Summary

Costruire una piattaforma di High-throughput Screening per valutare l'eterogeneità dell'amplificazione del Gene HER2 nei cancri al seno

Published: December 05, 2017
doi:

Summary

Distribuzione eterogenea delle cellule HER2-positive può essere osservato in un sottogruppo di tumori al seno e genera dilemmi clinici. Qui, presentiamo un protocollo affidabile ed economico per definire, quantificare e confrontare eterogeneità genetica intra-tumore di HER2 in un’ampia serie di cancri al seno eterogeneo trasformati.

Abstract

Terapie mirate contro il recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2) hanno cambiato radicalmente il risultato dei pazienti con tumori al seno HER2-positivo. Tuttavia, una minoranza dei casi viene visualizzata una distribuzione eterogenea delle cellule HER2-positive, che genera grandi sfide cliniche. Fin qui, nessun protocolli affidabili e standardizzati per la caratterizzazione e la quantificazione dell’amplificazione del gene HER2 eterogenei in larghe coorti sono state proposte. Qui, presentiamo una metodologia di alto-rendimento per valutare contemporaneamente lo stato di HER2 in diverse aree topografiche dei cancri al seno più. In particolare, vi illustriamo la procedura di laboratorio per la costruzione di microarrays di avanzata del tessuto (TMAs) incorporando una mappatura mirata dei tumori. Tutti i parametri di TMA sono stati ottimizzati in modo specifico per l’argento in situ ibridazione (SISH) di formalina-fisso la tessuti del seno di paraffina (FFPE). L’analisi di Immunohistochemical dei biomarcatori prognostici e predittivi (cioè, ER, PR, Ki67 e HER2) deve essere eseguita utilizzando procedure automatizzate. Un protocollo personalizzato di SISH è stato implementato per consentire un’analisi molecolare di alta qualità attraverso tessuti multipli che ha subito diverse procedure di fissazione, elaborazione e archiviazione. In questo studio, forniamo un prova-de-principio che sequenze specifiche del DNA potrebbero essere tumori della mammella localizzate simultaneamente in distinte aree topografiche della multipla ed eterogeneo trasformati utilizzando un metodo efficiente ed economico.

Introduction

HER2 è un proto-oncogene che è overexpressed ed amplificato in 15-30% di tutti i invasivo al seno tumori1,2. Iperespressione di HER2 è dedotto dalla presenza di > 10% di cellule con membrana forte immunoistochimica (IHC) colorazione (3 +), mentre l’amplificazione del gene può essere valutato quando il rapporto di HER2/centromero è ≥ 2 oppure il numero di copie del gene è ≥ 6, sul conteggio almeno 20 celle di in situ di ibridazione (ISH)3.

Eterogeneità genetica intra-tumorale è stata ampiamente descritta nei cancri al seno, essendo un contributo potenzialmente negative per valutazione di biomarcatori e trattamenti risposta4. Secondo la College di patologi americani (PAC), eterogeneità di HER2 esiste se HER2 è amplificato > 5% e < 50% di infiltrazione del tumore cellule5. Purtroppo, l’incidenza effettiva della eterogeneità spaziale HER2 nei cancri al seno rimane un argomento di polemica tra patologi, con alcuni autori sostenendo che è un evento eccessivamente raro, e altri che suggeriscono che fino al 40% dei casi sono HER2-eterogenei1,5,6,7,8,9,10. Nonostante i meccanismi biologici che sono alla base di questa condizione non sono ancora completamente chiariti, l’impatto prognostico e clinico di eterogeneità di intra-tumore HER2 è cruciale per seno cancro pazienti11.

Recentemente, luminoso-campo tecniche molecolari, quali ISH cromogenica (CISH) e argento ISH (SISH), sono emersi come metodi affidabili per rilevare HER2 eterogeneità nei tessuti FFPE, con alcuni vantaggi rispetto al fluorescenti ISH (pesce)12. Purtroppo, l’analisi di massa di singoli casi rimane impraticabile in studi di coorte di grande ricerca. Parecchi gruppi hanno suggerito che la combinazione di istochimica, IHC e ISH con tecnologie TMA potrebbe rappresentare una strategia utile nello studio della biologia del cancro13,14,15,16. Con questo metodo ampiamente adottato, campioni di tessuto da pazienti diversi possono essere analizzati contemporaneamente, riducendo al minimo il tessuto e i reagenti impiegati e promuovendo così l’analisi uniforme di una grande serie di casi14. Tuttavia, nessun protocolli sono disponibile per la caratterizzazione molecolare di alto-rendimento simultanea di più campioni di tessuto che ha subito diverse elaborazione in termini di reagenti, tempi di fissazione e metodi di conservazione autonomi, tali come archivio storico blocchi.

Date le implicazioni cliniche e prognostiche di eterogeneità spaziale HER2 nei cancri al seno, abbiamo sviluppato una piattaforma integrata molecolare per valutarlo in ampia serie di casi eterogeneo trasformati. Qui, abbiamo ritrarre le strategie di laboratorio per generare e analizzare l’eterogeneità intra-tumorale di amplificazione di HER2 in high yield TMAs di cancro al seno per mezzo di SISH. Il seguente protocollo è stato sviluppato per i tumori di misura > 5 mm (> pT1b secondo il TNM 2017)17. Per le più piccole lesioni, si consiglia di eseguire l’analisi su sezioni di serie integrale. La nostra procedura consente l’analisi simultanea di IHC e SISH di fino a 30 cancri al seno, che comprende una media di 6 zone distinte (gamma 4-8) per ciascun caso. Complessivamente, 180 nuclei di tessuto di 1 mm di diametro, con 500 µm tra il core e 2 mm tra la griglia e bordi verranno generati per ogni blocco TMA.

Protocol

Questo studio è stato approvato dalla Institutional Review Boards da IRCCS Ca’ Granda Foundation, ospedale Policlinico, Milano, Italia. 1. selezione dei pazienti e dei campioni di tessuto Recuperare le diapositive archiviazione di tutti i casi per essere analizzati, compresi tutti i disponibile ematossilina ed eosina (H & E) e diapositive IHC dalla diagnosi originale e, se presente, un H & E di abbinati tessuto neoplastico mammario (ad es., margine chirurgico) . …

Representative Results

Nel complesso, al seno invasivo 444 cancri sono stati incorporati in 15 TMAs specificamente ottimizzato per analisi ISH. Tra i luoghi di 2.664 campionati, 2.651 (99,5%) fossero rappresentative delle zone precedentemente selezionate e quindi considerati suscettibili per analisi successive. Eterogeneità intra-tumorale è stata determinata mediante IHC e SIH, con un focus particolare sulle distribuzioni eterogenee dei cloni di HER2-positive nelle distinte aree topografiche dei tumori. <stro…

Discussion

Qui, noi abbiamo dettagliato le strategie di laboratorio per eseguire analisi di SISH del gene HER2 e suo centromero corrispondente in TMAs ad alto rendimento dei cancri al seno eterogeneo trasformati. Questo metodo è conveniente e può essere effettuato nella maggior parte dei laboratori per lo studio dell’eterogeneità di amplificazione genica di HER2 in larghe coorti di seno tumori Estratto forma patologia archivi.

Data l’importanza clinica di HER2 test nel cancro al seno…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nessuno.

Materials

Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26×76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device – digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

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Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

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