Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Opbygge en høj overførselshastighed Screening Platform til at vurdere heterogenitet af HER2 genet forstærkning i brystkræft

doi: 10.3791/56686 Published: December 5, 2017

Summary

Heterogen fordeling af HER2-positive celler kan observeres i en delmængde af brystkræft og genererer kliniske dilemmaer. Her introducerer vi en pålidelig og omkostningseffektiv protokol for at definere, kvantificere og sammenligne HER2 intra-tumor genetiske heterogenitet i en lang række uensartet forarbejdede brystkræft.

Abstract

Målrettede behandlinger mod human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2) har radikalt ændret resultatet af patienter med HER2-positiv brystkræft. Et mindretal af tilfælde viser dog en heterogen fordeling af HER2-positive celler, som genererer store klinisk udfordringer. Til dato, er blevet foreslået nogen pålidelige og standardiserede protokoller til karakterisering og kvantificering af HER2 heterogene gen amplifikation i store kohorter. Her præsenterer vi en høj overførselshastighed metode til at vurdere samtidig HER2 status på tværs af forskellige topografisk områder af flere brystkræft. Især illustrere vi laboratorieprocedure at konstruere forbedret væv microarrays (TMAs) omfatter en målrettet kortlægning af tumorer. Alle TMA parametre er blevet specielt optimeret til sølv i situ hybridisering (SISH) af formalin-fast paraffin-embedded (FFPE) bryst væv. Immunhistokemisk analyse af prognostiske og prædiktive biomarkører (dvs.ER, PR, Ki67 og HER2) bør udføres ved hjælp af automatiserede procedurer. En tilpasset SISH protokol er blevet gennemført for at tillade en høj kvalitet Molekylær analyse på tværs af flere væv, der undergik forskellige fiksering, behandling og lagring procedurer. I denne undersøgelse giver vi en proof-of-principle, specifikke DNA sekvenser kan være lokaliseret samtidigt i særskilte topografisk områder af flere og uensartet forarbejdede brystkræft ved hjælp af en effektiv og omkostningseffektiv metode.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HER2 er en proto-oncogene, der er overexpressed og forstærket i 15-30% af alle invasiv brystkræft kræft1,2. HER2 overekspression er udledes af tilstedeværelsen af > 10% celler med stærk membran immunhistokemiske (IHC) farvning (3 +), mens gen amplifikation kan vurderes, når enten HER2/centromer forholdet er ≥2 eller gen kopi nummer er ≥6, på optælling på mindst 20 celler i situ hybridisering (ISH)3.

Intra-tumor genetiske heterogenitet er blevet bredt beskrevet i brystkræft, er en potentielt negative bidragyder til biomarkører evaluering og behandlinger svar4. Efter College af amerikanske patologer (CAP), HER2 heterogenitet eksisterer hvis HER2 forstærkes i > 5% og < 50% af infiltrerer tumor celler5. Desværre, den faktiske forekomst af HER2 rumlige heterogenitet i brystkræft er stadig genstand for uenighed blandt patologer, med nogle forfattere, vedligeholdelse, det er en overordentlig sjælden begivenhed, og andre tyder på, at op til 40% af tilfældene er HER2-heterogene1,5,6,7,8,9,10. Trods de biologiske mekanismer, der underbygger denne betingelse er ikke endnu fuldt afklaret, prognostiske og kliniske konsekvenser af intra-tumor HER2 heterogenitet er afgørende for breast cancer patienter11.

Lysfelt molekylære teknikker, såsom kromogent ISH (CISH) og sølv ISH (SISH), har for nylig dukket op som pålidelige metoder til at opdage HER2 heterogenitet i FFPE væv, med nogle fordele i forhold til fluorescerende ISH (fisk)12. Desværre, hovedparten analyse af enkelt tilfælde forbliver upraktisk i store-kohorten forskningsundersøgelser. Flere grupper har foreslået, at kombinationen af histokemi, IHC og ISH med TMA teknologier kunne repræsentere en værdifuld strategi i studiet af kræft biologi13,14,15,16. Med denne bredt vedtaget metode, kan vævsprøver fra forskellige patienter analyseres samtidig minimere væv og reagenser ansat og derved fremme en ensartet analyse af en lang række tilfælde14. Men ingen protokoller er tilgængelige for den samtidige høj overførselshastighed Molekylær karakterisering af flere vævsprøver, der undergik forskellige behandling reagenser, fiksering gange og bevarelse metoder erhvervsdrivende, sådan som arkivering blokke.

Givet de prognostiske og kliniske implikationer af HER2 rumlige heterogenitet i brystkræft, udviklet vi en integreret Molekylær platform for at vurdere det i store serier af uensartet forarbejdede tilfælde. Her, skildre vi laboratorium strategier til at generere og analysere intra-tumor heterogeniteten af HER2 forstærkning i højtydende TMAs af brystkræft ved hjælp af SISH. Følgende protokol er blevet udviklet for tumorer måling > 5 mm (> pT1b ifølge TNM-2017)17. For mindre læsioner anbefaler vi udfører analysen på full-face seriel sektioner. Vores procedure giver mulighed for den samtidige IHC og SISH analyse af op til 30 brystkræft, som omfatter en middelværdi på 6 forskellige områder (område 4-8) for hver enkelt sag. Alt i alt vil 180 væv kerner af 1 mm i diameter, med 500 µm mellem kerner og 2 mm mellem grid og kanter blive genereret for hver TMA blok.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne undersøgelse blev godkendt af institutionelle Review bestyrelserne fra IRCCS Ca' Granda Foundation, Policlinico Hospital, Milano, Italien.

1. udvælgelse af patienter og væv prøver

  1. Hente arkivers slides af alle sager skal analyseres, herunder alle de tilgængelige hæmatoxylin og eosin (H & E) og IHC dias fra den oprindelige diagnose, og hvis til stede, ene H & E af matchede ikke-neoplastiske brystvæv (fx, kirurgiske margin) .
  2. Udføre sag anmeldelser.
    Bemærk: Til denne opgave, mindst to patologer med erfaring i bryst patologi bør diskutere de diagnostiske dias og løse uenigheder collegially. Brug enten en konventionel mikroskop eller telepathology værktøjer (favor sidstnævnte i polycentrisk undersøgelser). Hvis nogen, udelukke alle uharmoniske tilfælde.
    1. Udføre den histologiske omklassificering af alle tilfælde ifølge den seneste udgave af World Health Organization (WHO) klassifikation af tumorer i brystet18.
    2. Sikre, at den normale væv for hver enkelt sag, hvis den findes i de arkivers kliniske prøver, omfatter mindst én ikke-neoplastiske terminal duktalt-dråbeformede enhed.
    3. Identificere alle neoplastiske områder, der viser heterogene cytologiske, arkitektoniske, eller IHC funktioner ved hjælp af et mikroskop for lyse-felt (skal udføres i fællesskab af en patolog og den technician(s), der vil konstruere TMAs).
  3. Fremhæve de diskrete topografisk områder med en markør på glas dias eller med det rette værktøj på en digital slide software (figur 1A).
  4. Baseret på de markerede dias, hente de tilsvarende FFPE blokke fra arkiverne.
    Bemærk: for at optimere TMA konstruktion, undgå væv udtynding og bevare TMA punch strukturelle integritet, tilfælde med < 1 mm tyk resterende væv bør udelukkes.

2. designe og konstruere TMAs baseret på den Kononen teknik

  1. Oprette og åbne en ny regnearkfil indarbejde optegnelser af de forskellige områder i hvert enkelt tilfælde. Omfatter følgende data på separate kolonner, som eksemplificeret i tabel 1: sags-ID, blok ID, område-ID, vævstype (fxnormale væv invasiv komponent histotype, og i situ -komponent histotype), topografi (fx, tumor kerne, invasiv forreste), morfologi (fx, nukleare grade, arkitektur, mitoses, cytologiske funktioner), biomarkører status (dvs., østrogen receptor (ER), progesteron receptor (PR), Ki67 og HER2), og alle andre tilgængelige IHC funktioner.
    1. Gem dokumentet.
  2. Oprette et TMA projekt.
    1. Installere og åbne TMA designer software.
    2. Definere TMA modtageren nummersekvens: adgang via menuen Filer > Ny > blok eller ved hjælp af CTRL + B.
    3. Klik i det første felt til at udfylde eller trykke på tabulatortasten, og skriv i dimensioner af paraffin blok: bredde 35 (mm), højde 20 (mm). Type "2" som værdien for "margen" (dvs., afstand fra paraffin kant i mm) (figur 1B). Gemme data ved at klikke på den passende knap. Den nye skabelon af modtagerens blok er nu gemt og klar til at blive brugt i nye væv array skabeloner.
    4. Oprette et væv array projekt: adgang til menuen Filer > Ny > væv Array eller ved hjælp af CTRL + T.
    5. Udfyld navn væv-array, kommentarer og forfatter, så klik på "næste". Klik på ikonet "import", Vælg skabelonfil af modtagerens blok tidligere har oprettet, og klik på "næste".
    6. Vælg 1 mm som spot størrelse ved at klikke på den runde knap. Vælg 500 µm som spot afstand, som er afstanden mellem to centre i nærliggende steder. Klik på ikonet lommeregner til at beregne det samlede antal steder lavet, som skulle være 231. Klik på "næste".
    7. Definere den spot nummerering tilstand ved at klikke en gang på det. Klik på knappen "definere" for at oprette gitre og sub gitre. Slet den centrale linje (linje 6) og kolonne 8 og 15. Vedligeholde 3 steder i linje 1 til orientering. Den endelige kort bør omfatte et samlet antal på 183 steder, som er repræsenteret i figur 2.
    8. Definere listen over vævstyper: adgang via menuen Filer > Ny > liste af vævstyper eller ved hjælp af CTRL + L.
    9. Indsæt væv beskrivelser som tidligere er defineret. Tryk på pil ned eller klik på den + knappen for at tilføje en linje.
    10. Definere projektet: adgang via menuen Filer > Ny > Booster projekt eller ved hjælp af CTRL + s.
    11. Udfyld navn væv array, kommentarer og forfatter, så klik på "næste". Importere regnearksfilen, liste over vævstyper og væv array model tidligere oprettede ved at klikke på de rigtige ikoner.
    12. Klik på "Vælg alle" og definere antallet af steder for hver vævstype; Klik på knappen "match" til at anvende indstillinger. Der vises en tabel over det samlede antal kerner, som vil blive udtaget og overført til modtagerens blokke i dette projekt. Gem projektet og Luk programmet.
  3. Forberede acceptor nummersekvens (figur 1B).
    1. Fyld renset metal forme med elastisk paraffin på 65 ° C.
    2. Forlade paraffinblokke afkøles ved rumtemperatur natten over i de metal forme.
    3. Uddrag paraffinblokke fra metal forme. Hvis der opstår revner, kassere blokken og gentage trin 2.3.1-2.3.3.
  4. Konstruere TMA ved hjælp af en automatiseret eller semi-automatiske arrayer19.
    1. Hente alle valgte FFPE blokke og de tilsvarende H & E afsnit med anmærkninger.
    2. Tænd arrayer og indsætte acceptor nummersekvens på arrayer karrusel.
    3. Åbn arrayer kontrol station software, skal du klikke på "Nyt væv Array" og indlæse projektet tidligere oprettede (figur 1 c).
    4. Klik på "Fortsæt" og Vælg placeringen af donor nummersekvens i menuen.
    5. Definere udgangsposition på hver modtager blok: Brug piletasterne til at flytte laserlys og justere det med den øverste venstre kant på paraffin af den modtagende blok.
    6. Klik på "næste" og Gentag for den lodrette justering.
    7. Klik på "næste" for at automatisk oprette et hul i den tidligere definerede koordinat for modtageren (acceptor) blok.
    8. Tomme punch.
    9. Placer donor blok for prøveudtagning og fjerne en væv kerne fra den tidligere kommenteret område af interesse.
    10. Indsætte donor væv kernen i hullet i modtageren (acceptor) blok.
    11. Fjerne donor blok fra arrayer.
    12. Gentag trin 2.4.5-2.4.11 indtil TMA er afsluttet.
  5. Sat væv side af den nyligt genererede TMA blok på en steril tomt dias og placere dem i lab ovnen ved 45 ° C i 5 min.
  6. Tryk forsigtigt på blokken på slide for 5 s at flade væv kerner. Gentag én gang (for ialt 2 gange).
  7. Fjerne TMA blok sammen med diasset fra ovnen og vende dem forsigtigt løsne blok fra diaset.
  8. Dække TMA væv overfladen med et tyndt lag af elastisk paraffin på 65 ° C.
  9. Forlade TMA blok ved stuetemperatur i 2 timer.
  10. Overføre TMA blok ved 4 ° C i 24 timer.
    Bemærk: TMA blok kan opbevares ved 4 ° C indtil udmattelse.

3. histokemiske og immunhistokemiske analyser

  1. Skær TMA sektioner.
    1. Placer TMA acceptor nummersekvens med paraffin-side ned på en overflade,-10 ° C i 10 min at chill paraffin.
    2. Fyld en flydemidler bad med ultrarent vand og sat varme til 38 ° C.
    3. Placere en ny klinge på en Rotationsmikrotom og indsætter mikrotomen chuck blokken, så voks blokere vender bladet og er afstemt i det lodrette plan.
    4. Tilgang blokken omhyggeligt med blad og skær nogle tynde sektioner for at sikre positionering er korrekte; Juster om nødvendigt.
    5. Skær 3 µm tykt sektioner.
    6. Afhente sektioner ved hjælp af pincet og flyde dem på bad vandoverfladen.
    7. Vælge afsnittene ud vandbad på regelmæssig og IHC/ISH glas lysbilleder.
    8. Placer diasene på en rist og gemme dem i ovnen ved 45 ° C natten over.
      Bemærk: Når der tilberedes, TMA sektioner skal farves inden for 24 timer.
  2. Udføre histokemiske farvning (H & E) ved hjælp af en autostainer.
    1. Indsæt diassene i autostainer rack og placere dem på 60 ° C i 10 min.
    2. Åbn belastning skuffen autostainer og Indsæt rack med TMA dias i en af belastning stationerne med en standard H & E klip udad.
    3. Når skuffen er lukket, klippet genkendes automatisk af systemet og følgende protokol vil starte: ovn station ved 37 ° C (6 min), xylen (2 min), xylen (2 min), ethanol 100% (2 min), ethanol 100% (2 min), ethanol 95% (2 min), ethanol 95% (2 min) , destilleret vand (4 min), Carazzis hæmatoxylin (9 min), lavtryks rindende vand (2 min), eosin 1% (1 min), lavtryks rindende vand (2 min), ethanol 95% (20 s), ethanol 95% (20 s), ethanol 95% (20 s), ethanol 95% (20 s), ethanol 100% (15 s), ethanol 100% (15 s) , xylen (30 s), xylen (30 s).
    4. Læsse racks fra skuffen og mount diaset med et cover slip.
      1. Indsamle en dråbe af mount med en pipette og sætte det på en ydre kant af dækslet dias.
      2. Læg den våde side af dækslet slip på diaset og lad mount tørre i 30 min.
  3. Udføre IHC farvning for ER, PR, Ki67 og HER2 ved hjælp af en automatiseret immunostainer.
    Bemærk: Før du begynder en farvnings-run, opstart af systemet, og kontroller hjælpematerialer reagensflaskerne (Table of Materials) og affald beholdere.
    1. Objektglassene TMA at analysere på 60 ° C i 10 min.
    2. Start immunostainer instrument og software.
    3. Klik på knappen protokoller på visningen Startside, og klik derefter på Opret/Rediger protokoller.
    4. Vælg den standard DAB (3, 3'-diaminobenzidine) IHC procedure til at ændre den grundlæggende skabelon.
    5. Flag "Deparaffinization" i listen og indstille den Medium temperatur på 72 ° C.
    6. Flag cc1 demaskering løsning, angive Medium temperatur på 95 ° C og inkubationstiden på 36 min.
    7. Flag boksen primære antistof, indsætte ID'ET for den ER indbygget dispenser (instrument software vil genkende dispenseren på reagens karrusel) og angive inkubationstiden på 16 min.
    8. Marker boksen Counterstaining, Vælg hæmatoxylin jeg, og sæt inkubationstiden på 12 min.
    9. Klik på knappen "Gem som" og navngiv protokollen.
    10. Gentag trin 3.3.3-3.3.9 for de resterende antistoffer ved hjælp af følgende primære antistoffer inkubation times: PR 16 min., Ki67 16 min. og HER2 12 min. brug forud fortyndede klar til brug (RTU) antistoffer.
    11. Klik på knappen Opret etiket på visningen startside.
    12. Klik på knappen protokoller og tilføje protokollerne ER, PR, Ki67 og HER2 for hver af TMA til at analysere.
    13. Klik på knappen Luk /Print.
    14. Som etiketten skabelon vises, skal du indtaste TMA-id'er for etiketten.
    15. Klik på knappen Udskriv for at udskrive etiketterne og derefter anvende dem på TMA dias.
    16. Klik på ikonet instrument og indstille instrument start mode som "Klar".
    17. Åbne hætten, der dækker reagenser karrusel, placere detektionssystemets og primære antistoffer, Luk hætten.
    18. Klik på knappen foran på et dias skuffe til at åbne det, indlæse TMA dias og luk skuffen ved at klikke på den samme knap.
    19. Sæt instrumentet start mode som "kører" og følg instruktionerne.
    20. I slutningen af den opstille, losse TMA dias ved at trykke på den åbne alle skuffer med afsluttet dias knappen på instrumentets glider kontrol og skyl varmt dem i sæbevand vand for at fjerne enhver resterende reagenser.
    21. Vaske dias under lavtryks koldt vand, dehydrere TMA dias og dækglas glas til hver dias.
  4. IHC analyse ER, PR og HER2 efter det amerikanske samfund af kliniske Oncology (ASCO) / CAP retningslinjer, og af Ki67 overensstemmelse med anbefalingerne fra den internationale Ki67 i Breast Cancer gruppe (tabel 2).
    Bemærk: Denne analyse skal udføres separat i diskrete væv steder af en patolog med erfaring med bryst patologi.
    1. Vurdere ER udtryk som positiv, hvis ≥ 1% af tumor cellekerner er immunoreaktive20,21,22,23.
    2. Vurdere PR udtryk som positiv, hvis ≥ 1% af tumor cellekerner er immunoreaktive20,21,22,23.
    3. Vurdere HER2 udtryk som: a) score 3 + Hvis omkredsen membran farvning, er komplet og intens, b) score 2 + Hvis omkredsen membran farvning er ufuldstændige og/eller svage/moderat og > 10% af invasive tumorcellerne eller komplet og intens og med ≤ 10% af invasiv tumorcellerne, c er omkredsen membran farvning) score 1 + Hvis ufuldstændige membran farvning er svag/næsten umærkelig og > 10% af invasiv tumorcellerne, d) negativ hvis ingen farvning er til stede eller membran farvning er ufuldstændige og svag/næsten umærkelig og inden for ≤ 10% af de invasive tumor celler3,24.
    4. Vurdere Ki67 index, som procentdelen af celler med nukleare farvning i mindst 1.000 neoplastiske celler tilfældigt valgt over 10 high-power felter (forstørrelse, 400 X)25.

4. SISH analyse af HER2

  1. Skær TMA sektioner (Gentag trin 3.1).
  2. Udføre SISH for HER2 ved hjælp af en automatiseret immunostainer.
    1. Objektglassene TMA at analysere på 60 ° C i 10 min.
    2. Start immunostainer instrument og software.
    3. Klik på knappen protokoller på visningen Startside, og klik derefter på Opret/Rediger protokoller.
    4. Vælg "U Dual ISH CKT" procedure til at ændre den grundlæggende skabelon.
    5. Flag "Tørring" i listen og indstille temperaturen på 63 ° C i 20 min.
    6. Flag "Celle Conditioning" på listen, så "celle Conditioning CC2", og Indstil temperaturen på 86 ° C og inkubering tid på 4 min.
    7. Flag CC2 Mild (cyklus 1), Standard (cyklus 2) og udvidede (cyklus 3) til 8 min, 12 min, og 8 min.
    8. Flag "ISH-Protease 3" i listen og indstille inkubationstiden på 16 min.
    9. Vælg sonder HER2DNP og CHR17DIG og angive inkubationstiden på 6 h.
    10. Indstille vask på 76 ° C i 8 min.
    11. Indstille SISH multimer (SIL ISH DNP HRP) inkubationstiden på 32 min.
    12. Indstille inkubationstiden sølv kromogen (SIL ISH DNP CHRC) på 4 min.
    13. Sæt den røde multimer (røde ISH grave AP) inkubationstiden på 24 min.
    14. Sæt rød kromogen (rød ISH grave FR) inkubationstiden på 8 min.
    15. Flag "Counterstaining" på listen, Vælg "HÆMATOXYLIN II", og Angiv inkubationstiden på 8 min.
    16. Flag "Efter Counterstaining" på listen, Vælg "BLÅNELSE reagens" og angive inkubationstiden på 4 min.
    17. Gentag trin fra 3.3.11-3.3.15 (Vælg ændret U Dual ISH CKT protokol).
    18. Åben hætten, der dækker reagenser karrusel, vask og ISH detektionssystemer, så Luk hætten.
    19. Gentag trin fra 3.3.18-3.3.21.
  3. Udføre SISH analyse for HER2: vurdere HER2 genet forstærkning som positiv, hvis HER2/CEP17 forholdet er ≥2.0 med en gennemsnitlige HER2 kopi nummer ≥4.0 signaler pr. celle, og negativ hvis HER2/CEP17 forholdet er < 2.0 med en gennemsnitlig HER2 kopier nummer < 4.0 signaler/celle3,24.
    Bemærk: Svarende til IHC, denne analyse skal udføres separat i diskrete væv steder af en patolog med erfaring i bryst patologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Samlet, 444 invasiv brystkræft kræft var indarbejdet i 15 TMAs specielt optimeret til ISH analyser. Blandt de 2,664 steder stikprøven, 2,651 (99,5%) var repræsentant for de tidligere valgte områder og derfor anset modtagelig for efterfølgende analyser. Intra-tumor heterogenitet blev bestemt ved hjælp af IHC og SIH, med særlig fokus på de heterogene fordelinger af HER2-positive kloner i de særskilte topografisk områder af tumorer. Tabel 3 skildrer de biologiske karakteristika i de tilfælde, der er analyseret, med fokus på ER, PR, Ki67 og HER2 statussen inden for forskellige histotypes. Især 18% af tilfældene blev fundet til at vise HER2-positive celler i > 10% af tumorceller, og derfor matchede karakteristika for HER2 positivitet vurdering. Interessant, er denne værdi tættere på den nederste ende af rapporterede forekomst vifte af HER2-positiv brystkræft. På den anden side var HER2 status variabel i de diskrete områder af HER2-positive og HER2-negativ brystkræft (figur 3, tabel 4), giver yderligere tiltro til forestillingen om, at brystkræft er en ekstremt heterogen sygdomme på Genomisk niveau. SISH analyse fejlrate var 0,8%, med et samlet antal på 2,629/2,651 steder hvor den dinitrophenol-mærkede probe bundet til target sekvenser.

Figure 1
Figur 1 : Repræsentation af hjørnesten faser i realiseringen af en høj overførselshastighed platform til analyse af HER2 heterogenitet i store kohorter af brystkræfttilfælde. (A) udvælgelsen af områderne at prøve bør omfatte identifikation og højdepunktet i alle områder med cytologiske, arkitektoniske, eller IHC heterogenitet. (B) en af de mest kritiske trin i denne procedure er oprettelsen af en høj kvalitet acceptor blok, da selv en mikroskopisk knæk kunne udlede sammenhængen i de efterfølgende i situ hybridisering analyser. (C) det er vigtigt at ansætte et digitalt guidede arrayer med en 1 mm-diameter nål til at konstruere højtydende TMA baseret på Kononen teknikken. (D) oprettelsen af TMA-projektet bør starte fra definitionen af dimensioner og grænser af TMA. (E) alle IHC og ISH analyser skal udføres ved hjælp af digital patologi værktøjer, for hurtigt at navigere på tværs af TMA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Planimetric repræsentation af TMA indså for denne protokol. Et samlet antal på 180 steder af diameter 1 mm, 500 µm fra hinanden, mulighed for en optimal i situ hybridisering. Tættere TMAs give uproduktive resultater i form af reaktionerne samlede kvalitet og ensartethed på tværs af alle steder, med en højere fejlrate på grundlag af enkelt-spot. Bemærk "orientering" steder i top - og midt-venstre i gitteret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Repræsentant micrographs viser sølv i situ hybridisering analyse af en HER2-heterogene brystkræft. I denne paradigmatiske eksempel, to forskellige steder af en høj kvalitet invasiv brystkræft af ingen særlig type (BR_121) viste forskellige resultater i form af HER2 genet (sort) forstærkning i forhold til centromeric optælling sonden 17 (rød). Især ét område tilhører tumor kerne og viser cytokeratin 7 uregelmæssig farvning mønster var HER2 -forstærkede (A), mens en enkelt plet fra de invasive front (dvs., tumor kant) vises en vildtype HER2 mønster (B). Skalere barer = 50 µm (20 µm i mellemværker). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Case-ID Blok-ID Område-ID Væv Topografi Morfologi SKADESTUEN PR Ki67 HER2 Andre funktioner, IHC
BR_121 A5 en Normal Kirurgiske margin
BR_121 A1 en NST Tumor core G2 CK7 +
BR_121 A1 b NST Tumor core G3 CK7 + /-
BR_121 A3 en NST Tumor core Mucinous stroma 90 100 12 2 +
BR_121 A3 b NST Invasiv forreste Rørformet 100 100 35 2 +
BR_121 A4 en NST Invasiv forreste G3
BR_121 A3 c DCIS (EIC +) Tilstødende til invasiv forreste High-Grade 100 100 45 2 +

Tabel 1: repræsentative rekord i ét tilfælde inkluderet i undersøgelsen. Denne sag (BR_121) var en high-grade invasive karcinom i nogen speciel type med fokale myxoid stroma, viser en mindre rørformede komponent på periferien af læsionen og fokale er uregelmæssig tab af CK7 immunoexpression. Immunhistokemiske funktioner, herunder biomarkører rapportering, henviser til de analyser, der udføres på tidspunktet for diagnosen. NST, invasive karcinom i ingen særlig type; DCIS, duktalt carcinoma in situ; EIC +, omfattende intraductal komponent; CK7, cytokeratin 7.

Markør Klon Virksomheden Fortynding Dewaxing Antigen hentning Antistof inkubation Pointsystem
SKADESTUEN SP1 Ventana RTU EZ prep ved 72 ° C CC1 ved 95 ° C i 36 min 16 min ASCO/CAP retningslinjer23
PR 1E2 Ventana RTU EZ prep ved 72 ° C CC1 ved 95 ° C i 36 min 17 min ASCO/CAP retningslinjer23
HER2 4B5 Ventana RTU EZ prep ved 72 ° C CC1 ved 95 ° C i 36 min 18 min ASCO/CAP retningslinjer3
Ki67 30-9 Ventana RTU EZ prep ved 72 ° C CC1 ved 95 ° C i 36 min 12 min International Ki67 i brystkræft arbejder gruppen anbefalinger25

Tabel 2: liste over antistoffer, kloner, fortyndinger, antigen hentning metoder og scoring systemer vedtaget for immunhistokemisk analyse. ER, østrogen receptor; PR, progesteron receptor; RTU, klar til brug.

Histotype n (%) SKADESTUEN + (%) PR + (%) Ki67-lav (%) Ki-67-høj (%) HER2 + (%)
Invasive karcinom i nogen speciel type 344 (77,5) 301 (87,5) 257 (74.7) 85 (24,7) 259 (75.3) 71 (20,6)
Invasive dråbeformede karcinom 53 (11.9) 53 (100,0) 44 (83.0) 36 (67.9) 17 (32,0) 4 (7,5)
Invasive karcinom, blandet type 9 (2.0) 8 (88.9) 6 (66,7) 0 (0,0) 9 (100,0) 1 (11.1)
Rørformede karcinom 8 (1,8) 8 (100,0) 8 (100,0) 8 (100,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
Mucinous karcinom 11 (2.4) 11 (100,0) 9 (81.8) 7 (63,6) 4 (36,4) 0 (0,0)
Micropapullary karcinom 7 (1,6) 7 (100,0) 7 (100,0) 5 (71.4) 2 (28,6) 2 (28,6)
Invasiv carcinom med apokrine featueres 5 (1.1) 3 (60,0) 1 (20,0) 1 (20,0) 4 (80,0) 3 (60,0)
Papillær karcinom 1 (0,2) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (100,0) 0 (0,0)
Medullært karcinom 4 (0,9) 0 (0,0) 1 (25,0) 0 (0,0) 4 (100,0) 0 (0,0)
Metaplastic karcinom 2 (0,5) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (100,0) 0 (0,0)
I alt 444 391 (88.0) 333 (75,0) 142 (32,0) 302 (68.0) 81 (18.2)

Tabel 3: Breast cancer histotypes, receptor status og HER2 heterogenitet status. ER, østrogen receptor; PR, progesteron receptor; Ki67-lav, Ki67 index < 18%; Ki67-høj, Ki67 > 18%.

Fortolkelige neoplastiske steder HER2-positive steder (%) Hormon receptorer status HER2-heterogene tilfælde
6 5 (83) positive 10
6 5 (83) negative 1
6 4 (67) positive 7
6 4 (67) negative 1
6 2 (33) negative 1
6 1 (17) positive 1
5 3 (60) positive 10
5 1 (20) positive 2
4 3 (75) positive 9
4 2 (50) positive 8
4 1 (25) negative 1
3 2 (67) positive 5
3 1 (33) positive 2
46 25 (54) 53 (93) 57

Tabel 4: HER2 udtryk, hormon receptor status og HER2-heterogene tilfælde. Blandt 57 HER2-heterogene tilfælde var 4 (7%) tilfælde ER negativt og PR-negative, bekræfter den kliniske betydning af vurderingen af HER2 heterogenitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her, har vi detaljerede laboratorium strategier til at udføre SISH analyser af HER2 genet og dens tilsvarende centromer i højtydende TMAs af uensartet forarbejdede brystkræft. Denne metode er omkostningseffektive og kan udføres i de fleste laboratorier for studiet af HER2 genet forstærkning heterogenitet i store kohorter af bryst kræft hentet form patologi arkiver.

På grund af den kliniske betydning af HER2 test i brystkræft og de udfordringer, der er genereret af dens heterogene udtryk, udviklede vi en høj overførselshastighed test protokol for at vurdere intra - og Inter-Diesel tumor HER2 genetiske heterogenitet. De analyserede områder omfatter pre invasive og invasive komponenter, på grundlag af specifikke cytologiske, arkitektoniske og IHC funktioner.

Der er flere kritiske faser, der skal forvaltes omhyggeligt i denne protokol. Et vigtigt skridt er udvælgelsen af regioner af interesse. Vi har konstateret, at kommentering af de forskellige topografiske områder gennem en tværfaglig tilgang er afgørende for at sikre kvaliteten af den endelige Molekylær analyse. Især den fælles revision af de diagnostiske dias udført af en patolog og en tekniker stige enormt antallet af passende steder (dvs., steder afspejler området identificeret på diaset) og efterfølgende reducere fejlrate af single-steder analyse. Flere tumor steder kan dog tabt efter seriel sektioner for flere IHC og ISH analyser. For at overvinde denne ulejlighed, anbefaler vi bygge TMAs i to eller tre eksemplarer, hvis overhovedet muligt baseret på væv tilgængelighed. Desuden, vi fremhæve betydningen af fastlægge strenge laboratorieprocedurer for oprettelse af acceptoren FFPE blokke til TMAs. Faktisk har vi observeret at en minimal knæk i TMA blok kunne udlede hele ISH analyse med hensyn til kvalitet, reproducerbarhed og klarhed i reaktionen. Hvis revner forekomme, bør donor blok lades for TMA konstruktion. Det bør anerkendes, men at IHC kunne udføres, selv i ikke-optimal TMAs, og ingen dokumentation for tekniske problemer under en sådan analyse er blevet observeret i vores erfaring.

På trods af at denne protokol er specifikt optimeret til HER2 SISH analyser af højtydende bryst TMAs, det er note at andre analyser, såsom fisk og IHC, kan udføres pålideligt og flere vævstyper, som tidligere beskrevet14, 19,26. Vi har dog heri defineret det ideelle antal steder og de topografiske kendetegner TMA at sikre høj kvalitet og reproducerbare SISH analyser af HER2 genet i bryst kræft prøver. Et andet væsentligt punkt er repræsenteret ved omdannelsen af automatiseret SISH standardprotokoller til at matche ejendommelighed af flere prøver der skal analyseres. Faktisk, fabrikanter retningslinjer er generelt gjort for de molekylære analyser af konventionelle full-face sektioner, og derfor er ikke i stand til at nå høje standarder på uensartet forarbejdede væv prøver, som i TMAs fra arkivers FFPE blokke. Til dette formål har vi givet en trinvis beskrivelse af en pålidelig tilpassede protokol for SISH analyser i disse problematiske prøver.

Det ville være ekstremt gavnligt at udforske heterogenitet af HER2 udtryk og gen amplifikation i henseende til den heterogen fordeling af andre klinisk handlingsrettede molekylære biomarkører i brystkræft. Med henblik herpå, yderligere translationel forskningsundersøgelser er nødvendige for at undersøge gyldigheden af vores metode til andre klinisk relevante molekylære analyser, såsom matrix assisted laser desorption/Ionisation massespektrometri imaging (MALDI-MSI)27. For nylig, forvaltningen af FFPE væv for MALDI-MSI analyse blevet muligt, omend udfordrende. Denne i situ proteom teknik giver mulighed for visualisering af den geografiske fordeling af proteiner og peptider i patologisk væv sektioner, herunder brystkræft.

Denne protokol har flere kritiske trin, der kan potentielt forstyrre den endelige analyse. Første, særlig opmærksomhed bør betales mod de underliggende HER2 forstærkning forskellige mekanismer. For eksempel, er kromosom 17 polysomy en genetiske aberration, der kan opstå i bryst kræft11, der repræsenterer en velkendt alternativ mekanisme for øget HER2 kopi nummer. Denne betingelse, kan omend ikke hyppig, påvirke ikke kun kræft biologiske funktioner og patienthåndtering, men også ISH analyser. For det andet er det blevet beskrevet at intra-tumor genetiske heterogenitet forekommer også på en enkelt celle plan og ikke kun i forskellige neoplastiske områder. Denne protokol er ikke i stand til at øge opdagelse magt af denne særlige betingelse i forhold til full-face sektioner. Derudover er det vigtigt at fremhæve, at den TMA-baseret undersøgelse af rumlig heterogenitet har nogle iboende begrænsninger, herunder manglen på en omfattende analyse af hele afsnittet. Denne undersøgelse, dog skal betragtes som en proof-of-principle, heterogenitet af HER2 genet forstærkning kan vurderes ved hjælp af en høj overførselshastighed og omkostningseffektiv platform, ved hjælp af almindeligt laboratorieudstyr. Yderligere undersøgelser analysere seriel full-face sektioner af HER2-heterogene tilfælde, kombineret med cutting-edge molekylære undersøgelser og patienternes kliniske data vil være forpligtet til at godkende denne protokol.

Til sidst, bør den omfattende kortlægning af HER2 status i heterogene HER2 bryst kræft prøver og undersøgelse af potentielle driver genetiske mutationer i HER2-negativ komponenter stole på analyse af flere neoplastiske regioner. Denne analyse vil kræve ubærlige omkostninger og indsats ved hjælp af standard diagnosefaciliteter. Denne metode repræsenterer et pålideligt værktøj til samtidige karakterisering af HER2 genetiske heterogenitet i store sæt af flere og uensartet forarbejdede brystkræft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Ingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26x76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device - digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136, (6), 864-871 (2011).
  2. Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232, (2), 219-229 (2014).
  3. Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31, (31), 3997-4013 (2013).
  4. Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12, (8), 1021-1032 (2012).
  5. Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133, (4), 611-612 (2009).
  6. Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54, (3), 532-538 (2011).
  7. Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64, (12), 1112-1116 (2011).
  8. Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. 'Genetic heterogeneity' in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25, (5), 683-688 (2012).
  9. Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136, (2), 266-274 (2011).
  10. Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25, (7), 938-948 (2012).
  11. Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27, (1), 4-18 (2014).
  12. Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now? Expert Rev Mol Diagn. 15, (3), 385-398 (2015).
  13. Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10, (12), e0144923 (2015).
  14. Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies - a systematic literature review. Histopathology. 68, (3), 323-332 (2016).
  15. Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16, (8), 1266-1270 (2016).
  16. Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26, (6), 816-824 (2013).
  17. Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. Eight, Springer International Publishing. (2017).
  18. Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. WHO Classification of Tumours of the Breast. 4th, IARC press. (2012).
  19. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4, (7), 844-847 (1998).
  20. Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68, (2), 262-271 (2016).
  21. Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29, (11), 1292-1305 (2016).
  22. Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70, (6), 906-917 (2017).
  23. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28, (16), 2784-2795 (2010).
  24. Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22, (35), 7926-7937 (2016).
  25. Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103, (22), 1656-1664 (2011).
  26. Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14, (3), R93 (2012).
  27. De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11, (6), 1507-1514 (2015).
Opbygge en høj overførselshastighed Screening Platform til at vurdere heterogenitet af HER2 genet forstærkning i brystkræft
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).More

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter