Heterogen fordeling af HER2-positive celler kan observeres i en delmængde af brystkræft og genererer kliniske dilemmaer. Her introducerer vi en pålidelig og omkostningseffektiv protokol for at definere, kvantificere og sammenligne HER2 intra-tumor genetiske heterogenitet i en lang række uensartet forarbejdede brystkræft.
Målrettede behandlinger mod human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2) har radikalt ændret resultatet af patienter med HER2-positiv brystkræft. Et mindretal af tilfælde viser dog en heterogen fordeling af HER2-positive celler, som genererer store klinisk udfordringer. Til dato, er blevet foreslået nogen pålidelige og standardiserede protokoller til karakterisering og kvantificering af HER2 heterogene gen amplifikation i store kohorter. Her præsenterer vi en høj overførselshastighed metode til at vurdere samtidig HER2 status på tværs af forskellige topografisk områder af flere brystkræft. Især illustrere vi laboratorieprocedure at konstruere forbedret væv microarrays (TMAs) omfatter en målrettet kortlægning af tumorer. Alle TMA parametre er blevet specielt optimeret til sølv i situ hybridisering (SISH) af formalin-fast paraffin-embedded (FFPE) bryst væv. Immunhistokemisk analyse af prognostiske og prædiktive biomarkører (dvs.ER, PR, Ki67 og HER2) bør udføres ved hjælp af automatiserede procedurer. En tilpasset SISH protokol er blevet gennemført for at tillade en høj kvalitet Molekylær analyse på tværs af flere væv, der undergik forskellige fiksering, behandling og lagring procedurer. I denne undersøgelse giver vi en proof-of-principle, specifikke DNA sekvenser kan være lokaliseret samtidigt i særskilte topografisk områder af flere og uensartet forarbejdede brystkræft ved hjælp af en effektiv og omkostningseffektiv metode.
HER2 er en proto-oncogene, der er overexpressed og forstærket i 15-30% af alle invasiv brystkræft kræft1,2. HER2 overekspression er udledes af tilstedeværelsen af > 10% celler med stærk membran immunhistokemiske (IHC) farvning (3 +), mens gen amplifikation kan vurderes, når enten HER2/centromer forholdet er ≥2 eller gen kopi nummer er ≥6, på optælling på mindst 20 celler i situ hybridisering (ISH)3.
Intra-tumor genetiske heterogenitet er blevet bredt beskrevet i brystkræft, er en potentielt negative bidragyder til biomarkører evaluering og behandlinger svar4. Efter College af amerikanske patologer (CAP), HER2 heterogenitet eksisterer hvis HER2 forstærkes i > 5% og < 50% af infiltrerer tumor celler5. Desværre, den faktiske forekomst af HER2 rumlige heterogenitet i brystkræft er stadig genstand for uenighed blandt patologer, med nogle forfattere, vedligeholdelse, det er en overordentlig sjælden begivenhed, og andre tyder på, at op til 40% af tilfældene er HER2-heterogene1,5,6,7,8,9,10. Trods de biologiske mekanismer, der underbygger denne betingelse er ikke endnu fuldt afklaret, prognostiske og kliniske konsekvenser af intra-tumor HER2 heterogenitet er afgørende for breast cancer patienter11.
Lysfelt molekylære teknikker, såsom kromogent ISH (CISH) og sølv ISH (SISH), har for nylig dukket op som pålidelige metoder til at opdage HER2 heterogenitet i FFPE væv, med nogle fordele i forhold til fluorescerende ISH (fisk)12. Desværre, hovedparten analyse af enkelt tilfælde forbliver upraktisk i store-kohorten forskningsundersøgelser. Flere grupper har foreslået, at kombinationen af histokemi, IHC og ISH med TMA teknologier kunne repræsentere en værdifuld strategi i studiet af kræft biologi13,14,15,16. Med denne bredt vedtaget metode, kan vævsprøver fra forskellige patienter analyseres samtidig minimere væv og reagenser ansat og derved fremme en ensartet analyse af en lang række tilfælde14. Men ingen protokoller er tilgængelige for den samtidige høj overførselshastighed Molekylær karakterisering af flere vævsprøver, der undergik forskellige behandling reagenser, fiksering gange og bevarelse metoder erhvervsdrivende, sådan som arkivering blokke.
Givet de prognostiske og kliniske implikationer af HER2 rumlige heterogenitet i brystkræft, udviklet vi en integreret Molekylær platform for at vurdere det i store serier af uensartet forarbejdede tilfælde. Her, skildre vi laboratorium strategier til at generere og analysere intra-tumor heterogeniteten af HER2 forstærkning i højtydende TMAs af brystkræft ved hjælp af SISH. Følgende protokol er blevet udviklet for tumorer måling > 5 mm (> pT1b ifølge TNM-2017)17. For mindre læsioner anbefaler vi udfører analysen på full-face seriel sektioner. Vores procedure giver mulighed for den samtidige IHC og SISH analyse af op til 30 brystkræft, som omfatter en middelværdi på 6 forskellige områder (område 4-8) for hver enkelt sag. Alt i alt vil 180 væv kerner af 1 mm i diameter, med 500 µm mellem kerner og 2 mm mellem grid og kanter blive genereret for hver TMA blok.
Her, har vi detaljerede laboratorium strategier til at udføre SISH analyser af HER2 genet og dens tilsvarende centromer i højtydende TMAs af uensartet forarbejdede brystkræft. Denne metode er omkostningseffektive og kan udføres i de fleste laboratorier for studiet af HER2 genet forstærkning heterogenitet i store kohorter af bryst kræft hentet form patologi arkiver.
På grund af den kliniske betydning af HER2 test i brystkræft og de udfordringer, der er genereret af den…
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
Surgipath Paraplast | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 39601006 | Tissue embedding medium, 56 °C melting point |
Eosin Y 1% water solution | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 510002 | Eosin yellowish, water-soluble |
Carazzi’s hematoxylin | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 506012 | Alum hematoxylin ripened using potassium iodate |
Diamond quality | Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU | 33533 | 26×76 mm microscope slides |
Leica CV Mount | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 14046430011 | Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene |
FLEX IHC microscope slides | Agilent Technologies (Dako), Santa Clara, CA, USA | K8020 | Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC |
BenchMark ULTRA | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | N750-BMKU-FS | Slide staining system |
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4324 | Primary antibody, ready-to-use |
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2223 | Primary antibody, ready-to-use |
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4286 | Primary antibody, ready-to-use |
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4493 | Primary antibody, ready-to-use |
ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-500 | Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies |
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4422 | INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients |
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-098 | |
ultraView Red ISH DIG Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-505 | |
ISH Protease 3 | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4149 | Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest |
Hematoxylin | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2021 | Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent |
Hematoxylin II Counterstaining | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2208 | Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent |
Bluing reagent | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2037 | Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides |
HybReady | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4409 | Formamide-based buffer for ISH assays |
EZ Prep (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-102 | Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10. |
SSC Buffer (10X) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-110 | Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5. |
ULTRA LCS | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 650-210 | Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions |
Reaction Buffer (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-300 | Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10. |
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-223 | Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use. |
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-224 | |
ultraView Silver Wash II | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-003 | Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps |
Microtome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | RM 2255 | Automated rotary microtome |
Multistainer | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | ST 5020 | Workstation for automated staining and coverslipping |
Minicore 1 | Alphelys, Plaisir, France, EU | 00-MICO-1 | Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software |
Aperio ScanScope CS2 | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | K080254 | Image capture device – digital pathology scanner |
Tissue-Tek III Uni-Cassette | Sakura Finetek Europe B.V | 4135 | Cassette |
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold | Sakura Finetek Europe B.V | 7055 | Stainless-Steel base metal mold |