Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Het opbouwen van een High-throughput Screening Platform te beoordelen van de heterogeniteit van de HER2-gen Amplification in kanker van de borst

doi: 10.3791/56686 Published: December 5, 2017

Summary

Heterogene verdeling van de HER2-positieve cellen kan worden waargenomen in een subset van kanker van de borst en genereert klinische dilemma's. Hier introduceren we een betrouwbare en voordelige protocol definiëren, meten en vergelijken van HER2 intra-tumor genetische heterogeniteit in een groot aantal ongelijkmatig verwerkte borstkankers.

Abstract

Gerichte therapieën tegen de menselijke epidermale groeifactor receptor 2 (HER2) hebben de uitkomst van patiënten met kanker van de borst van de HER2-positieve radicaal veranderd. Een minderheid van de gevallen wordt echter een heterogene verdeling van de HER2-positieve cellen, die grote klinische uitdagingen genereert weergegeven. Tot op heden hebben geen betrouwbare en gestandaardiseerde protocollen voor de karakterisering en de kwantificering van de heterogene gen HER2 versterking in grote cohorten voorgesteld. Hier presenteren we een high-throughput methodologie om te beoordelen gelijktijdig de HER2-status over verschillende topografische gebieden van meerdere kanker van de borst. In het bijzonder, illustreren we de procedure laboratorium voor de bouw van verbeterde weefsel microarrays (TMAs) integratie van een gerichte toewijzing van de tumoren. Alle parameters van de TMA zijn speciaal geoptimaliseerd voor het zilver in situ hybridisatie (SISH) van formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) borstweefsels. Analyse van Immunohistochemical van de prognostische en voorspellende biomarkers (dat wil zeggen, ER, PR, Ki67 en HER2) moet worden uitgevoerd met gebruikmaking van geautomatiseerde procedures. Een aangepaste SISH protocol is geïmplementeerd zodat een moleculaire analyse van hoge kwaliteit over meerdere weefsels die onderging verschillende procedures voor fixatie, verwerking en opslag. In deze studie bieden wij een bewijs-van-principe dat specifieke opeenvolgingen van DNA gelokaliseerde gelijktijdig op topografische vlakken van meerdere en ongelijkmatig verwerkte borstkankers met behulp van een efficiënte en kosteneffectieve methode zou kunnen zijn.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HER2 is een oncogen dat overexpressie en versterkt in 15-30% van alle invasieve borst kanker1,2. HER2 overexpressie is afgeleid door de aanwezigheid van > 10% cellen met sterke membraan immunohistochemische (IHC) kleuring (3 +), terwijl de versterking van het gen kan worden beoordeeld wanneer de verhouding van de HER2/centromeer ≥2 is ofwel dat het exemplaaraantal gene ≥6, op te tellen bij minste 20 cellen door in situ hybridisatie (ISH)3.

Intra-tumor genetische heterogeniteit is wijd beschreven in kanker van de borst, wordt een potentieel negatieve bijdrage aan de evaluatie van biomarkers en behandelingen reactie4. Volgens het College van Amerikaanse pathologen (GLB), HER2 heterogeniteit bestaat als HER2 wordt versterkt > 5% en < 50% van het infiltreren van tumor cellen5. Helaas, de werkelijke incidentie van HER2 ruimtelijke heterogeniteit in kanker van de borst blijft een onderwerp van controverse tussen de pathologen, met sommige auteurs onderhouden dat het is een uiterst zeldzaam evenement en anderen suggereren dat tot 40% van de gevallen zijn HER2-heterogene1,5,6,7,8,9,10. Ondanks de biologische mechanismen die ten grondslag liggen aan deze voorwaarde zijn niet nog volledig opgehelderd, de prognostische en klinische effecten van intra-tumor HER2 heterogeniteit zijn cruciaal voor borst kanker patiënten11.

Onlangs, helder-veld moleculaire technieken, zoals chromogenic ISH (CISH) en zilveren ISH (SISH), opgedoken als betrouwbare methoden voor het detecteren van HER2 heterogeniteit in FFPE weefsels, met een aantal voordelen ten opzichte van TL ISH (vis)12. Helaas blijft de bulk analyse van individuele gevallen onpraktisch in groot-cohort onderzoeken. Verschillende groepen hebben gesuggereerd dat de combinatie van histochemie, IHC en ISH met TMA technologieën een waardevolle strategie in de studie van biologie van kanker13,14,15,16 vertegenwoordigen kan. Met deze wijd goedgekeurde methode kunnen weefselmonsters van verschillende patiënten worden geanalyseerd gelijktijdig, minimaliseren van de weefsels en reagentia werkzaam en daardoor de bevordering van de uniforme analyse van een groot aantal gevallen14. Er zijn echter geen protocollen beschikbaar voor de gelijktijdige hoog-productie moleculaire karakterisering van meerdere weefselmonsters die onderging verschillende verwerking in termen van reagentia, fixatie tijden en conserveringsmethoden werknemer, bijvoorbeeld als archivering blokken.

Gezien de prognostische en klinische implicaties van HER2 tot ruimtelijke heterogeniteit in borstkanker, ontwikkelden we een geïntegreerde moleculaire platform om te beoordelen in grote reeks ongelijkmatig verwerkte gevallen. Hier, schilderen we de laboratorium-strategieën om te genereren en analyseren van de intra-tumor heterogeniteit van versterking van de HER2 in high yield TMAs van borstkanker door middel van SISH. Het volgende protocol is ontwikkeld voor tumoren meten van > 5 mm (> pT1b volgens het TNM-2017)17. Voor kleinere letsels, is het aan te raden de analyses uitvoeren met full-face seriële secties. Onze procedure zorgt voor de gelijktijdige IHC en SISH analyse van maximaal 30 kanker van de borst, met een gemiddelde van 6 vlakken (bereik 4-8) voor elk geval. Over het geheel genomen zal 180 weefsel kernen van 1 mm in diameter, met 500 µm tussen de kernen, en 2 mm tussen het raster en de randen worden gegenereerd voor elk TMA-blok.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele evaluatie Boards uit IRCCS Ca' Granda Foundation, Policlinico ziekenhuis, Milan, Italië.

1. de selectie van patiënten en weefsel Specimens

  1. Ophalen van de archivering slides van alle gevallen te worden geanalyseerd, met inbegrip van alle beschikbare haematoxyline en eosine (H & E) en IHC dia's uit de oorspronkelijke diagnose en, indien aanwezig, een H & E van niet-neoplastische borstweefsel (b.v., chirurgische marge) evenementen .
  2. Uitvoeren van case Beoordelingen.
    Opmerking: Voor deze taak, ten minste twee pathologen met ervaring in borst pathologie moeten de diagnostische dia's bespreken en oplossen collegially. Een conventionele Microscoop of hulpmiddelen van de telepathology (de laatste in de multicentrische studie gunst) gebruiken. Indien van toepassing, sluit u alle disharmonische gevallen.
    1. Histologische opnieuw declassificatie van alle gevallen volgens de nieuwste editie van de World Health Organization (WHO) classificatie van tumoren van de borst18uitvoeren
    2. Zorg ervoor dat het normale weefsel voor elk geval, indien aanwezig in het archief klinische monsters, ten minste één niet-neoplastische terminal ductaal-lobulair eenheid omvat.
    3. Identificeren van neoplastische overal die aantonen dat heterogene cytologische, architecturale, of IHC functies met een helder-veld Microscoop (gezamenlijk worden uitgevoerd door een patholoog en de technician(s) die de TMAs zal bouwen).
  3. De discrete topografische gebieden markeren met een viltstift op het glasplaatje of met het juiste gereedschap op een digitale dia software (figuur 1A).
  4. Op basis van de geselecteerde dia's, het ophalen van de overeenkomstige FFPE blokken uit de archieven.
    Opmerking: Voor het optimaliseren van de TMA bouw, voorkomen van uitputting van het weefsel, en het behoud van de TMA punch structurele integriteit, gevallen met < 1 mm dik resterende weefsel dienen te worden uitgesloten.

2. ontwerp en bouw van TMAs gebaseerd op de techniek Kononen

  1. Maken en openen van een nieuwe spreadsheet-bestand waarin de records van de verschillende gebieden van elk geval. Neemt u de volgende gegevens op afzonderlijke kolommen, zoals wordt geïllustreerd in tabel 1: geval ID, blok ID, gebieds-ID, weefseltype (bijvoorbeeldnormale weefsel, invasieve component histotype, in situ component histotype), topografie (bijvoorbeeld, de kern van de tumor, invasieve voorzijde), morfologie (b.v., nucleaire rang, architectuur, tussen, cytologische functies), biomarkers status (d.w.z., oestrogeen receptor (ER), progesteron receptor (PR), Ki67 en HER2), en alle andere IHC functies beschikbaar.
    1. Sla het document.
  2. Maak een TMA-project.
    1. Installeer en open de TMA designer software.
    2. Definiëren van de TMA-ontvanger scripttags: toegang via het menu Bestand > Nieuw > blok of met behulp van CTRL + B.
    3. Klik in het eerste veld te vullen of druk op de Tab-toets, en typ de afmetingen van het blok van de paraffine in: breedte 35 (mm), hoogte 20 (mm). Type "2" als de "marge" (dat wil zeggen, afstand van paraffine rand in mm) (figuur 1B). Sla de gegevens door te klikken op de juiste knop. De nieuwe sjabloon van geadresseerden blok wordt nu opgeslagen en klaar om te worden gebruikt in nieuwe weefsel matrix sjablonen.
    4. Maak een weefsel matrix project: toegang tot het menu Bestand > Nieuw > weefsel Array of met behulp van CTRL + T.
    5. Vul in naam van de matrix weefsel, opmerkingen en auteur, klik op "volgende". Klik op het pictogram 'import', kies het sjabloonbestand van geadresseerden blok eerder hebt gemaakt en klik op "next."
    6. 1 mm als de plek grootte kiezen door te klikken op de ronde knop. Kies 500 µm als plek afstand die de ruimte tussen twee centra van naburige plaatsen. Klik op het calculatorpictogram voor het berekenen van het totale aantal vlekken gemaakt, die 231 moet. Klik op "volgende".
    7. Definieer de plek nummering modus door eenmaal op te klikken. Klik op de knop "definiëren" om rasters en sub rasters te maken. Verwijderen van de central line (lijn 6) en de kolommen 8 en 15. 3 plaatsen van lijn 1 voor oriëntatie te handhaven. De laatste kaart dienen te gelden voor een totaal van 183 plekken, zoals wordt weergegeven in Figuur 2.
    8. De lijst met weefseltypes (HLA) definiëren: toegang via het menu Bestand > Nieuw > lijst weefseltypes (HLA) of met behulp van CTRL + L.
    9. Plaats de beschrijvingen van de weefsel eerder gedefinieerd. Druk op pijl-omlaag of klik op de + knop een regel toe te voegen.
    10. Definiëren van het project: toegang via het menu Bestand > Nieuw > Booster project of met behulp van CTRL + P.
    11. Vul in naam van het weefsel matrix, opmerkingen en auteur, klik op "volgende". Het werkbladbestand, lijst van weefseltypes (HLA) en het weefsel matrix model eerder gemaakt door te klikken op de juiste pictogrammen te importeren.
    12. Klik op 'Alles selecteren' en geef het aantal plekken voor elk weefseltype; Klik op de "match"-knop om de instellingen toe te passen. Er verschijnt een tabel met het totale aantal cores dat zal worden bemonsterd en overgedragen aan geadresseerden blokken in dit project. Sla het project op en sluit het programma.
  3. Bereiden de acceptor scripttags (figuur 1B).
    1. Vul gereinigd metalen mallen met elastische paraffine bij 65 ° C.
    2. Laat de paraffineblokken afkoelen bij kamertemperatuur 's nachts binnenkant van de metalen mallen.
    3. Het uittreksel van de paraffineblokken van de metalen mallen. Als scheuren optreden, het negeren van het blok en herhaalt u stappen 2.3.1-2.3.3.
  4. Construeer de TMA met behulp van een automatische of semi-automatische arrayer-19.
    1. Het ophalen van alle geselecteerde FFPE blokken en de desbetreffende secties van de H & E met aantekeningen.
    2. Schakel de arrayer en plaats de acceptor scripttags op de arrayer carrousel.
    3. De arrayer control station-software niet openen, klik op "Nieuwe weefsel Array", en laden van het project eerder gemaakt (Figuur 1 c).
    4. Klik op "Doorgaan" en selecteer de positie van de donor vak(ken) in het menu.
    5. Definiëren van de startpositie op elke ontvangende blok: gebruik de pijltjestoetsen te bewegen van het laserlicht en lijnen met de rand van de linksboven op de paraffine van het ontvangende blok.
    6. Klik op "volgende" en herhaal voor de verticale uitlijning.
    7. Klik op "volgende" om automatisch een gat te maken in de eerder gedefinieerde coördinaat van de ontvanger (acceptor) blok.
    8. Leeg de punch.
    9. Plaats het blok van de donor voor bemonstering en een kern van weefsel te verwijderen uit het eerder geannoteerde gebied van belang.
    10. Steek de donor weefsel kern in het gat in het blok van de ontvanger (acceptor).
    11. De donor blok uit de arrayer verwijderen.
    12. Herhaal de stappen 2.4.5-2.4.11 om de TMA is voltooid.
  5. De kant van het weefsel van het nieuw gegenereerde TMA blok zetten een steriele lege dia en plaats ze in de oven lab bij 45 ° C gedurende 5 min.
  6. Druk zachtjes op het blok op de dia voor 5 s tot het afvlakken van de kernen van weefsel. Herhaal deze stappen eenmaal (voor 2 keer in totaal).
  7. Verwijder het blok van de TMA samen met de dia uit de oven, spiegelen ze en voorzichtig losmaken van het blok van de dia's.
  8. Dekking van het oppervlak van TMA weefsel met een dun laagje van elastische paraffine bij 65 ° C.
  9. Laat de TMA-blok bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
  10. Overdracht van de TMA-blok bij 4 ° C gedurende 24 uur.
    Opmerking: Het TMA blok kan worden achtergelaten bij 4 ° C tot uitputting.

3. histochemische en immunohistochemische Analyses

  1. TMA secties gesneden.
    1. Leg de TMA acceptor scripttags met de paraffine-zijde naar beneden op een oppervlak van-10 ° C gedurende 10 minuten te koelen de paraffine.
    2. Vul een floating bad met ultrazuiver water en warmte ingesteld op 38 ° C.
    3. Plaats een nieuw mes op rotary microtome en invoegen van het blok in de microtoom chuck, zodat de wax blok wordt geconfronteerd met het mes en wordt uitgelijnd in het verticale vlak.
    4. Aanpak van het blok zorgvuldig met het mes en snijd een paar dunne secties zodat de positionering klopt; Pas indien nodig.
    5. Snijd 3 µm dik secties.
    6. Pak de secties met pincet en drijven hen op het wateroppervlak bad.
    7. Kies de gedeelten uit het waterbad op regelmatige en IHC/ISH glas dia's.
    8. Plaats van de dia's op een rek en bewaar ze in de oven op 45 ° C's nachts.
      Opmerking: Zodra voorbereid, de TMA-secties moeten worden gekleurd binnen de 24u.
  2. Histochemische kleuring (H & E) uit te voeren met behulp van een autostainer.
    1. De dia's invoegen in de autostainer rek en plaats ze op 60 ° C gedurende 10 minuten.
    2. Open de lade van de belasting van de autostainer en plaats die het rek met de TMA dia's in een van de stations laden met een standaard H & E clip naar buiten gericht.
    3. Zodra de lade wordt gesloten, de clip zal automatisch worden herkend door het systeem en het volgende protocol zal beginnen: oven station bij 37 ° C (6 min), xyleen (2 min), xyleen (2 min), ethanol 100% (2 min), ethanol 100% (2 min), ethanol 95% (2 min), ethanol 95% (2 min) , gedistilleerd water (4 min), Carazzi de Haematoxyline (9 min), lagedruk stromend water (2 min), eosine 1% (1 min), lagedruk stromend water (2 min), ethanol 95% (20 s), ethanol 95% (20 s), ethanol 95% (20 s), ethanol 95% (20 s), ethanol 100% (15 s), ethanol 100% (15 s) , xyleen (30 s), xyleen (30 s).
    4. Uitladen van de rekken van de lade en monteer de dia met een cover slip.
      1. Verzamelen van een daling van zware montering met een pipet en zet het op een buitenste rand van de dia deksel.
      2. Plaats van de natte kant van de cover slip op de dia en laat de mount drogen voor 30 min.
  3. Uitvoeren van IHC kleuring voor ER, PR, Ki67 en HER2 met behulp van een geautomatiseerde immunostainer.
    Opmerking: Voordat u begint een kleuring run, opstarten van het systeem, controleren de verbruiksartikelen reagens flessen (Tabel van materialen) en afval containers.
    1. Plaats de TMA dia's te analyseren op 60 ° C gedurende 10 minuten.
    2. Immunostainer instrument en software te starten.
    3. Op de Home-weergave, klikt u op de knop van de protocollen en klik op Maak/wijzig protocollen.
    4. Selecteer de standaard DAB (3, 3'-diaminobenzidine) IHC procedure voor het wijzigen van de basismalplaatje.
    5. "Deparaffinization" in de keuzelijst te markeren en stel de Medium temperatuur bij 72 ° C.
    6. Vlag van de cc1 ontmaskeren oplossing, stelt u de temperatuur van het Medium bij 95 ° C, en de incubatietijd op 36 min.
    7. Het primaire antilichaam vak markeren, de ID van de ER inline dispenser (de instrument software herkent de dispenser op de reagens carrousel) invoegen en de incubatietijd vastgesteldop 16 min.
    8. Vlag van het Counterstaining vak, selecteert u de Haematoxyline ik, en stel de incubatietijd op 12 min.
    9. Klik op de knop "Opslaan als" en de naam van het protocol.
    10. Herhaal de stappen 3.3.3-3.3.9 voor de resterende antilichamen met behulp van de volgende primaire antilichamen incubatie tijden: PR 16 min, Ki67 16 min en HER2 12 min. gebruik vooraf verdunde kant-en-klare (RTU) antilichamen.
    11. Op de Home-weergave, klikt u op de knop etiketten maken.
    12. Klik op de knop van de protocollen en voeg de ER, PR, Ki67 en HER2 protocollen voor elk van de TMA te analyseren.
    13. Klik op de knop sluiten /Print.
    14. Zoals de labelsjabloon wordt weergegeven, voert u de TMA-id's voor de label.
    15. Klik op de knop Afdrukken om de etiketten afdrukken en deze vervolgens toepassen op de TMA dia's.
    16. Klik op het pictogram van het instrument en stel de modus voor het opstarten van het instrument als "Ready".
    17. Open de kap dat betrekking heeft op de reagentia carrousel, plaats het detectiesysteem en primaire antilichamen, sluit de motorkap.
    18. Klik op de knop aan de voorzijde op een dia-lade openen, laden de TMA-dia's, en sluit de lade door te klikken op dezelfde knop.
    19. De opstartmodus van het instrument als "Running" instellen en volg de instructies.
    20. Aan het einde van de uitvoering, unload de TMA dia's door te drukken op de Open alle lades met dia's voltooid knop op het instrument Slide Control en spoel warm ze in zeepsop om te verwijderen van alle resterende reagentia.
    21. Wassen van de dia's onder lagedruk koud stromend water, uitdrogen van de TMA-dia's, en een glas dekglaasje aan toepassen op elke dia.
  4. IHC analyses of ER, PR, HER2 uit te voeren na de Amerikaanse maatschappij van klinische oncologie (ASCO) / dop van de richtsnoeren, en van Ki67 volgens de aanbevelingen van de internationale Ki67 in borstkanker werkgroep (tabel 2).
    Opmerking: Deze analyse moet worden uitgevoerd afzonderlijk in de vlekken discrete weefsel door een patholoog met een ervaring in borst pathologie.
    1. De expressie ER positief bent van ≥ 1% van de tumor celkernen op immunoreactive20,21,22,23te beoordelen.
    2. De expressie van de PR als positief bent van ≥ 1% van de tumor celkernen op immunoreactive20,21,22,23te beoordelen.
    3. Beoordelen van de HER2-expressie als: a) score 3 + als ze membraan kleuring die volledig en intens, b) score 2 + als ze membraan kleuring is onvolledig en/of zwakke/matig en binnen > 10% van de invasieve tumorcellen of volledige en ze membraan kleuring is intens en binnen ≤ 10% van de invasieve tumorcellen, c) score 1 + indien onvolledig membraan kleuring zwakke/nauwelijks merkbaar is en binnen > 10% van de invasieve tumorcellen, d) negatief als ontbreekt niet geen vlekken of membraan kleuring is onvolledig en zwakke/nauwelijks waarneembare en binnen ≤ 10 procent van de invasieve tumor cellen3,24.
    4. Beoordelen van de Ki67-index, zoals het percentage cellen met nucleaire kleuring in ten minste 1.000 neoplastische cellen willekeurig geselecteerd meer dan 10 high-power velden (400 X vergroting)25.

4. SISH analyse van HER2

  1. Gesneden TMA secties (Herhaal stap 3.1).
  2. Uitvoeren van SISH voor HER2 met behulp van een geautomatiseerde immunostainer.
    1. Plaats de TMA dia's te analyseren op 60 ° C gedurende 10 minuten.
    2. Immunostainer instrument en software te starten.
    3. Op de Home-weergave, klikt u op de knop van de protocollen en klik op Maak/wijzig protocollen.
    4. Selecteer de "U Dual ISH CKT" procedure voor het wijzigen van de basismalplaatje.
    5. Vlag van "Drogen" in de keuzelijst en de temperatuur instellen op 63 ° C gedurende 20 minuten.
    6. Vlag van "Cel Conditioning" in de keuzelijst, vervolgens "cel Conditioning CC2", en de temperatuur tijdens de 86 ° C en incubatie op 4 min ingesteld.
    7. Vlag CC2 milde (cyclus 1), Standard (cyclus 2) en uitgebreid (cyclus 3) voor 8 minuten en 12 min 8 min, respectievelijk.
    8. Vlag van "ISH-Protease 3" in de keuzelijst en de incubatietijd vastgesteldop 16 min.
    9. Selecteer de sondes, HER2DNP en CHR17DIG en de incubatietijd vastgesteldop 6 h.
    10. Het wassen vastgesteldop 76 ° C gedurende 8 minuten.
    11. De incubatietijd van de SISH-multimer (SIL ISH DNP HRP) op 32 min instellen
    12. De incubatietijd van zilveren chromogeen (SIL ISH DNP CHRC) vastgesteldop 4 min.
    13. De rode multimer (rode ISH graven AP) incubatietijd vastgesteldop 24 min.
    14. De incubatietijd van rode chromogeen (rode ISH graven FR) vastgesteld op 8 min.
    15. Vlag "Counterstaining" in de keuzelijst, selecteer "HAEMATOXYLINE II" en de incubatietijd vastgesteldop 8 min.
    16. Vlag "na Counterstaining" in de keuzelijst, selecteer "BLAUWSEL reagens", en de incubatietijd vastgesteldop 4 min.
    17. Herhaal de stappen van 3.3.11-3.3.15 (Selecteer bewerkt U Dual ISH CKT protocol).
    18. Open de kap dat betrekking heeft op de reagentia carrousel, plaats het wassen en het ISH detectiesystemen en vervolgens sluit de motorkap.
    19. Herhaal de stappen van de 3.3.18-3.3.21.
  3. SISH analyses uit te voeren voor HER2: de versterking van de gen HER2 als positief beoordelen als de HER2/CEP17 ratio ≥2.0 met een gemiddelde HER2 kopie nummer ≥4.0 signalen per cel is, en negatief als de HER2/CEP17 ratio is < 2.0 met een gemiddelde HER2 kopiëren nummer < 4.0 signalen/cel3,24.
    Opmerking: Gelijkaardig aan IHC, deze analyse moet worden uitgevoerd afzonderlijk in de vlekken discrete weefsel door een patholoog met ervaring in borst pathologie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Globaal, 444 invasieve borst kanker in 15 TMAs specifiek geoptimaliseerd voor ISH analyses zijn opgenomen. Onder de 2,664 plekken bemonsterd, 2,651 (99,5%) waren van de vertegenwoordiger van de eerder geselecteerde gebieden en daarom vatbaar voor latere analyses. Intra-tumor heterogeniteit werd bepaald door middel van IHC en SIH, met een nadruk op de heterogene distributies van HER2-positieve klonen in de topografische vlakken van de tumoren. Tabel 3 toont de biologische kenmerken van de gevallen die geanalyseerd, zich te concentreren op de ER, PR, Ki67 en HER2-status binnen verschillende histotypes. In het bijzonder, 18% van de gevallen werden gevonden om weer te geven van de HER2-positieve cellen in > 10% van tumorcellen, en daarom gepaard moet gaan de kenmerken voor HER2 positiviteit beoordeling. Interessant, is deze waarde dichter bij de onderkant van de gerapporteerde incidentie bereik van HER2-positieve kanker van de borst. Aan de andere kant, was de HER2-status variabele in de afgeschermde gebieden van zowel de HER2-negatieve als de HER2-positieve borstkanker (Figuur 3, tabel 4), die verder geloof aan het idee dat borstkanker is een uiterst heterogene ziekte op het genomisch niveau. Het percentage mislukkingen van de SISH-analyse was 0,8%, met een totaal aantal van 2,629/2,651 plekken waarbij de sonde dinitrofenol-gelabeld aan de target-sequenties gebonden.

Figure 1
Figuur 1 : Vertegenwoordiging van de hoeksteen fasen in de realisatie van een high-throughput platform voor de analyse van de HER2 heterogeniteit in grote cohorten van borstkankers. (A) selectie van de gebieden om te proeven moet omvatten de identificatie en het hoogtepunt van alle gebieden met cytologische, architecturale, of IHC heterogeniteit. (B) een van de belangrijkste stappen van deze procedure is het creëren van een kwalitatief hoogwaardige acceptor blok, gezien het feit dat zelfs een microscopische barst de consistentie van de latere in situ hybridisatie analyses kan afleiden. (C) het is belangrijk om een digitaal geleide arrayer met een 1 mm diameter naald om te bouwen van high yield TMA gebaseerd op de Kononen techniek in dienst. (D) de oprichting van de TMA-project moet starten vanuit de definitie van de dimensies en de grenzen van de TMA. (E) alle IHC en ISH analyses moeten worden uitgevoerd met behulp van digitale pathologie tools, om snel navigeren over de TMA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Planimetrische weergave van de TMA gerealiseerd voor dit protocol. Een totaal van 180 plekken van 1 mm doorsnede, 500 µm uit elkaar, toestaan voor een optimale in situ -hybridisatie. Dichtere TMAs bieden onproductieve resultaten in termen van de algehele kwaliteit en uniformiteit van de reacties via alle spots, met een hoger percentage mislukkingen op basis van de single-spot. Opmerking de "oriëntatie" vlekken in boven - en midden-links van het raster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Representatief microfoto tonen de zilveren in situ analyse van de kruising van een HER2-heterogene borstkanker. In dit voorbeeld paradigmatische toonde twee verschillende plaatsen van een hoogwaardige invasieve borstkanker van geen speciaal type (BR_121) verschillende resultaten in termen van HER2 -gen (zwart) versterking in vergelijking met de centromeric opsomming sonde 17 (rood). In het bijzonder één gebied behoren tot de kern van de tumor en tonen cytokeratin 7 onregelmatige kleuring patroon was HER2 versterkt (A), terwijl een enkele plek van de invasieve voorzijde (d.w.z., tumor edge) een wild-type HER2 weergegeven patroon (B). Schaal bars = 50 µm (20 µm in de inzetstukken). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Zaak-ID Blok-ID Gebieds-ID Weefsel Topografie Morfologie EMERGENCY PR Ki67 HER2 Andere functies van de IHC
BR_121 A5 een Normaal Chirurgische marge
BR_121 A1 een NST Kern van de tumor G2 CK7 +
BR_121 A1 b NST Kern van de tumor G3 CK7 +/-
BR_121 A3 een NST Kern van de tumor Mucinous stroma 90 100 12 2 +
BR_121 A3 b NST Invasieve voorzijde Buisvormige 100 100 35 2 +
BR_121 A4 een NST Invasieve voorzijde G3
BR_121 A3 c DCIS (EIC +) Grenzend aan invasieve voorzijde Hoogwaardige 100 100 45 2 +

Tabel 1: vertegenwoordiger record van één geval opgenomen in de studie. Deze zaak (BR_121) was een hoogwaardige invasief carcinoom van geen speciaal type met focale myxoid stroma, tonen een kleine buisvormige onderdelen op de periferie van de laesie, en focale-onregelmatige verlies van CK7 immunoexpression. De immunohistochemische functies, waaronder biomarkers rapportage, verwijst naar de analyses uitgevoerd op het moment van diagnose. NST, invasief carcinoom geen speciale soort; DCIS, ductaal carcinoma in situ; EIC +, uitgebreide intraductal component; CK7, cytokeratin 7.

Marker Kloon Bedrijf Verdunning Wasuitsmeltovens Antigeen ophalen Antilichaam-incubatie Scoresysteem
EMERGENCY SP1 Ventana RTU EZ prep bij 72 ° C CC1 bij 95 ° C gedurende 36 min 16 min ASCO/CAP richtsnoeren23
PR 1E2 Ventana RTU EZ prep bij 72 ° C CC1 bij 95 ° C gedurende 36 min 17 min ASCO/CAP richtsnoeren23
HER2 4B5 Ventana RTU EZ prep bij 72 ° C CC1 bij 95 ° C gedurende 36 min 18 min ASCO/CAP richtsnoeren3
Ki67 30-9 Ventana RTU EZ prep bij 72 ° C CC1 bij 95 ° C gedurende 36 min 12 min Internationale Ki67 bij borstkanker werkt de groep aanbevelingen25

Tabel 2: lijst van antilichamen, klonen, verdunningen, antigeen ophalen methoden en scoren systemen voor immunohistochemische analyses vastgesteld. ER, oestrogeen receptor; PR, progesteron receptor; RTU, kant-en-klare.

Histotype n (%) ER + (%) PR + (%) Ki67-lage (%) Ki-67-high (%) HER2 + (%)
Invasief carcinoom geen speciale soort 344 (77,5) 301 (87,5) 257 (74,7) 85 (24,7) 259 (75,3) 71 (20,6)
Invasief lobulair carcinoom 53 (11,9) 53 (100.0) 44 (83.0) 36 (67,9) 17 (32,0) 4 (7.5)
Invasief carcinoom, gemengd-type 9 (2.0) 8 (88,9) 6 (66,7) 0 (0,0) 9 (100,0) 1 (11.1)
Tubulair carcinoom 8 (1.8) 8 (100,0) 8 (100,0) 8 (100,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
Mucinous carcinoom 11 (2.4) 11 (100,0) 9 (81,8) 7 (63,6) 4 (36,4) 0 (0,0)
Micropapullary carcinoom 7 (1.6) 7 (100,0) 7 (100,0) 5 (71,4) 2 (28,6) 2 (28,6)
Invasief carcinoom met apocrine featueres 5 (1.1) 3 (60,0) 1 (20,0) 1 (20,0) 4 (80,0) 3 (60,0)
Papillaire carcinoom 1 (0.2) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (100,0) 0 (0,0)
Wallenberg carcinoom 4 (0.9) 0 (0,0) 1 (25,0) 0 (0,0) 4 (100,0) 0 (0,0)
Metaplastic carcinoom 2 (0.5) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (100,0) 0 (0,0)
Totaal 444 391 (88.0) 333 (75,0) 142 (32,0) 302 (68.0) 81 (18.2)

Tabel 3: borst kanker histotypes, de status van de receptor en de HER2 heterogeniteit status. ER, oestrogeen receptor; PR, progesteron receptor; Ki67-laag, Ki67 index < 18%; Ki67-hoog, Ki67 > 18%.

Interpreteerbaar neoplastische vlekken HER2-positieve plekken (%) Hormoon receptoren status HER2-heterogene gevallen
6 5 (83) positieve 10
6 5 (83) negatieve 1
6 4 (67) positieve 7
6 4 (67) negatieve 1
6 2 (33) negatieve 1
6 1 (17) positieve 1
5 3 (60) positieve 10
5 1 (20) positieve 2
4 3 (75) positieve 9
4 2 (50) positieve 8
4 1 (25) negatieve 1
3 2 (67) positieve 5
3 1 (33) positieve 2
46 25 (54) 53 (93) 57

Tabel 4: HER2 expressie, status van hormoon-receptor en HER2-heterogene gevallen. Onder 57 HER2-heterogene gevallen waren 4 (7%) gevallen ER-negatief en PR-negatieve, bevestiging van de klinische belang van het beoordelen van de HER2 heterogeniteit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

We beschikken hier over de laboratorium-strategieën uit te voeren SISH analyses van het HER2 -gen en de bijbehorende centromeer in high yield TMAs van ongelijkmatig verwerkte borstkankers gedetailleerde. Deze methode is rendabel en in de meeste laboratoria voor de studie van HER2 gene amplificatie heterogeniteit in grote cohorten van borst kanker ontvangen formulier pathologie archieven kan worden uitgevoerd.

Vanwege het klinische belang van HER2 in borstkanker en de uitdagingen die voortvloeien uit de heterogene expressie testen, ontwikkelden we een protocol high-throughput testen om te beoordelen intra - en intersite - tumor HER2 genetische heterogeniteit. De geanalyseerde gebieden bevatten vooraf invasieve en invasieve onderdelen, op basis van specifieke cytologische, architecturale en IHC functies.

Er zijn verschillende kritische fasen die zorgvuldig moeten worden beheerd in dit protocol. Een essentiële stap is de selectie van de regio's van belang. We hebben vastgesteld dat de aantekening van de verschillende topografische gebieden door middel van een multidisciplinaire aanpak cruciaal is om de kwaliteit van de uiteindelijke moleculaire analyse. In het bijzonder de gezamenlijke herziening van de diagnostische dia's uitgevoerd door een patholoog en een technicus enorm toenemen van het aantal voldoende plekken (d.w.z., vlekken als gevolg van het gebied geïdentificeerd op de dia) en vervolgens het verminderen van het percentage mislukkingen van de single-plekken-analyse. Verschillende plekken van de tumor kunnen echter verloren zijn na seriële secties voor meerdere IHC en ISH analyses. Om te overwinnen dit ongemak, het is raadzaam bouw TMAs in dubbele of drievoud, als helemaal haalbaar op basis van weefsel beschikbaarheid. Bovendien benadrukken we het belang van strikte laboratorium procedures voor de oprichting van de acceptor FFPE blokken voor de TMAs definiëren. Inderdaad, wij hebben geconstateerd dat een minimale barst in het TMA-blok de hele ISH analyse in termen van kwaliteit, reproduceerbaarheid en duidelijkheid van de reactie zou kunnen afleiden. Als er scheuren optreden, het blok van de donor moet buiten beschouwing worden gelaten voor TMA bouw. Het moet worden erkend, echter dat IHC zelfs in suboptimaal TMAs kon worden uitgevoerd, en geen bewijs van technische problemen tijdens een dergelijke analyse zijn waargenomen in onze ervaring.

Ondanks dat dit protocol is speciaal geoptimaliseerd voor HER2 SISH analyses van high yield borst TMAs, het is voor de opmerking dat andere analyses, zoals vis en IHC, op betrouwbare wijze kunnen worden uitgevoerd in verschillende weefseltypes (HLA), als eerder beschreven14, 19,26. Echter hebben we hierin gedefinieerd het ideale aantal spots en de topografische karakteristiek van de TMA om kwalitatief hoogwaardige en reproduceerbaar SISH analyses van het HER2 -gen in borst kanker exemplaren. Een ander belangrijk punt is vertegenwoordigd door het hervormen van standaardprotocollen geautomatiseerde SISH overeenkomen met de bijzonderheid van de meerdere monsters worden geanalyseerd. Inderdaad, de fabrikanten richtsnoeren zijn meestal gemaakt voor de moleculaire analyse van conventionele full-face secties, en daarom niet in staat zijn te bereiken van hoge normen voor ongelijkmatig verwerkte weefsels monsters, zoals in TMAs vanaf archivering FFPE blokken. Daartoe hebben wij een stapsgewijze beschrijving van een betrouwbaar protocol voor aangepaste verstrekt voor SISH analyses in deze problematische monsters.

Het zou zeer nuttig zijn om te verkennen de heterogeniteit van de HER2 expressie en gene versterking in verband met de heterogene verdeling van andere klinisch bruikbare moleculaire biomarkers in borstkanker. Te dien einde zijn verdere translationeel onderzoekstudies nodig om te verkennen van de geldigheid van onze methode voor andere klinisch relevante moleculaire analyses, zoals laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie imaging (MALDI-MSI)27. Onlangs, is het beheer van FFPE weefsels MALDI-MSI p.a. geworden haalbaar is, zij het uitdagende. Deze proteomic in situ techniek maakt het mogelijk voor de visualisatie van de ruimtelijke spreiding van de eiwitten en peptiden in pathologische weefselsecties, met inbegrip van borstkanker.

Dit protocol heeft verschillende kritische stappen die mogelijk met de uiteindelijke analyse interfereren kunnen. Eerste, bijzondere aandacht moet uitgaan naar de verschillende mechanismen ten grondslag liggen aan de HER2 versterking. Chromosoom 17 polysomy is bijvoorbeeld een genetische afwijking die zich in borst kanker11 voordoen kan, een bekende alternatieve mechanisme voor de verhoogde HER2 -exemplaaraantal vertegenwoordigen. Deze aandoening, hoewel niet frequent, invloed kan zijn op niet alleen de biologische kenmerken van de kanker en patiëntenbeheer, maar ook de ISH-analyses. Ten tweede, is het beschreven dat genetische heterogeniteit van de intra-tumor ook op het niveau van een eencellige en niet alleen in verschillende neoplastische gebieden optreden. Dit protocol is niet kunnen verhogen de macht van de opsporing van deze bijzondere situatie in vergelijking met full-face secties. Bovendien is het belangrijk om te benadrukken dat de TMA gebaseerde studie van ruimtelijke heterogeniteit kent een aantal intrinsieke beperkingen, met inbegrip van het ontbreken van een uitgebreide analyse van de hele sectie. Deze studie, echter moet worden overwogen een bewijs-van-principe dat de heterogeniteit van de HER2 -gen versterking kan worden beoordeeld door middel van een high-throughput en kosteneffectieve platform, met behulp van de gebruikelijke laboratoriumbenodigdheden. Verdere studies analyseren van seriële full-face secties van de HER2-heterogene gevallen, in combinatie met cutting-edge moleculaire studies en klinische gegevens van patiënten moeten voor het valideren van dit protocol.

Kortom, moeten de uitgebreide toewijzing van de HER2-status in de heterogene HER2 borst kanker exemplaren en het onderzoek naar mogelijke genetische mutaties van de bestuurder in HER2-negatieve onderdelen vertrouwen op de analyse van veelvoudige neoplastische gebieden. Deze analyse zou ondraaglijk kosten en inspanningen die met behulp van standaard diagnostische faciliteiten vereisen. Deze methode geeft een betrouwbaar hulpmiddel voor de gelijktijdige karakterisering van de genetische heterogeniteit HER2 in grote sets van meerdere en ongelijkmatig verwerkte borstkankers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs er geen conflicten optreden van belangen.

Acknowledgments

Geen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26x76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device - digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136, (6), 864-871 (2011).
  2. Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232, (2), 219-229 (2014).
  3. Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31, (31), 3997-4013 (2013).
  4. Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12, (8), 1021-1032 (2012).
  5. Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133, (4), 611-612 (2009).
  6. Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54, (3), 532-538 (2011).
  7. Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64, (12), 1112-1116 (2011).
  8. Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. 'Genetic heterogeneity' in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25, (5), 683-688 (2012).
  9. Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136, (2), 266-274 (2011).
  10. Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25, (7), 938-948 (2012).
  11. Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27, (1), 4-18 (2014).
  12. Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now? Expert Rev Mol Diagn. 15, (3), 385-398 (2015).
  13. Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10, (12), e0144923 (2015).
  14. Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies - a systematic literature review. Histopathology. 68, (3), 323-332 (2016).
  15. Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16, (8), 1266-1270 (2016).
  16. Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26, (6), 816-824 (2013).
  17. Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. Eight, Springer International Publishing. (2017).
  18. Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. WHO Classification of Tumours of the Breast. 4th, IARC press. (2012).
  19. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4, (7), 844-847 (1998).
  20. Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68, (2), 262-271 (2016).
  21. Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29, (11), 1292-1305 (2016).
  22. Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70, (6), 906-917 (2017).
  23. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28, (16), 2784-2795 (2010).
  24. Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22, (35), 7926-7937 (2016).
  25. Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103, (22), 1656-1664 (2011).
  26. Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14, (3), R93 (2012).
  27. De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11, (6), 1507-1514 (2015).
Het opbouwen van een High-throughput Screening Platform te beoordelen van de heterogeniteit van de HER2-gen Amplification in kanker van de borst
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).More

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter