superior izquierdo en la parafina del bloque del receptor.
    6. Haga clic en "siguiente" y repita el procedimiento para la alineación vertical.
    7. Haga clic en "siguiente" para crear automáticamente un agujero en la coordenada anteriormente definida del bloque del destinatario (receptor).
    8. Vacíe el golpe.
    9. Coloque el bloque de donantes para el muestreo y eliminar una base de tejido de la zona anteriormente comentada de interés.
    10. Inserte la base de tejido de donante en el agujero en el bloque receptor (aceptador).
    11. Retire el bloque de donantes de la arrayer.
    12. Repita los pasos 2.4.5-2.4.11 hasta que se complete el TMA.
  5. Poner el lateral de tejido de lo bloque TMA recién generado en una diapositiva en blanco estéril y colocar en el horno de laboratorio a 45 ° C durante 5 minutos.
  6. Presione suavemente el bloque sobre el portaobjetos durante 5 s para aplanar los núcleos de tejido. Repetir una vez (para un total de 2 veces).
  7. Retire el bloque TMA junto con la diapositiva del horno, voltearlos y suavemente separar el bloque de la diapositiva.
  8. Cubrir la superficie del tejido TMA con una fina capa de parafina elástica a 65 ° C.
  9. Deje el bloque TMA a temperatura ambiente durante 2 h.
  10. Transferencia del bloque TMA a 4 ° C por 24 h.
    Nota: El bloque TMA puede almacenarse a 4 ° C hasta la extenuación.

3. histoquímica y análisis inmunohistoquímico

  1. Cortar secciones TMA.
    1. Coloque los bloques de aceptador TMA con el lado de la parafina hacia abajo sobre una superficie de-10 ° C durante 10 minutos enfriar la parafina.
    2. Llene una bañera de flotación con agua ultrapura y ajuste calor a 38 ° C.
    3. Coloque una hoja nueva en un micrótomo rotatorio e Inserte el bloque en el mandril para Microtomo para que el bloque de cera enfrenta a la hoja y se alinea en el plano vertical.
    4. Acercarse cuidadosamente el bloque con la cuchilla y cortar algunas secciones delgadas para asegurar que la colocación es correcta; ajustar si es necesario.
    5. Cortar 3 tramos de μm de espesor.
    6. Recoger las secciones con pinzas y flotan en la superficie del baño de agua.
    7. Escoger las secciones al baño de agua en el portaobjetos de vidrio regular e IHC/ISH.
    8. Coloque el portaobjetos sobre una rejilla y guardar en el horno a 45 ° C durante la noche.
      Nota: Una vez preparado, deben mancharse las secciones TMA dentro de 24 h.
  2. Realizar coloración histoquímica (H & E) con un autostainer.
    1. Inserte las diapositivas en el rack de reactivos autostainer y colocarlos a 60 ° C durante 10 minutos.
    2. Abra el cajón de carga del autostainer e inserte que la rejilla con el TMA se desliza en una de las estaciones de carga con un clip estándar de H & E, hacia el exterior.
    3. Una vez que se cierra el cajón, el clip será reconocido automáticamente por el sistema y comenzará el siguiente protocolo: estación de horno a 37 ° C (6 min), xileno (2 min), xileno (2 min), etanol 100% (2 min), etanol 100% (2 min), etanol 95% (2 min), etanol 95% (2 min) , agua destilada agua (4 min), hematoxilina de Carazzi (9 min), baja presión agua corriente (2 min), eosina 1% (1 minuto), presión agua corriente (2 min), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), 100% de etanol (15 s), etanol 100% (15 s) , xileno (30 s), xileno (30 s).
    4. Extraiga las rejillas del cajón y montar el portaobjetos con un cubreobjetos.
      1. Recoger una gota de Monte con una pipeta y colocar un borde exterior de la diapositiva de cubierta.
      2. Coloque el lado húmedo del cubreobjetos sobre el portaobjetos y dejar el monte seco durante 30 minutos.
  3. Realizar tinción de IHC de ER, PR, Ki67 y HER2 mediante un immunostainer automatizado.
    Nota: Antes de comenzar una carrera de tinción, el sistema y compruebe las botellas de reactivos consumibles (Tabla de materiales) y contenedores de residuos.
    1. Coloque las diapositivas TMA para analizar a 60 ° C durante 10 minutos.
    2. Iniciar el instrumento de immunostainer y software.
    3. En la vista de inicio, haga clic en el botón de protocolos y haga clic en crear/editar los protocolos.
    4. Seleccione el estándar DAB (3, 3'-diaminobenzidina) procedimiento IHC para modificar la plantilla básica.
    5. Bandera de "Parafina" en el cuadro de lista y seleccione la temperatura del medio a 72 ° C.
    6. Bandera la solución desenmascarar cc1, ajustar la temperatura del medio a 95 ° C y el tiempo de incubación en el minuto 36.
    7. Bandera de la caja del anticuerpo primario, introduzca el ID de la distribuidora en línea de ER (el software del instrumento reconocerá el dispensador en el carrusel de reactivos) y establecer el tiempo de incubación en el minuto 16.
    8. Bandera de la caja de la contratinción, seleccione hematoxilina I y sistema el tiempo de incubación en 12 minutos.
    9. Haga clic en el botón "Guardar como" y el nombre del protocolo.
    10. Repita los pasos 3.3.3-3.3.9 para los restantes anticuerpos usando los tiempos de incubación de anticuerpos primarios siguientes: PR 16 min, min 16 Ki67 y HER2 12 minutos utilizan anticuerpos previamente diluida lista para usar (RTU).
    11. En la vista de inicio, clic en crear etiqueta.
    12. Haga clic en el botón de protocolos y añadir los protocolos de ER, PR, Ki67 y HER2 para cada uno de lo TMA para analizar.
    13. Clic en el botón Cerrar /Print.
    14. Como la etiqueta de plantilla aparece, introduzca el ID de TMA para el sello.
    15. Haga clic en el botón Imprimir para imprimir las etiquetas y luego aplicarlos en las diapositivas TMA.
    16. Haga clic en el icono de instrumento y establecer el modo de inicio de instrumento como "Listo".
    17. Abra el capó que cubre el carrusel de reactivos, colocar el sistema de detección y anticuerpos primarios, entonces cierre la cubierta.
    18. Haga clic en el botón frontal en un cajón deslizante abra, cargue los portaobjetos TMA y cerrar el cajón pulsando el mismo botón.
    19. Establecer el modo de inicio de instrumento como "funcionamiento" y siga las instrucciones.
    20. Al final de la ejecución, descarga el TMA se desliza presionando el abrir todos los cajones con enjuague y botón de diapositivas completa en el instrumento de Control diapositiva en calientan con agua jabonosa para eliminar cualquier resto reactivos.
    21. Lavar los portaobjetos con baja presión agua fría, deshidratar las diapositivas TMA y aplica un cubreobjetos de cristal a cada diapositiva.
  4. Realizar análisis de IHQ de ER, PR y HER2 después de la sociedad americana de oncología clínica (ASCO) / directrices, del casquillo y de Ki67 según las recomendaciones de la Internacional Ki67 en grupo de trabajo de cáncer de mama (tabla 2).
    Nota: Este análisis debe realizarse por separado en los puntos discretos del tejido por un patólogo con experiencia en patología mamaria.
    1. Evaluar la expresión de ER como positiva si ≥ 1% de núcleos de células del tumor son immunoreactive20,21,22,23.
    2. Evaluar la expresión de PR como positiva si ≥ 1% de núcleos de células del tumor son immunoreactive20,21,22,23.
    3. Evaluar la expresión de HER2 como: a) score 3 + si membrana periférica tinción completa e intensa, b) puntuación 2 + si tinción de membrana circunferencial es incompleta o débil a moderada y > 10% de las células del tumor invasivo o completa y tinción de membrana circunferencial es intenso y ≤ 10% de las células del tumor invasivo, c) puntuación 1 + si membrana incompleta tinción es débil, apenas perceptible y a > 10% de las células del tumor invasivo, días) negativo si hay ninguna coloración o membrana la coloración es incompleta y débil, apenas perceptible y dentro ≤ 10% del tumor invasivo las células3,24.
    4. Evaluar el índice Ki67 como el porcentaje de células con tinción nuclear en las células neoplásicas por lo menos 1.000 aleatoriamente seleccionado más de 10 campos de alta potencia (aumento de 400 X)25.

4. SISH análisis de HER2

  1. Cortar secciones TMA (Repita el paso 3.1).
  2. Realizar SISH para HER2 mediante un immunostainer automatizado.
    1. Coloque las diapositivas TMA para analizar a 60 ° C durante 10 minutos.
    2. Iniciar el instrumento de immunostainer y software.
    3. En la vista de inicio, haga clic en el botón de protocolos y haga clic en crear/editar los protocolos.
    4. Seleccione el procedimiento de "CKT de ISH doble U" para modificar la plantilla básica.
    5. "Secado" de la bandera en la lista del cuadro y ajustar la temperatura a 63 ° C por 20 min.
    6. "Condicionamiento de la célula" de la bandera en la lista del cuadro, luego "célula acondicionado CC2" y ajustar la temperatura a 86 ° C y la incubación tiempo en 4 minutos.
    7. Bandera de CC2 suave (ciclo 1), estándar (ciclo 2) y extendida (ciclo 3) 8 minutos, 12 minutos y 8 minutos, respectivamente.
    8. Bandera de "ISH-proteasa 3" en la lista del cuadro y el tiempo de incubación en 16 min.
    9. Seleccione las puntas de prueba HER2DNP y CHR17DIG y establezca el tiempo de incubación en 6 h.
    10. Establezca el lavado a 76 ° C por 8 minutos.
    11. Establecer el tiempo de incubación de SISH multimer (SIL ISH DNP HRP) en el minuto 32.
    12. Establecer el tiempo de incubación de plata cromógeno (SIL ISH DNP CHRC) en 4 minutos.
    13. Establecer el tiempo de incubación de multimer rojo (rojo ISH DIG AP) en el minuto 24.
    14. Establecer el tiempo de incubación de cromógeno rojo (rojo ISH cavar FR) en 8 minutos.
    15. Bandera "contratinción" en el cuadro de lista, seleccione "Hematoxilina II" y establezca el tiempo de incubación en 8 minutos.
    16. Bandera "la contratinción de acuerdo" en el cuadro de lista, seleccione "Reactivo de azulado" y establecer el tiempo de incubación en 4 minutos.
    17. Repita los pasos de 3.3.11-3.3.15 (select modificado protocolo U Dual ISH CKT).
    18. Abierto el capó que cubre el carrusel de reactivos, colocar la ropa y los sistemas de detección de ISH, entonces cerrar la capota.
    19. Repita los pasos de 3.3.18-3.3.21.
  3. Realizar análisis SISH HER2: evaluar la amplificación del gen HER2 positivo si la relación de /CEP17 de HER2es ≥2.0 con un promedio HER2 copia número ≥4.0 las señales por la célula y negativo si la proporción de /CEP17 de HER2es < 2.0 con un promedio de HER2 Copiar número < 4.0 señales celular3,24.
    Nota: Similar a IHC, este análisis debe realizarse por separado en los puntos discretos del tejido por un patólogo con experiencia en patología mamaria.

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Representative Results

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En general, 444 mama invasivo cáncer se incorporaron 15 TMAs optimizados específicamente para análisis ISH. Entre los 2.664 puntos muestreados, 2.651 (99.5%) eran representativos de las áreas previamente seleccionadas y por lo tanto se considera favorable para análisis posteriores. Heterogeneidad intra-tumor se determinó por medio de IHC y SIH, con un enfoque particular sobre la heterogénea distribución de clones de HER2-positivo en las distintas áreas topográficas de los tumores. Tabla 3 muestra las características biológicas de los casos analizados, centrándose en el Estado HER2, ER, PR y Ki67 en diferentes histotypes. En particular, 18% de los casos fueron encontrados para exhibir las células HER-2 positivo en > 10% de las células del tumor y por lo tanto, las características para la evaluación de la positividad de HER2. Curiosamente, este valor es más cercano al extremo inferior de los cánceres de mama incidencia gama de HER-2 positivo. Por otro lado, el estado de HER2 fue variable en las áreas discretas HER2-positivo y negativo HER2 del cáncer de mama (figura 3, tabla 4), proporcionando más credibilidad a la idea de que el cáncer de mama es una enfermedad muy heterogénea en el nivel genomic. La tasa de fracaso de los análisis SISH fue 0,8%, con un total de 2.629/2.651 puntos en los que la punta de prueba etiquetada dinitrofenol une a las secuencias blanco.

Figure 1
Figura 1 : Fases de representación de la piedra angular en la realización de una plataforma de alto rendimiento para el análisis de heterogeneidad de HER2 en grandes cohortes de cánceres de mama. (A) selección de las áreas de la muestra debe incluir la identificación y el punto culminante de todas las áreas con citológico, arquitectónico, o heterogeneidad IHC. (B) uno de los pasos más críticos de este procedimiento es la creación de un bloque receptor de alta calidad, ya que incluso una grieta microscópica podría inferir la consistencia de los análisis de hibridación posterior en situ . (C) es importante emplear un arrayer digitalmente guiada con 1 aguja mm de diámetro para construir el TMA de alto rendimiento basado en la técnica de Kononen. (D) la creación del proyecto TMA debe partir de la definición de las dimensiones y las fronteras de la TMA. Análisis (E) todos IHC y ISH deben realizarse con herramientas de patología digital, para navegar rápidamente a través de la TMA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Representación planimétrica de la TMA se dio cuenta de este protocolo. Un total de 180 puntos de 1 mm de diámetro, 500 μm, permite un óptima en situ el hibridación. TMAs más densos proporcionan resultados improductivos en términos de calidad y uniformidad de las reacciones a través de todos los puntos, con una mayor tasa de fracaso en una solo punto base. Tenga en cuenta los puntos de "orientación" en la parte superior - y central izquierdo de la cuadrícula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Representante micrografías mostrando la plata en situ análisis del hibridación de un cáncer de mama HER2-heterogéneo. En este ejemplo paradigmático, dos puntos distintos de un cáncer de mama invasivo de alto grado de ningún tipo especial (BR_121) mostraron resultados diferentes en cuanto a la amplificación de HER2 gen (negro) en comparación con la sonda centromérica enumeración 17 (rojo). En particular, un área perteneciente a la base del tumor y citoqueratina 7 irregular patrón de coloración era HER2 amplificado (A), mientras que un solo punto del frente invasivo (es decir, borde del tumor) muestra un tipo HER2 patrón (B). Barras de escala = 50 μm (20 μm en los bajorrelieves). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ID de caso Bloque de identificación ID de área Tejido Topografía Morfología ER PR Ki67 HER2 Otras características IHC
BR_121 A5 un Normal Margen quirúrgico
BR_121 A1 un NST Núcleo de tumor G2 CK7 +
BR_121 A1 b NST Núcleo de tumor G3 CK7 + /-
BR_121 A3 un NST Núcleo de tumor Estroma mucinoso 90 100 12 2 +
BR_121 A3 b NST Invasiva frente Tubular 100 100 35 2 +
BR_121 A4 un NST Invasiva frente G3
BR_121 A3 c CDIS (EIC +) Adyacente al frente invasivo Alto grado 100 100 45 2 +

Tabla 1: registro representativo de un caso en el estudio. Este caso (BR_121) era un carcinoma invasivo de alto grado de ningún tipo especial con estroma mixoide focal, mostrando un componente tubular menor en la periferia de la lesión y la pérdida focal irregular de CK7 immunoexpression. Las características immunohistochemical, incluyendo biomarcadores informes, se refiere a los análisis realizados en el momento del diagnóstico. NST, carcinoma invasor de ningún tipo especial; DCIS, ductal carcinoma in situ; EIC +, componente intraductal extenso; CK7, citoqueratina 7.

Marcador Clon Empresa Dilución Desparafinado Recuperación de antígeno Incubación del anticuerpo Sistema de puntuación
ER SERVICE PACK 1 Ventana RTU Preparación para el EZ a 72 ° C CC1 a 95 ° C durante 36 minutos 16 min Guías ASCO/CAP23
PR 1E2 Ventana RTU Preparación para el EZ a 72 ° C CC1 a 95 ° C durante 36 minutos 17 min Guías ASCO/CAP23
HER2 4B5 Ventana RTU Preparación para el EZ a 72 ° C CC1 a 95 ° C durante 36 minutos 18 min. Guías ASCO/CAP3
Ki67 30-9 Ventana RTU Preparación para el EZ a 72 ° C CC1 a 95 ° C durante 36 minutos 12 min Ki67 internacional en cáncer de mama trabajo grupo recomendaciones25

Tabla 2: lista de anticuerpos, clones, diluciones, métodos de recuperación de antígeno y los sistemas de puntuación adoptados para el análisis de immunohistochemical. ER, receptor de estrógenos; PR, receptor de progesterona; RTU, listo para su uso.

Histotype n (%) ER + (%) PR + (%) Ki67-bajo (%) Ki-67-alto (%) HER2 + (%)
Carcinoma invasor de ningún tipo especial 344 (77.5) 301 (87.5) 257 (74.7) 85 (24,7) 259 (75.3) 71 (20,6)
Carcinoma lobular invasivo 53 (11,9) 53 (100.0) 44 (83.0) 36 (67.9) 17 (32.0) 4 (7.5)
Carcinoma invasor, tipo mixto 9 (2.0) 8 (88.9) 6 (66.7) 0 (0.0) 9 (100.0) 1 (11.1)
Carcinoma tubular 8 (1.8) 8 (100.0) 8 (100.0) 8 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
Carcinoma mucinoso 11 (2,4) 11 (100.0) 9 (81.8) 7 (63.6) 4 (36.4) 0 (0.0)
Carcinoma de Micropapullary 7 (1.6) 7 (100.0) 7 (100.0) 5 (71.4) 2 (28.6) 2 (28.6)
Carcinoma invasor con featueres apocrine 5 (1.1) 3 (60.0) 1 (20.0) 1 (20.0) 4 (80.0) 3 (60.0)
Carcinoma papilar 1 (0.2) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (100.0) 0 (0.0)
Carcinoma medular 4 (0.9) 0 (0.0) 1 (25.0) 0 (0.0) 4 (100.0) 0 (0.0)
Carcinoma metaplásico 2 (0.5) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0) 0 (0.0)
Total 444 391 (88.0) 333 (75.0) 142 (32.0) 302 (68.0) 81 (18,2)

Tabla 3: mama histotypes de cáncer, estado del receptor y estado de heterogeneidad HER2. ER, receptor de estrógenos; PR, receptor de progesterona; Baja de Ki67, Ki67 índice < 18%; Ki67 alta, Ki67 > 18%.

Manchas neoplásicas interpretables HER2-positivo puntos (%) Estado de receptores hormonales Casos HER2-heterogénea
6 5 (83) positiva 10
6 5 (83) negativo 1
6 4 (67) positiva 7
6 4 (67) negativo 1
6 2 (33) negativo 1
6 1 (17) positiva 1
5 3 (60) positiva 10
5 1 (20) positiva 2
4 3 (75) positiva 9
4 2 (50) positiva 8
4 1 (25) negativo 1
3 2 (67) positiva 5
3 1 (33) positiva 2
46 25 (54) 53 (93) 57

Tabla 4: HER2 expresión, estado de receptor hormonal y HER2-heterogéneos casos. Entre 57 casos HER2-heterogénea, 4 (7%) casos eran negativa ER y PR negativos, confirmando la importancia clínica de evaluación de la heterogeneidad de HER2.

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Aquí, hemos detallado las estrategias de laboratorio para realizar análisis SISH del gene HER2 y su centrómero correspondiente en TMAs de alto rendimiento de cánceres de mama heterogéneo procesados. Este método es rentable y puede llevarse a cabo en la mayoría de los laboratorios para el estudio de la heterogeneidad de amplificación del gen HER2 en cohortes grandes de los archivos de patología de mama cáncer obtenido forma.

Debido a la importancia clínica de HER2 en cáncer de mama y los desafíos generados por su expresión heterogénea, hemos desarrollado un protocolo de pruebas de alto rendimiento para evaluar intra - y inter - antitumores HER2 heterogeneidad genética. Las áreas analizadas incluyen componentes pre-invasivos e invasivos, sobre la base de específicas citológico, arquitectura y características IHC.

Hay varias fases críticas que deben manejarse con cuidado en este protocolo. Un paso esencial es la selección de las regiones de interés. Hemos determinado que la anotación de las diferentes áreas topográficas a través de un enfoque multidisciplinario es fundamental para asegurar la calidad del análisis molecular final. En particular, la revisión conjunta de las diapositivas diagnóstico realizado por un patólogo y un técnico de aumentar enormemente el número de puntos adecuados (es decir, puntos que reflejan la zona de la diapositiva) y posteriormente reducir la tasa de fallos de el análisis solo manchas. Sin embargo, varios puntos de tumor pueden ser perdidos después de secciones seriadas para múltiples análisis de IHQ e ISH. Para superar este inconveniente, se recomienda construir TMAs en duplicado o triplicado, si en todo posible basado en la disponibilidad de tejido. Además, destacamos la importancia de definir los procedimientos de laboratorio estricto para la creación de bloques FFPE aceptador para los TMAs. De hecho, hemos observado que una mínima grieta en el bloque TMA puede inferir el análisis entero de ISH en términos de calidad, la reproducibilidad y la claridad de la reacción. Si se producen grietas, el bloque de donantes debe tenerse en cuenta para la construcción de TMA. Hay que reconocer, sin embargo, que IHC puede realizarse incluso en TMAs subóptimas, y ninguna evidencia de problemas técnicos durante este análisis se han observado en nuestra experiencia.

A pesar de que este protocolo está optimizado específicamente para análisis SISH HER2 de mama de alto rendimiento TMAs, es de notar que otros análisis, como el pescado y la IHC, se pueden realizar confiablemente en varios tipos de tejido, como se describió anteriormente14, 19,26. Sin embargo, aquí hemos definido el número ideal de puntos y la característica topográfica de la TMA para análisis SISH reproducibles y de alta calidad del gen HER2 en las muestras de cáncer de mama. Otro punto importante está representado por la remodelación de los protocolos SISH automatizados para que coincida con la peculiaridad de las múltiples muestras para ser analizadas. De hecho, las directrices de los fabricantes se hacen generalmente para el análisis molecular de las secciones convencionales de toda la cara y por lo tanto no son capaces de alcanzar altos estándares en muestras de tejidos procesados heterogéneo, como en TMAs de bloques FFPE archivo. Para ello, hemos incluido una descripción paso a paso de un protocolo personalizado confiable para análisis SISH en estas muestras problemáticas.

Sería muy beneficioso explorar la heterogeneidad de expresión de HER2 y amplificación del gen con respecto a la distribución heterogénea de otros biomarcadores moleculares clínicamente útiles en el cáncer de mama. Para ello, se necesitan más estudios de investigación traslacional para explorar la validez de nuestro método para otros análisis moleculares clínicamente relevantes, tales como láser asistida por matriz de desorción/ionización spectrometry total de la proyección de imagen (MALDI-MSI)27. Recientemente, el manejo de los tejidos FFPE análisis MALDI-MSI se ha convertido en factible, aunque difícil. Esta técnica de proteómica en situ permite la visualización de la distribución espacial de las proteínas y péptidos en secciones de tejido patológico, incluyendo cáncer de mama.

Este protocolo tiene varios pasos críticos que potencialmente pueden interferir en el análisis final. En primer lugar, particular atención hacia los diferentes mecanismos subyacentes de la amplificación del HER2 . Por ejemplo, el cromosoma polysomy 17 es una aberración genética que puede ocurrir en mama cáncer11, que representa un mecanismo alternativo conocido por el mayor número de copias de HER2 . Esta condición, aunque no frecuente, puede afectar no sólo las características biológicas del cáncer y tratamiento de los pacientes, sino también el análisis ISH. En segundo lugar, ha descrito que heterogeneidad genética intra-tumor ocurre también a nivel unicelular y no sólo en diferentes áreas neoplásicas. Este protocolo no es capaz de aumentar la potencia de detección de esta condición particular en comparación con las secciones toda la cara. Además, es importante destacar que el estudio TMA de heterogeneidad espacial tiene algunas limitaciones intrínsecas, incluyendo la falta de un análisis exhaustivo de la sección entera. Este estudio, sin embargo, se debe considerar una prueba de principio que la heterogeneidad de la amplificación del gen HER2 puede evaluarse por medio de una plataforma de alto rendimiento y rentable, utilizando equipo normal de laboratorio. Se requieren estudios adicionales analizar secciones seriales Full-Face de casos HER2 heterogéneos, juntados con estudios moleculares de vanguardia y datos clínicos de los pacientes para validar este protocolo.

En conclusión, la asignación completa del estado de HER2 en heterogéneas muestras de cáncer de mama HER2 y la investigación de posibles mutaciones genéticas conductor componentes de HER2-negativo deben confiar en el análisis de múltiples regiones neoplásicas. Este análisis requeriría esfuerzos utilizando las funciones de diagnóstico estándar y costos insoportables. Este método representa una herramienta confiable para la caracterización simultánea de heterogeneidad genética de HER2 en cáncer de mama heterogéneo procesados y grandes conjuntos de múltiples.

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Disclosures

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Ninguno.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26x76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device - digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

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References

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Construcción de una plataforma de proyección de alto rendimiento para evaluar la heterogeneidad de la amplificación del gen HER2 en cáncer de mama
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Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).More

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

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