Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

בניית פלטפורמה תפוקה גבוהה ההקרנה כדי להעריך את הטרוגניות של HER2 הגברה ג'ין סרטן שד

doi: 10.3791/56686 Published: December 5, 2017

Summary

הטרוגניות חלוקת תאים HER2 חיובי יכול להיות שנצפו בקבוצת משנה של סרטן השד ומייצר דילמות קליניים. כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול אמין וחסכוני להגדיר, לכמת, ולהשוות בין HER2 אינטרה-גידול הטרוגניות גנטית בסדרה גדולה של סרטן השד heterogeneously מעובד.

Abstract

טיפולים ממוקדים כנגד הקולטן האנושי גורם הגדילה באפידרמיס 2 (HER2) השתנו באופן קיצוני את התוצאה של חולים עם סרטן השד HER2 חיובי. עם זאת, מיעוט מהמקרים הצגת התפלגות הטרוגנית של HER2 חיובי תאים, אשר יוצר אתגרים קליניים גדולים. נכון להיום, אין פרוטוקולים סטנדרטיים ואמין כדי להפוך את אפיון כימות של HER2 הטרוגנית הגברה ג'ין קוהורטות גדולות הוצעו. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה תפוקה גבוהה להעריך את מצב HER2 בו זמנית על פני אזורים שונים טופוגרפית של סרטן השד מרובים. בפרט, אנו ממחישים את ההליך מעבדה כדי לבנות מיקרו-מערכים רקמות משופרת (ניסית אותו בעבר) שילוב מיפוי יישוב של הגידולים. כל הפרמטרים TMA מוטבו במיוחד עבור כסף בחיי עיר הכלאה (SISH) של פורמלין-קבוע-מוטבע פרפין (FFPE) רקמות השד. ניתוח Immunohistochemical של סמנים prognostic, ניבוי (קרי, ER, יחסי ציבור, Ki67 ו- HER2) צריכה להתבצע באמצעות הליכים אוטומטיים. פרוטוקול SISH מותאם אישית יושמה כדי לאפשר ניתוח מולקולרית באיכות גבוהה על פני מספר רקמות שעברו הליכים קיבעון, עיבוד, אחסון שונים. במחקר זה, אנו מספקים הוכחה-של-עיקרון כי רצפי DNA ספציפיים יכול להיות סרטן שד מקומי בו זמנית באזורים סימון שבילים ברורים של מרובה ולא מעובד heterogeneously באמצעות שיטה יעילה וחסכונית.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HER2 נמצא proto-oncogene overexpressed, הוגדל ב- 15-30%1,סרטן שד פולשני כל2. HER2 ביטוי היא להסיק על ידי הנוכחות של > 10% תאים עם ממברנה חזקה immunohistochemical (IHC) צביעת (3 +), בעוד הגברה ג'ין יכול להידרש כאשר היחס HER2/צנטרומר הוא ≥2 או המספר עותק הגן הוא ≥6, כאשר על סופר לפחות 20 תאים על-ידי בחיי עיר הכלאה (איש)3.

הטרוגניות גנטית אינטרה-הגידול כבר נרחב שמתואר סרטן השד, להיות תורם פוטנציאלי לוואי הערכת סמנים ביולוגיים ו טיפולים תגובה4. על פי המכללה של אמריקאי פתולוגים (CAP), HER2 הטרוגניות קיימת אם HER2 מוגבר ב- > 5% ו- < 50% שחדר גידול תאים5. למרבה הצער, השכיחות האמיתית של HER2 הטרוגניות המרחבי סרטן שד נותרת כנושא למחלוקת בין פתולוגים עם יש מחברים שמירה על זה זהו אירוע נדיר ביותר, מציע את זה עד 40% של המקרים האחרים HER2-הטרוגניות1,5,6,7,8,9,10. למרות המנגנונים הביולוגיים לחזק תנאי זה לא עדיין מלא לאשורן, ההשפעות prognostic וקלינית של הטרוגניות HER2 אינטרה-גידול מכריעים עבור חולי סרטן השד11.

לאחרונה, טכניקות מולקולריות שדה בהיר, כגון הדפסות כסף איש (CISH) וכסף איש (SISH), הופיעו כפעולות אמין כדי לזהות HER2 הטרוגניות ברקמות FFPE, עם כמה יתרונות לעומת איש (פיש) פלורסנט12. למרבה הצער, ניתוח בכמות גדולה של מקרים בודדים נשאר מעשית בלימודי מחקר עוקבה גדול. מספר קבוצות הראו כי השילוב של להסטולוגיה, IHC ולאחר איש עם טכנולוגיות TMA יכול לייצג אסטרטגיה חשוב בחקר הסרטן ביולוגיה13,14,15,16. בשיטה זו אומץ באופן נרחב, דגימות רקמות מחולים שונים ניתן לנתח אותם במקביל, מזעור של רקמות, ריאגנטים המועסקים וטיפוח ובכך ניתוח אחיד של סדרה גדולה של מקרים14. עם זאת, אין פרוטוקולים זמינים עבור סימולטני תפוקה גבוהה מולקולרית אפיון דגימות רקמה מרובים שעברו שונים עיבוד במונחים של ריאגנטים, קיבוע פעמים ושיטות שימור מועסקים, כגון כמו ארכיון בלוקים.

לאור ההשלכות prognostic וקלינית של הטרוגניות המרחבי HER2 סרטן שד, פיתחנו פלטפורמה מולקולרית משולבת כדי להעריך את זה בסדרה גדולה של מקרים heterogeneously מעובד. כאן, אנו מתארים את האסטרטגיות מעבדה ליצור ולנתח את הטרוגניות אינטרה-גידול של HER2 הגברה ניסית אותו בעבר לתפוקה גבוהה של סרטן השד באמצעות SISH. הפרוטוקול הבא פותחה עבור גידולים מדידה > 5 מ מ (> pT1b על פי 2017 TNM)17. עבור נגעים קטנים יותר, אנו ממליצים על ביצוע הניתוח על עטיית מקטעים טורי. את הנהלים שלנו מאפשר ניתוח IHC ולאחר SISH בו זמנית של עד 30 סרטן השד, המקיף ממוצע של 6 תחומים ברורים (טווח 4-8) עבור כל מקרה. בסך הכל, 180 ליבות רקמות של 1 מ מ קוטר, עם 500 מיקרומטר בין הליבות, 2 מ מ בין הרשת לבין קצוות ייווצר עבור כל בלוק TMA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מחקר זה אושרה על-ידי הלוחות סקירה מוסדיים מרשות האישורים IRCCS' המלון קרן, החולים פוליקליניקו (policlinico), מילאנו, איטליה.

1. מבחר של חולים, דגימות רקמות

  1. אחזר את השקופיות ארכיוני מכל מקרי שינותח, כולל כל hematoxylin זמין ו אאוזין (H & E), שקופיות IHC מן האבחנה המקורית ותואמים, אם היא קיימת, אחד H & E של רקמת השד ללא אמצעים (למשל, שולי כירורגית) .
  2. ביצוע ביקורות תיק.
    הערה: עבור משימה זו, פתולוגים לפחות שני עם ניסיון בפתולוגיה השד צריך לדון את השקופיות אבחון ולפתור מחלוקות collegially. להשתמש במיקרוסקופ רגיל או כלי telepathology (לטובת האחרונים במחקרים multicentric). אם בכלל, אל תכלול את כל המקרים צורמים.
    1. לבצע את הסיווג מחדש היסטולוגית של כל המקרים לפי המהדורה האחרונה של ארגון הבריאות העולמי (WHO) הסיווג של גידולים של השד18.
    2. ודא כי הרקמה נורמלי לכל מקרה, אם נוכח הדגימות קליניים ארכיוני, כוללת ללא אמצעים מסוף ductal-lobular יחידה אחת לפחות.
    3. לזהות בכל התחומים אמצעים המציגים הטרוגניות cytological, ארכיטקטוני, או תכונות IHC באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (שיבוצעו במשותף על ידי פתולוג ו technician(s) אשר יבנו את ניסית אותו בעבר).
  3. לסמן אזורים טופוגרפית דיסקרטית עם סמן בשקופית זכוכית או בעזרת הכלי הנכון על תוכנה שקופיות דיגיטלי (איור 1 א').
  4. בהתבסס על השקופיות שנבחרו, לאחזר את אבני FFPE המקביל מהארכיון.
    הערה: כדי לייעל את TMA הבנייה, כדי למנוע דלדול רקמות, וכדי לשמר את TMA אגרוף המבנית, מקרים עם < לא להיות כלולים 1 מ מ בעובי רקמת שיורית.

2. לעצב ולבנות ניסית אותו בעבר מבוסס על טכניקת Kononen

  1. צור ולפתוח קובץ גיליון אלקטרוני חדש המשלב את הרשומות של האזורים ברורים בכל מקרה. לכלול את הנתונים הבאים על עמודות נפרדות, כפי שהודגם ב טבלה 1: מקרה מזהה, מזהה בלוק, מזהה אזור, סוג הרקמה (למשל, הרקמות, רכיב פולשני histotype, בחיי עיר רכיב histotype), טופוגרפיה (למשל, גידול ליבה, חזית פולשני), מורפולוגיה (למשל, כיתה גרעינית, אדריכלות, mitoses, תכונות cytological), מצב סמנים ביולוגיים (קרי, קולטן אסטרוגן (ER), קולטני פרוגסטרון (PR), Ki67, ו- HER2), ואת כל שאר התכונות IHC זמינים.
    1. לשמור את המסמך.
  2. ליצור פרוייקט TMA.
    1. התקן, לפתוח את התוכנה מעצבים TMA.
    2. הגדרת הנמען TMA גושי: גישה דרך תפריט File > ניו > בלוק או על-ידי שימוש ב- CTRL + B.
    3. לחץ על השדה הראשון כדי למלא או הקש על מקש Tab, הקלד בממדים של בלוק פראפין: רוחב 35 (מ מ), גובה 20 (מ מ). סוג "2" כערך "שוליים" (קרי, מרחק מהקצה פרפין במ מ) (איור 1B). לשמור את הנתונים על-ידי לחיצה על הכפתור המתאים. התבנית החדשה של גוש הנמען נשמר כעת ומוכנים לשימוש בתבניות מערך חדש של רקמות.
    4. יצירת פרוייקט מערך רקמות: גישה לתפריט קובץ > ניו > מערך רקמות או על-ידי שימוש ב- CTRL + טי
    5. מילוי בשם מערך רקמות, הערות, מחבר ולאחר מכן לחץ על "הבא". לחץ על הסמל "ייבוא", לבחור את קובץ התבנית של הנמען גוש שנוצרו בעבר ולחץ "הבא."
    6. לבחור 1 מ מ כגודל ספוט על-ידי לחיצה על לחצן עגול. בחרו ' מיקרומטר 500 המרווח ספוט אשר הרווח בין שני מרכזים המקומות הסמוכים. לחץ על הסמל במחשבון כדי לחשב את המספר הכולל של כתמים שנוצרו, שאמור להיות 231. לחץ על "הבא".
    7. הגדר את מצב מספור ספוט ידי לחיצה פעם אחת על זה. לחץ על הכפתור "להגדיר" כדי ליצור רשתות ורשתות משנה. מחק את השורה המרכזית (קו 6) ואת העמודות 8 ו- 15. לשמור על 3 נקודות של קו 1 לאוריינטציה. המפה הסופית צריכה להקיף את המספר הכולל של נקודות 183, כפי שמוצג באיור2.
    8. להגדיר את רשימת סוגי רקמות: גישה דרך תפריט File > ניו > רשימת סוגי רקמות או על-ידי שימוש ב- CTRL + ל'
    9. הכנס את התיאורים רקמה שהוגדרה קודם לכן. הקש על חץ למטה או לחץ על הכפתור + כדי להוסיף קו.
    10. הגדרת הפרויקט: גישה דרך תפריט File > ניו > פרוייקט המאיץ או על-ידי שימוש ב- CTRL + פ
    11. מילוי בשם מערך רקמות, הערות ומחבר ולאחר מכן לחץ על "הבא". ייבא את קובץ הגיליון האלקטרוני רשימת סוגי רקמות, המודל מערך רקמות שנוצרו בעבר על-ידי לחיצה על סמלים נאותה.
    12. לחץ על "בחר הכל" ולהגדיר את מספר נקודות עבור כל סוג הרקמה; לחץ על לחצן "שידוך" כדי להחיל הגדרות. תופיע טבלה רישום המספר הכולל של ליבות אשר ניתן לטעום להעביר בלוקים הנמען בפרויקט זה. שמור את הפרויקט, לסגור את התוכנית.
  3. הכינו את גושי מקבל (איור 1B).
    1. מילוי תבניות מתכת נקי עם פרפין אלסטית-65 מעלות צלזיוס.
    2. להשאיר את אבני פרפין להתקרר בטמפרטורת החדר למשך הלילה בתוך התבניות מתכת.
    3. לחלץ את אבני פרפין מתוך תבניות מתכת. אם התרחשה סדקים, למחוק את הבלוק וחזור על שלבים 2.3.1-2.3.3.
  4. לבנות את TMA באמצעות arrayer אוטומטית או חצי אוטומטית19.
    1. אחזר כל נבחרת FFPE רחובות של הסעיפים המתאימים H & E עם ביאורים.
    2. להפעיל את arrayer והכנס את גושי מקבל על הקרוסלה arrayer.
    3. לפתוח את התוכנה תחנת הבקרה arrayer, לחץ על "מערך רקמות חדשות", ולטעון את הפרוייקט שנוצרו בעבר (איור 1C).
    4. לחץ על "המשך", בחר את המיקום של גושי תורם התפריט.
    5. הגדרת המיקום ההתחלתי על כל בלוק הנמען: השתמש במקשי החצים כדי להזיז את אור הלייזר ליישר אותו עם הקצה השמאלי העליון על פרפין הרחוב הנמען.
    6. לחץ על "הבא" וחזור על היישור האנכי.
    7. לחץ על "הבא" כדי ליצור באופן אוטומטי חור ב הקואורדינטה שהוגדרו בעבר הרחוב נמען (מקבל).
    8. רוקן את האגרוף.
    9. מקם את הבלוק התורם לדיגום ולהסיר ליבה של רקמות מן האזור בעבר מוערת של עניין.
    10. הכנס התורם רקמות הליבה לתוך החור בבלוק נמען (מקבל).
    11. הסר את הבלוק תורם arrayer.
    12. חזור על צעדים 2.4.5-2.4.11 עד TMA השלמת.
  5. מכניסים את הצד רקמות של גוש TMA החדש שנוצר בשקופית הריקה סטרילי ומניחים בתנור המעבדה על 45 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
  6. לחץ בעדינות את הבלוק על השקופית עבור 5 s כדי לשטח את הליבות רקמות. חזור על פעם אחת (עבור סכום כולל של פי 2).
  7. להסיר את החסימה TMA יחד עם השקופית מהתנור, להפוך אותם ולנתק בעדינות הרחוב של השקופית.
  8. לכסות את המשטח רקמות TMA עם שכבה דקה של פרפין אלסטית-65 מעלות צלזיוס.
  9. יוצאים לרחוב TMA בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
  10. להעביר את גוש TMA-4 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
    הערה: הרחוב TMA שניתן לאחסן ב 4 ° C עד תשישות.

3. פתולוגיה וניתוחים Immunohistochemical

  1. חותכים למקטעים TMA.
    1. הנח את גושי מקבל TMA עם הצד הפרפין למטה על משטח-10 ° C למשך 10 דקות להרגע הפרפין.
    2. למלא אמבט ציפה במים הנדסה גנטית והגדר חום 38 מעלות צלזיוס.
    3. במקום להב חדש על מיקרוטום סיבוביים והכנס את הבלוק לתוך הצ'אק מיקרוטום אז הבלוק שעווה פונה הלהב, מיושר במישור האנכי.
    4. גש לרחוב בזהירות עם הלהב ולחתוך כמה חלקים דקים כדי להבטיח שמיקום נכון; התאם במידת הצורך.
    5. לחתוך 3 סעיפים מיקרומטר-עבה.
    6. לאסוף את הסעיפים באמצעות פינצטה ולממן אותם על פני השטח אמבט מים.
    7. לבחור את המקטעים החוצה המים הרותחים בשקופיות זכוכית רגילה ו- IHC/איש.
    8. מקם את השקופיות על מתלה ולאחסן אותם בתנור ב 45 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      הערה: לאחר מוכן, הסעיפים TMA צריך להיות מוכתם בתוך 24 שעות.
  2. לבצע צביעת פתולוגיה (H & E) באמצעות של autostainer.
    1. הוסף את השקופיות בארון autostainer ולמקם אותם ב 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. פתח את המגירה עומס של autostainer ושל הוספה שהאצטבה עם הלאמה שקופיות באחת התחנות טעינה עם תקן H & E סרטון גוחנת.
    3. ברגע המגירה סגורה, הקליפ יזוהו באופן אוטומטי על ידי המערכת, הפרוטוקול הבא יתחיל: תנור בתחנת 37 ° C (6 דקות), קסילן (2 דקות), קסילן (2 דקות), אתנול 100% (2 דקות), אתנול 100% (2 דקות), אתנול 95% (2 דקות), אתנול 95% (2 דקות) , מזוקק מים (4 דקות) של Carazzi hematoxylin (9 דקות), מים זורמים בלחץ נמוך (2 דקות), אאוזין 1% (1דקות.), מים זורמים בלחץ נמוך (2 דקות), אתנול 95% (20 s), אתנול 95% (20 s), אתנול 95% (20 s), אתנול 95% (20 s), אתנול 100% (15 s), אתנול 100% (15 s) , קסילן (30 s), קסילן (30 s).
    4. לפרוק את המדפים ממגירת והר השקופית עם מכסה.
      1. לאסוף את טיפת הר עם פיפטה ושים אותו הקצה החיצוני של השקופית כיסוי.
      2. למקם את הצד הרטוב של תגית כיסוי בשקופית ולתת את הר יבש למשך 30 דקות.
  3. לבצע IHC צביעת חדר המיון, יחסי ציבור, Ki67 של HER2 באמצעות של immunostainer אוטומטית.
    הערה: לפני שמתחילים לרוץ מוכתמים, להפעיל את המערכת, תבדקי את המכלים ריאגנט מתכלים (טבלה של חומרים), פסולת מכולות.
    1. מקם את השקופיות TMA לנתח ב 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. הפעל את כלי הנגינה immunostainer והתוכנה.
    3. על התצוגה הבית, לחץ על לחצן פרוטוקולים ולאחר מכן לחץ על יצירת/עריכת פרוטוקולים.
    4. בחר את תקן DAB (3, 3'-diaminobenzidine) IHC ההליך כדי לשנות את תבנית בסיסית.
    5. דגל "Deparaffinization" ברשימת התיבה ולהגדיר את הטמפרטורה בינוני-72 מעלות צלזיוס.
    6. דגל הפתרון גם ההומניסטית והאוטונומית cc1, השוכן הטמפרטורה בינוני 95 ° C, ואת זמן הדגירה-36 דקות.
    7. בדגל בתיבת נוגדן ראשוני, להוסיף את המזהה של מנפק מוטבעת ER (כלי התוכנה תזהה מנפק על הקרוסלה ריאגנט) וקבע זמן הדגירה-16 דקות.
    8. לסמן את התיבה Counterstaining, בחר Hematoxylin אני, והינו ממוקם זמן הדגירה-12 דקות.
    9. לחץ על לחצן "שמירה בשם" ותנו שם הפרוטוקול.
    10. חזור על 3.3.3-3.3.9 את השלבים עבור הנוגדנים הנותרים בעזרת נוגדנים העיקרי הדגירה שעות: PR 16 דקות, Ki67 16 דקות ו- HER2 12 מינימלית להשתמש נוגדנים מראש מדולל מוכן לשימוש (RTU).
    11. התצוגה הבית, לחץ על לחצן צור תווית.
    12. לחץ על לחצן פרוטוקולים ולהוסיף את הפרוטוקולים ER, יחסי ציבור, Ki67 ו- HER2 עבור כל אחד TMA לנתח.
    13. לחץ על לחצן סגור /Print.
    14. כתווית התבנית מופיעה, הזן מזהי TMA עבור התווית.
    15. לחץ על לחצן ' הדפס ' כדי להדפיס את התוויות ולאחר מכן להחילם על השקופיות TMA.
    16. לחץ על סמל הכלי והגדר את מצב ההפעלה כלי כמו "מוכן".
    17. . פתח את המכסה שמכסה את הקרוסלה ריאגנטים למקם מערכת איתור, נוגדנים ראשוני, ולאחר מכן סגור את מכסה המנוע.
    18. לחץ על לחצן קבלה על מגירה שקופית כדי לפתוח אותו, לטעון את השקופיות TMA סגור את המגירה על-ידי לחיצה על אותו לחצן.
    19. הגדר את מצב ההפעלה כלי כמו "רצים" ובצע את ההוראות.
    20. בסוף unload לרוץ, TMA השקופיות על-ידי הקשת את מגירות פתוחות עם לחצן שקופיות שהושלמו על הכלי שליטה שקופית ולאחר מכן לשטוף אותם חמים סבון ומים כדי להסיר כל ריאגנטים הנותרים.
    21. לשטוף את השקופיות תחת קר בלחץ נמוך מים זורמים, מייבשים את השקופיות TMA ולהחיל על coverslip זכוכית לכל שקופית.
  4. ביצוע ניתוח IHC של חדר המיון, PR ו- HER2 בעקבות את האמריקאי האגודה לאונקולוגיה קלינית (ASCO) / קאפ הנחיות, ושל Ki67 לפי ההמלצות של Ki67 הבינלאומי בקבוצת עבודה (טבלה 2) של סרטן השד.
    הערה: ניתוח זה צריכה להתבצע בנפרד בהמקומות רקמות דיסקרטית על ידי פתולוג עם חוויה בפתולוגיה השד.
    1. להעריך את הביטוי ER חיובי אם ≥ 1% גידול התא גרעינים immunoreactive20,21,22,23.
    2. להעריך את הביטוי PR חיוביים אם ≥ 1% גידול התא גרעינים immunoreactive20,21,22,23.
    3. להעריך את הביטוי HER2 כמו: a) ציון 3 + אם קרום במבניו מכתים את זה מלא ואינטנסיבי, ב) ציון 2 + אם קרום במבניו מכתים הוא לא שלם ו/או חלש/בינונית ותוך > 10% של תאים גידול פולשני או מלא, קרום במבניו מכתים הוא אינטנסיבי ובתוך ≤ 10% של תאי גידול פולשני, c) ציון 1 + אם קרום לא הושלמה צביעת הוא חלש/בקושי מורגש ובתוך > 10% של תאי גידול פולשני, d) שלילי אם לא מכתים קיים או קרום צביעת הוא חלש/בקושי מורגש ולא שלם, בתוך ≤ 10% של הגידול פולשנית תאים3,24.
    4. להעריך את האינדקס Ki67 כפי האחוז של תאים עם גרעיני מכתים בתאים אמצעים לפחות 1,000 באופן אקראי שנבחרו שדות ובעוצמת מעל 10 (הגדלה, 400 X)25.

4. SISH ניתוח של HER2

  1. חותכים TMA מקטעים (וחזור על שלב מספר 3.1).
  2. לבצע SISH עבור HER2 באמצעות של immunostainer אוטומטית.
    1. מקם את השקופיות TMA לנתח ב 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. הפעל את כלי הנגינה immunostainer והתוכנה.
    3. על התצוגה הבית, לחץ על לחצן פרוטוקולים ולאחר מכן לחץ על יצירת/עריכת פרוטוקולים.
    4. בחר את ההליך "U CKT איש כפול" כדי לשנות את תבנית הבסיס.
    5. דגל "ייבוש" ברשימת התיבה ולהגדיר את הטמפרטורה ב 63 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    6. דגל "מיזוג התא" ברשימת התיבה, ואז "תא מיזוג CC2", ולהגדיר את הטמפרטורה בזמן 86 ° C ו דגירה-4 דקות.
    7. דגל CC2 מתון (מחזור 1) תקן (מחזור 2), מורחב (מחזור 3) במשך 8 דקות, 12 דקות ו- 8 דקות, בהתאמה.
    8. דגל "איש-פרוטאז 3" ברשימת התיבה ולקבוע זמן הדגירה-16 דקות.
    9. בחר את הגששים HER2DNP ו- CHR17DIG ולהגדיר זמן הדגירה ב 6-אייץ '.
    10. הגדר את הכביסה ב 76 ° C במשך 8 דקות.
    11. להגדיר את זמן הדגירה של SISH multimer (סיל איש DNP HRP) 32 min.
    12. להגדיר זמן הדגירה chromogen כסף (סיל איש DNP CHRC) ב 4 דקות.
    13. לקבוע זמן הדגירה multimer אדום (אדום איש לחפור AP) 24 min.
    14. לקבוע זמן הדגירה chromogen אדום (אדום איש לחפור FR) 8 דקות.
    15. הדגל "Counterstaining" ברשימת התיבה, בחר "HEMATOXYLIN II", ולהגדיר זמן הדגירה ב 8 דקות.
    16. דגל "Counterstaining פוסט" בתיבה, בחר "הכחלת ריאגנט" ולאחר להגדיר זמן הדגירה ב- 4 דקות.
    17. חזור על שלבים של 3.3.11-3.3.15 (בחר שונה U כפול איש CKT לפרוטוקול).
    18. פתוח למכסה שמכסה את הקרוסלה ריאגנטים, למקם את הכביסה ומערכות איתור איש, אז סגור את מכסה המנוע.
    19. חזור על שלבים של 3.3.18-3.3.21.
  3. לבצע ניתוח SISH עבור HER2: להעריך את ההגברה ג'ין HER2 חיובי אם היחס /CEP17 HER2הוא ≥2.0 עם ממוצע HER2 עותק מספר ≥4.0 אותות בכל תא, ושלילי אם היחס /CEP17 HER2< 2.0 עם ממוצע HER2 להעתיק מספר < 4.0 אותות תא3,24.
    הערה: בדומה IHC, ניתוח זה לבצע בנפרד בהמקומות רקמות דיסקרטית פתולוג בעל ניסיון בתחום הפתולוגיה של השד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מקצה לקצה, 444 שד פולשני סרטן סופחו 15 ניסית אותו בעבר הממוטבות במיוחד איש ניתוחים. בין המקומות 2,664 שנדגמו, 2,651 (99.5%) נציג של האזורים שנבחרו קודם לכן, ולכן נחשבת לשכנוע ניתוחים שלאחר מכן. אינטרה-גידול הטרוגניות נקבע על-ידי IHC ולאחר SIH, עם דגש מיוחד על חלוקות הטרוגנית של HER2 חיובי שיבוטים באזורים סימון שבילים ברורים של הגידולים. טבלה 3 מתארת מאפיינים ביולוגיים של המקרים ניתוח, תוך התמקדות על מצב המיון, יחסי ציבור, Ki67 ו- HER2 בתוך histotypes שונים. בפרט, 18% מהמקרים נמצאו כדי להציג תאים HER2 חיובי > 10% של תאים סרטניים, ולכן התאימו את מאפייני עבור HER2 חיוביות הערכה. מעניין, ערך זה הוא קרוב יותר לקצה התחתון של טווח של HER2 חיובי היארעות מדווחת סרטן השד. מצד שני, המצב HER2 היה משתנה באזורים נפרדים של HER2 חיובי והן HER2 שלילי סרטן השד (איור 3, בטבלה 4), מתן אמון נוספת לרעיון זה סרטן השד היא מחלה מאוד הטרוגנית- הרמה גנומית. הכשלונות של ניתוח SISH היה 0.8%, עם מספר נקודות 2,629/2,651 שבו המכשיר מתויג dinitrophenol חייב רצפי היעד הכולל.

Figure 1
איור 1 : ייצוג אבן הפינה שלב מימוש של פלטפורמה תפוקה גבוהה לניתוח של HER2 הטרוגניות ב קוהורטות גדולות של סרטן השד- בחירה (A) של אזורי לטעום צריכה לכלול את זיהוי ואת גולת הכותרת של כל אזורי עם cytological, ארכיטקטוני, או הטרוגניות IHC. הליך (B) אחד השלבים הקריטיים ביותר של זה הוא הקמת בלוק מקבל באיכות גבוהה, בהתחשב בכך אפילו סדק מיקרוסקופיים יכול להסיק את העקביות של הניתוחים הכלאה עוקבות בחיי עיר . (ג) חשוב להעסיק arrayer מודרכים דיגיטלית עם מחט מ מ בקוטר 1 לבנות TMA לתפוקה גבוהה המבוססת על טכניקת Kononen. (ד) הקמת הפרויקט TMA צריך להתחיל מן ההגדרה של הממדים וגבולות של TMA. ניתוחים IHC כל (E), איש צריכה להתבצע בכלים של פתולוגיה דיגיטלי, כדי לנווט במהירות על פני TMA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : Planimetric ייצוג TMA הבין עבור פרוטוקול זה. המספר הכולל של נקודות 180 של 1 מ מ קוטר, 500 מיקרומטר בנפרד, מאפשרים הכלאה האופטימלית בחיי עיר . ניסית אותו בעבר צפופה לספק תוצאות לא מועיל מבחינת האיכות הכוללת ואחידות של התגובות על פני כל נקודות, עם שיעור הכישלון גבוה יותר על בסיס יחיד-נקודה. שימו לב המקומות "התמצאות" ב, התיכון-השמאלית העליונה של הרשת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : Micrographs נציג מציג את הכסף בחיי עיר הכלאה ניתוח סרטן השד HER2-הטרוגניות. בדוגמה זו פרדיגמטי, בשני מקומות נפרדים של סרטן שד פולשני בדרגה גבוהה של אין סוג מיוחד (BR_121) הראו תוצאות שונות במונחים של HER2 ג'ין (שחור) הגברה לעומת המכשיר ספירה centromeric 17 (אדום). בפרט, אחד אזור השייכים לגרעין הגידול, מציג cytokeratin 7 לא סדיר מכתים דפוס היה HER2 מוגבר (A), בעוד מקום יחיד מהחזית פולשני (כלומר, הקצה הגידול) מוצג פראי-סוג של HER2 דפוס (B). גודל ברים = 50 מיקרומטר (מיקרומטר 20 ב ההזחה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מזהה אירוע בלוק מזהה מזהה אזור רקמה טופוגרפיה מורפולוגיה בחדר המיון יחסי ציבור Ki67 HER2 תכונות אחרות IHC
BR_121 A5 . רגיל שולי כירורגית
BR_121 A1 . NST הגידול הליבה G2 CK7 +
BR_121 A1 b NST הגידול הליבה G3 CK7 + /-
BR_121 A3 . NST הגידול הליבה משתית רירני 90 100 12 2 +
BR_121 A3 b NST חזית פולשני צינורי 100 100 35 2 +
BR_121 A4 . NST חזית פולשני G3
BR_121 A3 c DCIS (EIC +) הסמוך קבלה פולשני בדרגה גבוהה 100 100 45 2 +

טבלה 1: נציג תיעוד מקרה אחד כללו במחקר. התיק הזה (BR_121) היה קרצינומה פולשנית בדרגה גבוהה של אין סוג מיוחד עם מוקד stroma myxoid, מציג רכיב צינורי קטין על הפריפריה של הנגע, ואובדן מוקד לא סדירות של CK7 immunoexpression. התכונות immunohistochemical, כולל סמנים ביולוגיים דיווח, מתייחס הניתוחים שבוצעו בזמנו של האבחנה. NST, קרצינומה פולשנית של אין סוג מיוחד; DCIS, קרצינומה ductal באתרו; EIC +, intraductal נרחב רכיב; CK7, cytokeratin 7.

סמן שיבוט החברה דילול Dewaxing אחזור אנטיגן נוגדן דגירה שיטת הניקוד
בחדר המיון SP1 Ventana RTU EZ הכנה ב-72 מעלות cc1 ב 95 מעלות צלזיוס במשך 36 דקות 16 דקות הנחיות ASCO/כובע23
יחסי ציבור 1E2 Ventana RTU EZ הכנה ב-72 מעלות cc1 ב 95 מעלות צלזיוס במשך 36 דקות 17 דקות הנחיות ASCO/כובע23
HER2 4B5 Ventana RTU EZ הכנה ב-72 מעלות cc1 ב 95 מעלות צלזיוס במשך 36 דקות 18 דקות הנחיות ASCO/כובע3
Ki67 30-9 Ventana RTU EZ הכנה ב-72 מעלות cc1 ב 95 מעלות צלזיוס במשך 36 דקות 12 דקות הבינלאומי Ki67 בסרטן השד עובד קבוצה המלצות25

בטבלה 2: רשימה של נוגדנים, שיבוטים, דילולים, אנטיגן אחזור שיטות ומערכות הבקיע אימצו ניתוחים immunohistochemical. המיון, קולטן אסטרוגן; יחסי ציבור, קולטני פרוגסטרון; RTU, מוכן לשימוש.

Histotype n (%) ER + (%) PR + (%) נמוך Ki67 (%) Ki-67-גבוהה (%) HER2 + (%)
קרצינומה פולשנית של אין סוג מיוחד 344 (77.5) 301 (87.5) 257 (74.7) 85 (24.7) 259 (75.3) 71 (20.6)
קרצינומה פולשנית lobular 53 (11.9) 53 (100.0) 44 (83.0) 36 (67.9) 17 (32.0) 4 (7.5)
קרצינומה פולשנית, מסוג מעורב 9 (2.0) 8 (88.9) 6 (66.7) 0 (0.0) 9 (100.0) 1 (11.1)
קרצינומה של הכרישים 8 (1.8) 8 (100.0) 8 (100.0) 8 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
רירני קרצינומה 11 (2.4) 11 (100.0) 9 (81.8) 7 (63.6) 4 (36.4) 0 (0.0)
Micropapullary קרצינומה 7 (1.6) 7 (100.0) 7 (100.0) 5 (71.4) 2 (28.6) 2 (28.6)
קרצינומה פולשנית עם apocrine featueres 5 (1.1) 3 (60.0) 1 (20.0) 1 (20.0) 4 (80.0) 3 (60.0)
קרצינומה papillary 1 (0.2) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (100.0) 0 (0.0)
מדולרי קרצינומה 4 (0.9) 0 (0.0) 1 (25.0) 0 (0.0) 4 (100.0) 0 (0.0)
קרצינומה metaplastic 2 (0.5) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0) 0 (0.0)
סה 444 391 (88.0) 333 (75.0) 142 (32.0) 302 (68.0) 81 (18.2)

טבלה 3: השד סרטן histotypes, קולטן מצב ומצב הטרוגניות HER2. המיון, קולטן אסטרוגן; יחסי ציבור, קולטני פרוגסטרון; Ki67-נמוכה, Ki67 אינדקס < 18%; Ki67-גבוהה, Ki67 > 18%.

כתמים אמצעים interpretable HER2 חיובי כתמים (%) מצב קולטני הורמון המקרים HER2-הטרוגניות
6 5 (83) חיובי 10
6 5 (83) שלילי 1
6 4 (67) חיובי 7
6 4 (67) שלילי 1
6 2 (33) שלילי 1
6 1 (17) חיובי 1
5 3 (60) חיובי 10
5 1 (20) חיובי 2
4 3 (75) חיובי 9
4 2 (50) חיובי 8
4 1 (25) שלילי 1
3 2 (67) חיובי 5
3 1 (33) חיובי 2
46 25 (54) 53 (93) 57

בטבלה 4: HER2 ביטוי, הורמון קולטן מצב, ובמקרים HER2-הטרוגניות. בין המקרים HER2-הטרוגניות 57, 4 (7%) במקרים היו ER-שלילי, יחסי ציבור-שלילי, המאשרת את החשיבות הקלינית של הערכת HER2 הטרוגניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

. הנה, שתוארו האסטרטגיות מעבדה לביצוע ניתוחים SISH של הגן HER2 ו שלה צנטרומר המתאימה בניסית אותו בעבר לתפוקה גבוהה של סרטן השד heterogeneously מעובד. שיטה זו היא חסכונית, יכול להתבצע במעבדות רוב לצורך המחקר של HER2 הטרוגניות ג'ין הגברה ב קוהורטות גדולות של השד סרטן לאחזר טופס פתולוגיה ארכיונים.

בשל החשיבות הקלינית של HER2 בדיקות סרטן השד והאתגרים שנוצר על ידי ביטויה הטרוגנית, פיתחנו פרוטוקול בדיקת תפוקה גבוהה כדי להעריך אינטרה - ולא בין - tumor הטרוגניות גנטית HER2 . האזורים שנותחה כוללים רכיבים מראש פולשני ו פולשני, על בסיס ספציפי cytological, אדריכלי ותכונות IHC.

ישנם מספר שלבים קריטיים, זה צריך להיות מנוהל בקפידה של פרוטוקול זה. צעד חיוני הוא הבחירה של האזורים של עניין. אנחנו קבעו כי הביאור של אזורים טופוגרפיים שונים דרך רב תחומית הוא מרכזי להבטחת האיכות של ניתוח מולקולרית הסופי. בפרט, הגרסה משותפת של השקופיות האבחון שבוצעה על-ידי הפתולוג, טכנאי להגדיל מאוד את מספר המקומות נאותה (קרי, כתמים המשקף את האזור מזוהה בשקופית) ולהפחית לאחר מכן הכשלונות של ניתוח חד-כתמים. עם זאת, מספר מקומות הגידול יכול להיות אבוד לאחר טורי מקטעים עבור מספר ניתוחים IHC ולאחר איש. כדי להתגבר על אי הנוחות הזו, אנו ממליצים על בניית ניסית אותו בעבר כפול או משולש, אם ריאלי בכלל מבוסס על זמינות הרקמה. יתר על כן, אנחנו מדגישים את חשיבות הגדרת מעבדה מחמירים ההליכים להקמת מקבל FFPE רחובות עבור ניסית אותו בעבר. אכן, הבחנו כי סדק מזערי בבלוק TMA עלול להסיק הניתוח איש כולו מבחינת איכות הפארמצבטית, בהירות של התגובה. אם התרחשה סדקים, צריך להיות התעלמו הרחוב תורם לבנייה TMA. יש להכיר בכך, אולם, כי IHC היה יכול. להתבצע כבר ניסית שיוצרת אותו בעבר, אין ראיות של בעיות טכניות במהלך ניתוח מסוג נצפו הניסיון שלנו.

למרות כי פרוטוקול זה במיוחד ממוטב עבור HER2 ניתוחים SISH של השד לתפוקה גבוהה ניסית אותו בעבר, זה של הערה כי ניתוחים אחרים, כגון דגים, IHC, ניתן באופן אמין לבצע מספר סוגי רקמות, כפי שתואר לעיל14, 19,26. עם זאת, במסמך זה הגדרנו את המספר האידיאלי של כתמים, המאפיין טופוגרפית של TMA כדי להבטיח ניתוחים SISH באיכות גבוהה, לשחזור של הגן HER2 ב דגימות סרטן השד. עוד נקודה משמעותית מיוצג על ידי, העיצוב מחדש של פרוטוקולים סטנדרטיים SISH automatized כדי להתאים את ייחודו של הדגימות מרובים כדי להיות מנותח. אכן, הנחיות היצרנים עשויים בדרך כלל עבור הניתוחים מולקולרית סעיפים עטיית המקובלת ולאחר ולכן אינם מסוגלים להגיע סטנדרטים גבוהים על דגימות רקמות heterogeneously מעובד, כמו למשל ב ניסית אותו בעבר מבלוקים FFPE הארכיון. לשם כך, סיפקנו תיאור צעד אחר צעד של פרוטוקול אמין מותאם אישית עבור ניתוחים SISH בדגימות אלה בעייתי.

זה יהיה מאוד מועיל לחקור את הטרוגניות של HER2 וביטוי גנים הגברה במובן של ההתפלגות הטרוגנית של אחרים סמנים מולקולריים קלינית שבידיך סרטן השד. למטרה זו, בהמשך מחקרים translational יש צורך לחקור את תוקפו של השיטה שלנו עבור ניתוחים מולקולריים הרלוונטית קלינית אחרים, כגון לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה (MALDI-MSI)27. לאחרונה, הניהול של רקמות FFPE לניתוח MALDI-MSI הפך ריאלי, אף על פי שזה מאתגר. בחיי עיר פרוטיאומיה מבנית טכניקה זו מאפשרת הפריט החזותי של ההתפלגות המרחבי של חלבונים, פפטידים במקטעים רקמות פתולוגי, כולל סרטן השד.

פרוטוקול זה יש מספר שלבים קריטיים יכול שעלול להפריע הניתוח הסופי. תשומת הלב הראשון, מסוים צריך להיות משולם לעבר המנגנונים שונים HER2 הגברה. לדוגמה, כרומוזום 17 polysomy הוא סטייה גנטית שעלולה להתרחש השד סרטן11, המייצג את מנגנון חלופי ידועים עבור המספר עותק HER2 מוגבר. מצב זה, אמנם לא בתדירות גבוהה, עשוי להשפיע לא רק בתכונות ביולוגיות של סרטן, ניהול המטופל אלא גם הבדיקות איש. שנית, זה כבר מתואר כי הטרוגניות גנטית אינטרה-גידול להתרחש גם ברמה של תא בודד, לא רק באזורים אמצעים שונים. פרוטוקול זה אין אפשרות להגדיל את הכוח זיהוי של מצב מסוים זה בהשוואה עטיית מקטעים. יתר על כן, חשוב להדגיש כי המחקר מבוסס-TMA הטרוגניות מרחבי יש כמה מגבלות מהותי, לרבות העדר ניתוח מקיף של כל החלק. מחקר זה, עם זאת, יש לשקול הוכחה-של-עיקרון הטרוגניות של HER2 ג'ין הגברה יכול להיות מוערך באמצעות פלטפורמה תפוקה גבוהה וחסכונית, שימוש בציוד מעבדה סטנדרטיים. מחקרים נוספים ניתוח קטעים עטיית טורי של המקרים HER2-הטרוגניות, בשילוב עם חדשנית במחקרים מולקולריים ועל נתונים קליניים של חולים יידרשו כדי לאמת את פרוטוקול זה.

לסיכום, מיפוי מקיף של HER2 מעמד דגימות של סרטן השד HER2 הטרוגנית, החקירה של מוטציות גנטיות פוטנציאלי של הנהג ברכיבי HER2 שלילי להסתמך על הניתוח של אזורים אמצעים מרובים. ניתוח זה דורש עלויות בלתי נסבל ואת המאמצים באמצעות מתקני אבחון סטנדרטי. שיטה זו מייצגת כלי אמין עבור אפיון HER2 הטרוגניות גנטית קבוצות גדולות של מרובות, סרטן השד מעובד heterogeneously בו זמנית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לך אין קונפליקטים של אינטרסים.

Acknowledgments

. לא-

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26x76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device - digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136, (6), 864-871 (2011).
  2. Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232, (2), 219-229 (2014).
  3. Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31, (31), 3997-4013 (2013).
  4. Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12, (8), 1021-1032 (2012).
  5. Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133, (4), 611-612 (2009).
  6. Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54, (3), 532-538 (2011).
  7. Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64, (12), 1112-1116 (2011).
  8. Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. 'Genetic heterogeneity' in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25, (5), 683-688 (2012).
  9. Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136, (2), 266-274 (2011).
  10. Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25, (7), 938-948 (2012).
  11. Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27, (1), 4-18 (2014).
  12. Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now? Expert Rev Mol Diagn. 15, (3), 385-398 (2015).
  13. Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10, (12), e0144923 (2015).
  14. Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies - a systematic literature review. Histopathology. 68, (3), 323-332 (2016).
  15. Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16, (8), 1266-1270 (2016).
  16. Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26, (6), 816-824 (2013).
  17. Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. Eight, Springer International Publishing. (2017).
  18. Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. WHO Classification of Tumours of the Breast. 4th, IARC press. (2012).
  19. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4, (7), 844-847 (1998).
  20. Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68, (2), 262-271 (2016).
  21. Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29, (11), 1292-1305 (2016).
  22. Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70, (6), 906-917 (2017).
  23. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28, (16), 2784-2795 (2010).
  24. Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22, (35), 7926-7937 (2016).
  25. Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103, (22), 1656-1664 (2011).
  26. Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14, (3), R93 (2012).
  27. De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11, (6), 1507-1514 (2015).
בניית פלטפורמה תפוקה גבוהה ההקרנה כדי להעריך את הטרוגניות של HER2 הגברה ג'ין סרטן שד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).More

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter