Summary
이 프로토콜 기능 학습/메모리 환기가 심장 마비 유발 뇌 허 혈에 평가 하는 수정 된 T-maze의 사용을 설명 합니다.
Abstract
배경: 글로벌 대뇌 국 소 빈 혈 (즉, 심장 마비) 모델에 적당 한 인지 장애에 약한 평가 어려울 수 있습니다 불 쌍 한 운동으로 인해 수술 후. 예를 들어 쥐가 수술을 받아야 하 고 모리스 물 미로에 복종 하지 수 수영, 따라서 실험을 무효화.
새로운 방법: 수정 된 행동 자발적 교체 T-maze 테스트를 설립 했습니다. 수정된 T-maze 프로토콜의 주요 장점은 충분히 강력한 국 소 빈 혈 후 기능 학습/메모리를 평가 하는 그것의 상대적으로 간단한 디자인. 또한, 데이터 분석은 단순 하 고 간단. 우리는 쥐의 학습/메모리 적자 (6 분) asphyxial 심장 마비 (ACA) 중간에 가벼운의 유무에서 결정 하는 T-maze를 사용 합니다. 쥐 탐험을 위한 자연적인 경향이 있고 반면 hippocampal lesioned 쥐 hippocampal 관련 공개 감소 자발적인 교체 비율에 사이드-기본 설정 결과 채택 하는 경향이, T-maze에서 다른 무기를 모색할 것입니다. 기능 학습/메모리 ACA의 유무입니다.
결과: ACA 그룹 높은 쪽 기본 비율 및 제어에 비해 낮은 교대에 있다.
기존 방법을 가진 비교:는 모리스 물, 반 즈 미로 학습/메모리 기능을 평가 하기 위한 더 저명한 있습니다. 그러나, 모리스 물 미로 다른 미로 보다 더 스트레스. 반 즈 미로 널리 ACA 유도 neurocognitive 적자는 더 밀접 한 관련이 (단기) 메모리 작업 하는 동안 참조 (장기) 메모리를 측정 하는 데 사용 됩니다.
결론: 우리는 우리의 글로벌 뇌 허 혈 모델 (ACA)에서 일 하는 (단기) 메모리는 T-maze 통해 윤곽을 그리 다 하는 간단 하면서도 효과적인 전략을 개발 했습니다.
Introduction
미국 심장 협회 (2017), 심장 마비 (CA)-유도 사망률 4 분 마다 발생 합니다 및 미국1에 있는 년 당 이상의 400000 사람들에 영향을 줍니다. 그것은 잘 문서화 된 CA 부족 한 혈액 관류2,,34결과로 신경 뇌 손상 발생할 수 있습니다. 해 마5,6,7, 학습 및 메모리8,9, 중요 한 신경에 영향을 미치는 허 혈-민감한 CA1 지역에서 캘리포니아 유도 뇌 손상 발생 10,,1112. 또한, 모 수석 등뼈 밀도, 해 마 (즉 CA1 신경), 허 혈 성 조건에서의 손실 공간 메모리 손상13,,1415에 중요 한 역할을 하고있다. CA 후 이러한 병 적인 변화, 행동 장애 등: 불안, 우울증, 외상 후 스트레스 장애, 및 기억 상실 되어 있습니다. 향상 된 CA 생존 율 연관 의료 기술 (즉, 효율적인 외래 서비스) 발전 되어, 대부분 (저체온증)를 제외 하 고 신경 치료의 CA16 후 기능적인 결과 개선 하기 위해 실패 ,17. 일반적으로 CA 생존자는 가난한 삶의 질, 있고16지출 증분 의료 부담.
행동 검사를 통해 뇌 허 혈에 대 한 인지 상태 평가 두 약물 효능을 확인 하 고 궁극적으로 성공적인 임상 시험을 개발 하는 것이 중요입니다. 1940 년, 에드워드 썬 마 기반 공간 메모리18공부 첫 동작 시험 설계. 그 후, 다른 미로 (즉 모리스 물 미로, 방사형 미로, T-또는 Y-미로, 그리고 반 즈 미로) hippocampal 기반 공간 학습 및 메모리 쥐19,20,21,22에에서 개발 되었다 ,23. 모리스 물 미로 공간 학습 검사는 더 널리 행동 테스트 중 이며 쥐에 메모리 모델24. 그러나, 모리스 물 미로 쥐를 수영 하 고 전체 모터 기능과 제어를 발휘 해야 합니다. Asphyxial 심장 마비 (ACA, CA의 쥐 모델) 모델과 같은 허 혈 실험, 대 퇴 동맥/정 맥 cannulation 중요 한 혈압, 혈액 가스 및 다양 한 약물의 도입 가져오는 데 필요 합니다. 대 퇴 동맥/정 맥 cannulation 다리 이동성 렌더링 제대로 수영 하는 쥐의 기능을 억제 하실 수 있습니다, 이후 모리스 물 미로 ACA에서 인지 장애 테스트에 가장 적합 한 않을 수 있습니다.
반 즈 미로 공간 학습 및 설치류 모델에서 메모리 검사를 다른 널리 사용 되 행동 테스트입니다. 반 즈 미로 전체 모터 기능과 제어의 분 발을 요구 하지 않는다 따라서 모리스 물 미로 보다 스트레스를 덜 하 고. 과거에는, 우리 반 즈 미로 기능 학습/메모리 차이 사이 발생을 사용 하 여 실험을 수행 제어 또는 ACA 유발 쥐 대 가짜. 데이터 동안 얻은 반 즈 미로 해상도 반 즈 미로 널리 참조 (장기) 메모리25,26을 측정 하는데 사용 되는 사실 때문에 적당 한 ACA에 약한 다음 인지 장애 테스트를 하지 않은 대 한, ACA 유도 neurocognitive 적자 더 밀접 하 게 일 (단기) 메모리27,,2829,30 반 즈 미로 덜 우리의 ACA에 메모리 기능을 평가 하기 위한 실용적 제안 관련 모델입니다.
우리는 따라서 ACA 후 (단기) 메모리 작업 평가를 자발적 교체 테스트를 사용 하 여 수정 된 T-maze를 개발 했다. 수정 된 T-maze 자발적인 교체 테스트의 주요 장점은 단순 하 고 행동 하는 다른 검사에 비해 쥐에 최소한의 스트레스 수정된 T-maze로 무거운 잘 계산으로 이전 동물 훈련을 요구 하지 않는다는 사실 때문 분석 또는 모리스 물 미로 반 즈 미로 의해 필요에 따라 하위 루틴 (예: 쥐의 비디오 영상). 여기 우리가 표시 수정된 T-maze 자발적인 교체 테스트는 간단 하 고 아직 매우 효율적인 행동 평가 패러다임 충분 한 해상도를 정확 하 게 감지 하 고 단기 기억 상실을 일으키는 원인이 되는 질병에서 hippocampal 기능 평가 제공할 수 있는 (즉, ACA)입니다.
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Protocol
모든 실험 절차 했다 건강의 국가 학회의 지침에 따라 실시 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (LSU 건강 과학 센터-위조) 남성 Sprague Dawley 쥐 (의 사용에 대 한 승인 300-350 g, 9 10 주 오래 된). 쥐는 ACA 수술 전에 하룻밤 금식 했다.
1. T-maze 장치 설계 및 설정
주: 자료는 집사와 롤 린스 2006 모델31에 T-maze 디자인.
- SketchUp32를 이용 하 여 미로의 3D 구조 디자인. T-maze의 3 차원 구조를 만들려면 시작 팔은 외부의 길이 200 m m, 3D 프린터의 인쇄 크기에 맞게 148 mm의 165 m m의 너비와 높이 생성 합니다. 5.5 m m의 벽 두께 바닥 두께 8 m m를 사용 합니다.
- 3 차원 프린터를 사용 하 여 미로 인쇄 (재료의 표 참조)32. 실험실에서 3D 프린터를 사용할 수 없는 경우 나무, 중간 밀도 섬유판, 플라스틱 (즉, 폴 리 염화 비닐), 주택 개선 상점에서 구입할 수 있는 등 다른 재료를 사용 합니다.
- 인쇄 영역에서 높이 제한으로 인해 두 개의 별도 3D 인쇄에 미로의 벽을 생성 하 고 미로 어셈블리에 함께 참여 (두 번째 벽 높이 280 m m의 총 벽 높이 140 mm, 높이 증가 미로 섹션에 추가 되었습니다는 즉,). 각 별도 3D 인쇄 자료 "T" 모양의 잠금 메커니즘, 한 섹션 다음에 연결 되어 있는 포함.
- 목표 팔 시작 팔의 접합에 가입 목표 팔의 시작 팔의 폭 165 m m 다양 한 섹션을 만듭니다. 목표 팔 시작 팔;으로 비슷한 디자인 메서드를 사용 하 여 구성 그러나, 집사와 롤 린스의 디자인 당 100 mm 팔의 폭을 줄일 수 있습니다.
- 자세한 회로도/치수는 T-maze의 그림 1 을 참조 하십시오.
- 시작 팔과 목표 팔의 접합에 있는 디자인에 중앙 파티션 포함. 목표 팔 분할 시작 팔에는 T-maze의 그리고 200 m m 뒤쪽 벽에서이 파티션을 확장 합니다. 이 파티션에 또한 미로 (그림 1)의 높이 확장합니다.
2. asphyxial 심장 마비 (ACA)
- 압력솥 수술 도구 (15 분 동안 121 ° C) 수술의 개시 전에. 수술의 사이트에 동물 머리 15 분 면도 대 한 70% 에탄올에 의해 수술 테이블을 소독. 피부 외과 수술에 대 한 표면에 betadine 솔루션을 적용 합니다.
- Anesthetization
- 4 %isoflurane과의 혼합물으로 O2 와 N2O (300 mL/min O2 와 700 mL/min N2O) 마스크를 통해 쥐 anesthetize
- 게 쥐 기계 환기를 위한 endotracheal 삽 관 법 (삽 관 법, 후 쥐에 연결 된 호흡).
- 낮출 isoflurane 4%에서 2%의 O2 와 N2오 마 취의 깊이 결정 하는 핀치-응답 메서드를 사용과 혼합 하 여 마 취를 유지 합니다.
- 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 연 고를 적용 합니다. Regulae 온도 기준으로 항문 프로브 패드를가 열 하는 설치류에 의해 체온.
- Endotracheal 삽 관 법
- 유도 실에서 쥐를 놓습니다. O2 와 N2o.의 4 %isoflurane 및과 혼합물으로 쥐를 anesthetize
- 유도 실에서 쥐를 제거 합니다. 장소에 있는 마 취 동물 마 취 마스크 쪽으로 쥐의 얼굴로 부정사 위치.
- 왼쪽 또는 오른쪽 왼쪽 엄지와 검지 손가락으로 동물의 혀는 부드럽게 이동합니다.
- 14 게이지 유연 정 맥 카 테 터 (49 m m 긴) 17 게이지 무딘 팁 pipetting 바늘 (93 m m-긴 바늘의 팁에서 10도 각도)를 통해 활강. 기도에 17 게이지 무딘 팁 pipetting 바늘을 삽입 합니다.
- 기관에서 17 게이지 pipetting 바늘에 밖으로 부드럽게 당겨. 호흡기에 14 게이지 카 테 터 허브를 연결 합니다. 0.67 mL/100 g을 60 호흡/분의 호흡 속도 환기 선 볼륨을 조정 합니다.
- 온도 기준으로 항문 프로브 패드를가 열 하는 설치류에 의해 전체 절차 동안 37 ° C에서 머리와 몸 온도 유지 합니다.
- 대 퇴 동맥 및 정 맥 도관 법
- 사 타 구니 지역 (양쪽)에 머리를 면도 하 고 수술에 대 한 표면 피부에 betadine를 적용.
- 부정사 위치에 쥐를 배치. 수술가 위로 사 타 구니 지역에서 절 개 (10 m m)를 확인 합니다.
- 사 타 구니 인 대 노출 때까지 결합 조직 무딘 팁 겸 구분 합니다. 사 타 구니 인 대를 파악 하는 hemostat를 사용 합니다. 대 퇴 동맥 및 정 맥 인 대 사 타 구니 아래 있습니다.
- 무딘 팁 집게를 사용 하 여 대 퇴 동맥 및 정 맥 노출까지 결합 조직 분리.
- 부드럽게 좋은 팁 겸 통해 대 퇴 동맥을 따라 실행 되는 대 퇴 신경을 분리 합니다. 신중 하 게 대 퇴 동맥을 분리 하 고 좋은 팁 겸 통해 단위로 정 맥.
- 좋은 팁 집게를 사용 하 여 대 퇴 동맥 정 맥에서 분리.
- 5-0 비단 봉합 (다리와는 몸으로 다른 하나) 정 맥에서의 2 조각을 놓으십시오.
- 시체 근처에 느슨한 매듭을 묶어. hemostat를 사용 하 여 개최 하 고 신체의 반대편 쪽으로 최대한 봉합을 당겨.
- 다리 근처에 느슨한 매듭을 묶어. 보유 하 고 정 맥 피를 채울 수 있도록 hemostat 통해 다리 쪽으로 봉합을 당겨.
- 마이크로 해 부가 위 (45 ° 각도)에 의해 정 맥 (약 0.1 m m)에 작은 절 개를 확인 합니다. 멸 균된 거 즈와 어떤 피를 담근 다.
- PE-50 카 테 터를 무딘 팁 바늘 주사기 (20 U/mL 헤 파 린과 염 분 가득한)를 연결 합니다. 20 U/mL 헤 파 린과 염 분에 PE 50 테를 채우십시오. 포인트를 만들거나 날카로운 끝을 45 ° 각도로 해 부가 위 PE 50 테를 잘라. 무딘 팁 집게를 사용 하 여 PE 50 카 테 터의 끝을 잡고. 부드럽게 대 퇴 정 맥에 PE 50 카 테 터를 삽입 합니다.
- 카 테 터 삽입 완전히 후 천천히 아무 누출을 덤플링을/염 분의 0.1 mL을 관리할 수 있습니다. 타이 PE 50 카 테 터를 안정 회사 봉합 매듭 (단일-매듭). 다양 한 약물의 지속적인 정 맥 (IV) 주입을 위해 PE 50 카 테 테 르를 유지 합니다.
- 1 mL 주사기는 23 연결 사용 절차에 걸쳐 쥐를 무력화에 대 퇴 정 맥을 통해 Luer 스텁 어댑터 vecuronium 브 로마 이드 (0.67 밀리 그램/kg, 모든 10 분 관리) 관리를 게이지.
- 5-0 비단 봉합 (다리와는 몸으로 다른 하나) 동맥에서의 2 조각을 놓으십시오.
- 다리 근처에 느슨한 매듭을 묶어. hemostat를 사용 하 여 개최 하 고 다리 쪽으로 최대한 봉합을 당겨.
- 시체 근처에 느슨한 매듭을 묶어. 누른 키를 누른 채 당겨 동맥 피를 채울 수 있도록 hemostat 통해 몸으로 봉합 합니다.
- 마이크로 해 부가 위 (45 ° 각도)에 의해 동맥 (약 0.1 m m)에 작은 절 개를 확인 합니다.
- PE-50 카 테 터를 무딘 팁 바늘 주사기 (20 U/mL 헤 파 린과 염 분 가득한)를 연결 합니다. 20 U/mL 헤 파 린과 염 분에 PE 50 테를 채우십시오. 만들 포인트 또는 날카로운 끝을 45도 각도로 해 부가 위 PE 50 테를 잘라. 무딘 팁 집게를 사용 하 여 PE 50 카 테 터의 끝을 잡고. 무딘 팁 집게를 사용 하 여 PE 50 카 테 터의 끝을 잡고. 부드럽게 대 퇴 동맥에 PE 50 카 테 터를 삽입 합니다.
- 카 테 터 삽입 완전히 후 천천히 다시 그 카 테 터는 작동 되도록 주사기에 그립니다. 타이 PE 50 카 테 터를 안정 회사 봉합 매듭 (단일-매듭). 동맥 압력 및 혈액 가스의 연속 녹음에 대 한 PE 50 카 테 테 르를 유지 합니다.
- Asphyxial 심장 마비 (ACA) 절차
- 뇌졸중 볼륨, O2 또는 N2O 레벨을 변조 하 여 필요에 따라 생리 적 매개 변수 (예: 포2, pCO2, 혈압, 및 pH 값)을 조정 합니다. 정상적인 생리 적 범위의 이러한 매개 변수를 사용 하 여: 포2: 100 mmHg, pCO2: 35-40 mmHg, 혈압: 100 mmHg, 그리고 pH: 7.4.
- Vecuronium 브 로마 이드 (0.67 밀리 그램/kg, I.V.) 대 퇴 정 맥을 통해 관리 하 고 2 분 기다리는 23 게이지 Luer 스텁 어댑터와 연결 된 1 mL 주사기 혈압에 있는지 확인 하는 사용 하거나 약 100 mmHg ACA를 수행 하기 전에.
- 호흡기에서 endotracheal 튜브 (카 테 터 허브 14 게이지)를 분리 하 여 가사 (6 분)를 유도. 더 완전 한 가사를 되도록 1 mL 주사기에 의해 endotracheal 튜브를 차단 합니다.
참고: 6 민 환기가 시간 호흡 단절 및 소생의 시작 사이의 기간으로 정의 됩니다. 완전 한 심장 마비는 10 mmHg 보다 낮은 평균 동맥 압력으로 정의 된다. - 면 무 호흡 증의 마지막 분 동안 80 호흡/분, 호흡의 호흡 속도 조정 하 고 0% N2오 2 L/분 O2 증가 이 작업은 모든 나머지 isoflurane 또는 N2O 호흡기에 남아 날 려.
- 가사, 다음 분 endotracheal 튜브에서 1 mL 주사기를 제거 합니다. 호흡기에 endotracheal 튜브를 다시 연결 합니다.
- 1 mL 주사기는 23 연결 사용 게이지 Luer 스텁 어댑터에 피 네 프 린 (0.005 mg/kg, I.V.) 대 퇴 정 맥을 통해 관리 하 고, 인덱스, 엄지와 중간 손가락 x 빛 원형 운동에 있는 동물의 가슴에 의해 수동 가슴 압축을 관리 하 고 z 축 (200/분) 자연 순환 (평균 동맥 압력 ≥ 50 mmHg)33,,3435의 반환까지.
- 또 다른 1 mL 주사기는 23 연결 사용 게이지 Luer 스텁 어댑터 자연 순환에 반환 후 즉시 대 퇴 정 맥을 통해 나트륨 중 탄산염 (1 meq/kg, I.V.) 관리를 (50 mmHg 이상)33,34, 호흡 증 완화에 35 .
- 측정 혈액의 산-염기 상태 (pH ACA 주위 7.35 7.40 있어야 후)을 결정 하는 소생 후 10 분을 다시 가스
- hemostat를 사용 하 여 대 퇴 동맥과 정 맥을 클램프. 천천히 그리고 부드럽게 동맥 및 정 맥 카 테 터 무딘 팁 집게를 사용 하 여 제거 합니다. 대 퇴 동맥/정 맥 출혈을 방지 하기 위해 5-0 비단 봉합 사로 선 3-0 비단 봉합 사를 사용 하 여 외과 사이트 overlying 피부를 닫습니다. 상처 재개의 가능성을 최소화 하기 위해 중단된 suturing 기술을 사용 합니다.
- 쥐 통풍 자체 (보통 30 분 소생술 후 60 분) 때까지 기다립니다, 그리고 통풍 기에서 쥐를 분리 하 고 부드럽게 endotracheal 튜브를 제거.
- 장소 (27 ° C, 50% 습도) 아기가 인큐베이터에 쥐 하룻밤. (물에서 그들을 몸을 담글 하 여 만든) 부드럽게 음식을 놓고 밤새 아기 인큐베이터에 물.
- 개별 케이지를 쥐를 전송 하 고 일반 차 우와 물 동물 시설에 쥐를 반환 합니다. T-maze 테스트 ACA 후 3 일을 시작합니다.
3입니다. T-maze
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동물 준비
- 가짜 (ACA), 수술 전 하루 5 분 동안 각 쥐를 처리 합니다. 결코 상승 쥐가 그들의 새 장 (250 m m x 200 m m, 플라스틱 투명 한 케이지 x 480)에서 때 처리 (그림 2).
- 쥐를 처리 후 부드럽게 쥐 여 선택 한 손으로 다른 손을 지원으로 그것의 꼬리는 ' 다리. 그들은 새 장 (100 m m 높이)를 5 번 손에서 점프 하자. 그들은 음식 또는 싸움에 대 한 지배 하지 것입니다 그래서 개인 연습장으로 각 쥐를 구분 합니다.
- 3 일 가짜 또는 ACA 수술 (그림 2), 후 첫 번째 실행의 시작 전에 조용 하 고 어두운 방으로 케이지로 쥐를 전송 합니다. 만 낮은 전력 책상 램프 켜고 최소 조도 유지 하기 위해 테스트 룸의 모서리에 놓습니다. 10 분 동안 어둠에 적응 하는 쥐를 수 있습니다.
- 쥐 성능에 일주 변화의 어떤 효과 피하기 위해 오후에 모든 실험을 수행 합니다. 연산자는 쥐 받은 가짜 또는 ACA 수술에 조언을 하지 않습니다.
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자발적인 교체
- 미로의 전체 바닥을 커버 (~ 10 밀리미터 두꺼운) 침구의 얇은 층을 확산. 다음 장소 각의 시작 지점입니다 시작 팔 ("T"의 하단)에 쥐를 실행 하도록 쥐를 오른쪽 또는 왼쪽 목표 팔 탐험 3 분.
- 쥐 (쥐의 모든 4 개의 발 목표 팔 입력) 특정 목표 팔을 저지른, 일단 시작 팔과 반대 목표 팔 쥐 반대 목표 팔을 입력 하지 못하도록 하려면 (그림 1) 사이 "T" 연결을 차단 합니다. 30 초 동안 미로에서 쥐를 두고 쥐를 선택 하 고 최소한의 시간 (~ 30 초)에 대 한 그것의 감 금에 다시 배치. "T" 연결 제거는 T-maze에서 (125 mm X 230 X 65 mm 3D 프린터에 의해)를 차단.
- 시작 팔에 쥐를 놓고 3.2.2 반복 합니다. 교체로 정의 됩니다: 쥐에 비해36실행 이전 반대 팔을 입력 하면. 다음과 같이 하루 4 실행을 수행 하는 쥐가 있다:
1세인트 실행
2노스다코타 실행
10 분 휴식
3rd 실행
4번째 실행 - 10 분 휴식 기간 동안과 향기 바이어스를 제거 하기 위해 동물 사이 침구 변경. 75% 에탄올 증류수 실험 매일의 끝에 뒤에 T-maze를 청소.
- 3.2.1 단계를 반복 합니다. -3.2.4. 2 개의 더 일 (총에서 12 실행) 그림2.
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교체 속도 사이드 기본 설정 속도 계산
- 계산 % 교체 및 % 측면 기본 설정, 어디
L: 쥐 선택 왼쪽된 팔
R: 쥐 선택 오른쪽 팔
선택 수정: 실행 2nd (각 세트 포함 두 실행) 주어진된 세트에서 1세인트 와 다르다
잘못 된 선택: 쥐 같은 팔 비슷합니다 이전 실행 선택
예:
주 1: L L / L L
주 2: L L / L R
제 3 일: R L / L L
교체: 2 (올바른 선택) /6 (총 세트 수행) * 100 = 33.33%
사이드 특혜: 10 (L, 선호 쪽) /12 (총 실행 수행) * 100 = 83.33%
- 계산 % 교체 및 % 측면 기본 설정, 어디
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수술 치료:
- 주고 수술 후 2 일에 대 한 모든 12 h buprenorphine (0.01 mg/kg IP) 쥐. 심장 마비 후 최대 1 시간에 대 한 쥐를 관찰 합니다.
- Sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 환기와 난방 패드에 쥐를 연결 합니다. 수술 후 동물 들의 체온을 유지 하기 위해 아기 인큐베이터 (27 ° C, 50% 습도에서 설정)에 쥐를 놓습니다.
- 수술 후 첫 24 시간에 대 한 동물을 부드럽게 차 (물에 몸을 담글 하 여 만든) 제공 합니다. 쥐 식 수 없었다면, bacteriostatic 염 분 관리 (100 mL/kg/일, I.P.) 동물 복구 고 식 수 자유롭게 될 때까지.
- 모든 상처에 통증 (bacitracin 및 lidocaine 연 고) 쥐 국 소 항생제를 줄. 쥐가 다시 이동 동물 시설 후 그들은 완벽 하 게 복구 합니다.
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안락사 메서드
- 5 %isoflurane 및 100% N2O 실험의 끝에 동물을 안락사를 사용 합니다.
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Representative Results
ACA (글로벌 대뇌 국 소 빈 혈)은 주로 (단기) 메모리 적자28,29일 발생 합니다. ACA 후 학습 및 메모리의 기능을 평가, 우리 사용 수정된 자발적 교체 테스트 (단기) 메모리30일. 자발적인 교체 테스트에서 결과 ACA 그룹 (26.19 ± 4.96%)에서 3 일에서 교대 율은 컨트롤 그룹 (62.96 ± 6.07%)에 비해 크게 낮은 것이 좋습니다. (* p0.05) ACA에 쥐 컨트롤에 비해 측면 바이어스 개발 사실 35 (82.14 ± 4.57%, 62.89 ± 2.86% 대 * p0.05) (그림 3a 와 3b)35, 따라서 낮은 자발적인 교체 속도 만납니다. 결과 ± S.E.M. 데이터 뒤에 터키의 게시물-특별 시험37일방통행 ANOVA를 사용 하 여 분석 수단으로 표현 되었다. p < 0.05 (95% 신뢰 수준) 통계적으로 중요 한으로 간주 되었다.
그림 1입니다. T-maze 디자인입니다.
(쥐)에 대 한 미로의 T-모양의 플랫폼 600 mm x 165 mm 시작 팔와 400 m m x 100 m m 목표 팔 "T"의 상단 꼭대기에 지어졌다. 벽의 두께 5.5 m m x 8 m m (층 두께) 이었다. 중앙 분할이이 분할 T-maze 및 100 m m의 뒤 벽에서 목표 무기를 나누어 시작 팔에 확장 시작 팔 목표 팔의 접합 했다. 점선된 사각형 중 팔을 차단 하는 "T" 접합 블록의 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 실험 시간에 표시 한 막대 ACA/가짜 수술 및 T-maze에 대 한
ACA 수술 하루 전에 쥐는 인간의 터치에 쥐를 순응을 4 번 (5 분/각 시간, 하루 0) 처리 합니다. ACA 수술 후 쥐를 치유 하 고 다음 3 일 동안 안정 허용 했다. 복구 후 쥐 3 일 연속 (12 실행, 4 실행/day)에 대 한 자발적인 교체 테스트를 수행합니다. 각 쥐 하루 4 실행을 수행합니다. 실험적인 타임 라인은 가짜 수술에 대 한 동일 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. ACA 후 단기 메모리 적자입니다.
ACA (a)를 받게 하는 쥐에 쪽 기본 속도 증가 관찰할 수 있습니다. 자발적인 교체 속도 제어 (b)에 비해 ACA와 쥐에서 감소 했다. 괄호 안에 숫자는 그룹 당 사용 하는 동물을 나타냅니다. 결과 ± S.E.M. 수단으로 표현 되었다 * P < 0.05 나타냅니다 제어와 크게 다릅니다. 통계 분석은 일방통행 ANOVA Tukey의 포스트 hoc 시험에 평가 됩니다. 이 그림은 리 외., 201735에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
집사와 롤 린스의 프로토콜31에 비해 현재 연구에서 수정 되었다. 3D 프린터는 T-maze 구축에 사용 되었다. 3D 인쇄 상용화 T-maze 저렴 하 고 비용 효율적인 대안을 제공합니다. 테스트 기간 동안 쥐 불안을 줄이기 위해, T-maze는 최소 조명 어두운 방에서 수행 되었다. 일단 쥐 목표 무기 중 하나를 입력, 우리는 부드럽게 반대 팔을 차단. 이 단두대 문을 낮추고 있는 동안 쥐의 꼬리에 가능한 손상을 뿐만 아니라 테스트, 가능한 스트레스를 피 한다. 불필요 한 스트레스 후속 실행에 쥐의 성능을 억제 됩니다. 따라서, 우리 모든 연 삭 소음 테스트 동안 플라스틱 단두대 문을 슬라이딩에서 현재 연구에 게이트 "T" 접합 블록 활용. 이 단계는 T-maze 실험 기간 동안 크게 쥐 불안을 줄일 수 있습니다.
습관 들 임은 이후 불안 쥐가 미로에 실행 하도록 동기 부여 성공적인 T-maze 연구에 대 한 중요 한 단계 이다. 따라서, 쥐 인간의 터치, 높이, 그리고 실험 전에 미로를 케이지에서 이동에 순응을 보장 하기 위해 필수적입니다. 불안 쥐 소리 또는 치찰음의 소리 연산자 들을 터치 하려고 할 때 확인 합니다. 또한, 불안 쥐 긴 얼어 응답 또는 전체 동안 미로에서 실행을 거부 하거나 제시 T-maze 실험. 그들은 일반적으로 미로 탐색 하지 않고 시작 팔에 시간의 대부분을 보내고 있습니다. 쥐가 미로에서 실행 하지 않는, 그들의 꼬리를 부드럽게 터치 하 고 실행 됩니다. 다른 가능한 이유는 쥐 부족 habituation 받았다. 부드럽게 장에 다시 쥐를 넣어 하 고 그들의 불안을 감소 10 분 기다립니다. 쥐가 실행을 완료 하는 데 실패 하는 경우 다시, 그 쥐 연구에서 제외 됩니다. 쥐가 3 분에 단일 실행을 완료할 수 없습니다, 다시 그것의 감 금에 넣어 하 고 10 분 동안 기다립니다. 쥐 아직도 실행을 완료 하는 데 실패, 쥐 연구에서 제외 해야 합니다. 쥐 연장된 기간 또는 주파수에 대 한 테스트를 수행 또는 한 시간 이상에 대 한 테스트 룸에 머물 하지 해야, 그렇지 않으면 그들은 참신의 부족으로 인해 실행이 중지 됩니다.
이전 연구는 쥐의 70% 전시 왼쪽 또는 오른쪽 바이어스38,39나타났습니다. 이 측면 바이어스 쥐39T-maze 성능을 악화 시킨다. 따라서, 우리는 현재 연구에 쥐의 포함 및 제외 조건을 지정. 우리의 T-maze 연구에서 받은 15 쥐 ACA 수술 총을 테스트 했습니다. ACA 치료 쥐에 있는 평균 교체 비율은 29 ± 4% 이다. 없으므로 컨트롤 또는 가짜 쥐 hippocampal 부상 또는 학습/메모리 적자, 우리가 가설을 제어 또는 가짜 쥐 ACA 치료 동물에 비해 더 나은 T-maze 성능 (교체 속도 ≥ 29 ± 4%)을 가져야 한다. 따라서, 쥐 면 기본 설정 하거나 미로에서 배우고 실패 제안 교체 속도 < 29% (교체 ≤ 1의 총 수), 제어 또는 가짜 쥐 연구에서 제외 해야 합니다. 우리 25 제어 쥐이 제외 기준을 적용 했습니다. 6 그들 (24%)이 사이드 기본 속도 (85 ± 3%)와 낮은 자발적인 교체 속도 (29% 보다 낮은)의 연구에서 제외 되었다.
T-maze 자발적인 교체 실험 쥐의 자연적인 경향이 참신 탐험에 상당히 의존 이다. 따라서, T-maze 자발적인 교대 프로토콜의 주요 한계는 쥐 결국 미로에서 실행을 중단 합니다. 우리의 과거의 경험을 바탕으로, 쥐는만 3 일 동안 미로에서 실행 하고자 합니다. Asphyxial 심장 마비는 주로 단기 메모리 적자에서 발생, 이후 우리가 다른 뇌 부상/질병에 (즉, 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 그리고 일시적 허 혈 발작) 또한 관련 된 우리의 현재 발견을 추정할 수 있습니다. 짧은 메모리 적자입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품으로는 국립 연구소의 건강/국립 연구소의 신경 장애 지원 선 1R01NS096225-01A1 부여, 미국 심 혼 협회 보조금 AHA-13SDG1395001413, 17GRNT33660336 AHA, AHA-17POST33660174는 루이지애나 주립 대학 그랜트 원조 연구 위원회, 말 콤 Feist 심장 혈관 연구 원정대, 고 블 린 F. 일행 두뇌 연구소에서.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | MakerBot | Replicator | Fifth generation |
| 3D Printer Filament | Hatchbox | PLA, 1.75 mm filament diameter | |
| 200 Proof Pure Ethanol | Koptec | V1005SG | |
| Sani-Chips | PJ Murphy-Forest Products | Size: 8 to 20 mesh; 2.2 cubic foot/package; autoclavable bags | |
| Rat | Charles River Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Vecuronium bromide | Sun Pharmaceutical | 47335-931-40 | 10 mg |
| Epinephrine | Par Pharmaceutical | 42023-103-01 | Adrenalin Chloride Solution 1 mg/mL, 1:1000 |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection | Pfizer | 00409-2012-32 | 0.3mg/mL |
| SketchUp | Trimble Inc. | 3D modeling software | |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | Animals raging in size from mouse to guinea pig (10g to 1kg) |
| PowerLab 8/35 | Adinstruments | PL3508 | 8 analog input channels – 4 of which can be used in differential mode. |
| Bio Amps | Adinstruments | FE132 | The Bio Amp is a galvanically isolated, high-performance differential bio amplifier optimized for the measurement of a wide variety of biological signals such as ECG, EMG and EEG recordings. |
| Quad Bridge Amp | Adinstruments | FE224 | A four-channel, non-isolated bridge amplifier designed to allow the PowerLab to connect to most DC bridge transducers. |
| LabChart 8 | Adinstruments | ||
| ABL80 FLEX CO-OX blood gas analyzer | Radiometer | pH / p CO2 / p O2 | |
| SURFLO Teflon I.V. Catheter | Terumo | sc-361556 | Only use the flexible thin wall catheter (49-mm long) |
| Pipet/Infusion Needle | Hamilton | 7748-03 | 17-gauge; 93-mm long; 10-degree angle |
| Classic T3 Vaporizer | SurgiVet | VCT302 | Classic T3 Isoflurane Funnel Fill |
| ENVIRO-PURE Charcoal Canister | SurgiVet | 32373B10 | Designed to absorb waste anesthetic gas |
| O2 single flowmeter | SurgiVet | 32375B1 | 0-1000 mL |
| N2O Flowmeter | VetEquip | 401721 | 0-4LPM |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter (Sterile) | Becton Dickinson | 427565 | 23 gauge |
| Micro Forceps | Black and Black surgical | B3FRC-18 RM-8 | 7 1/4" (18 cm), 8mm RH, counterweight w/ guide pin 2mm, platform 6 x .3 mm, curved. |
| Halstead Mosquito Forceps | Roboz | RS-7111 | Curved; 5" Length, 1.3 mm tip diameter, 2.1 mm jaw width |
| Mixter Forceps | Roboz | RS-7291 | 5.25" Curved Extra Delicate, 1.1 mm tips |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | Straight, Sharp Points; 9 mm Cutting Edge; 0.15 mm Tip Width; 3 1/2" Overall Length |
| Mayo-Stille Scissors | Roboz | RS-6891 | 5.5" Round Curved |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | 45 Deg Dumoxel Tip Size .10 x .06 mm |
| Olsen-Hegar Combination Scissor And Needle Holder | Roboz | RS-7884 | Cross Serration Tip; 5.5" Length |
| Moloney Forceps | Roboz | RS-8254 | Serrated; Slight Curve; 4.5" Length |
References
- Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133, e38-e360 (2016).
- Beuret, P., et al. Cardiac arrest: prognostic factors and outcome at one year. Resuscitation. 25, 171-179 (1993).
- Kim, Y. J., et al. Long-term neurological outcomes in patients after out-of-hospital cardiac arrest. Resuscitation. 101, 1-5 (2016).
- Earnest, M. P., Yarnell, P. R., Merrill, S. L., Knapp, G. L. Long-term survival and neurologic status after resuscitation from out-of-hospital cardiac arrest. Neurology. 30, 1298-1302 (1980).
- Cerchiari, E. L., Safar, P., Klein, E., Cantadore, R., Pinsky, M. Cardiovascular function and neurologic outcome after cardiac arrest in dogs. The cardiovascular post-resuscitation syndrome. Resuscitation. 25, 9-33 (1993).
- Petito, C. K., Feldmann, E., Pulsinelli, W. A., Plum, F. Delayed hippocampal damage in humans following cardiorespiratory arrest. Neurology. 37, 1281-1286 (1987).
- Schmidt-Kastner, R., Freund, T. F. Selective vulnerability of the hippocampus in brain ischemia. Neuroscience. 40, 599-636 (1991).
- Corkin, S. What's new with the amnesic patient H.M.? Nat Rev Neurosci. 3, 153-160 (2002).
- Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. 1957. J Neuropsychiatry Clin Neurosci. 12, 103-113 (2000).
- Smith, T. D., Calhoun, M. E., Rapp, P. R. Circuit and morphological specificity of synaptic change in the aged hippocampal formation. Neurobiol Aging. 20, 357-358 (1999).
- Gage, F. H., Dunnett, S. B., Bjorklund, A. Spatial learning and motor deficits in aged rats. Neurobiol Aging. 5, 43-48 (1984).
- Tulving, E., Markowitsch, H. J. Episodic and declarative memory: role of the hippocampus. Hippocampus. 8, 198-204 (1998).
- Neigh, G. N., et al. Cardiac arrest with cardiopulmonary resuscitation reduces dendritic spine density in CA1 pyramidal cells and selectively alters acquisition of spatial memory. Eur J Neurosci. 20, 1865-1872 (2004).
- Volpe, B. T., Davis, H. P., Towle, A., Dunlap, W. P. Loss of hippocampal CA1 pyramidal neurons correlates with memory impairment in rats with ischemic or neurotoxin lesions. Behav Neurosci. 106, 457-464 (1992).
- Astur, R. S., Taylor, L. B., Mamelak, A. N., Philpott, L., Sutherland, R. J. Humans with hippocampus damage display severe spatial memory impairments in a virtual Morris water task. Behav Brain Res. 132, 77-84 (2002).
- Lee, R. H., et al. Fatty acid methyl esters as a potential therapy against cerebral ischemia. OCL. 23, D108 (2016).
- Lee, R. H., et al. Chapter 1. Palmitic acid: occurrence, biochemistry and health effects. Porto, L. F. , Nova Science Publishers, Inc. 1-15 (2014).
- Tolman, E. C., Gleitman, H. Studies in spatial learning; place and response learning under different degrees of motivation. J Exp Psychol. 39, 653-659 (1949).
- Koopmans, G., Blokland, A., van Nieuwenhuijzen, P., Prickaerts, J. Assessment of spatial learning abilities of mice in a new circular maze. Physiol Behav. 79, 683-693 (2003).
- Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J Comp Psychol. 93, 74-104 (1979).
- Paul, C. M., Magda, G., Abel, S. Spatial memory: Theoretical basis and comparative review on experimental methods in rodents. Behav Brain Res. 203, 151-164 (2009).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. ILAR J. 55, 310-332 (2014).
- Sharma, S., Rakoczy, S., Brown-Borg, H. Assessment of spatial memory in mice. Life Sci. 87, 521-536 (2010).
- Poon, T. P., et al. Spinal cord toxoplasma lesion in AIDS: MR findings. J Comput Assist Tomogr. 16, 817-819 (1992).
- Sunyer, B., Patil, S., Höger, H., Lubec, G. Barnes maze, a useful task to assess spatial reference memory in the mice. Nat Protoc. 390, (2007).
- Shoji, H., Hagihara, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. T-maze forced alternation and left-right discrimination tasks for assessing working and reference memory in mice. J Vis Exp. , (2012).
- Seeger, T., et al. M2 muscarinic acetylcholine receptor knock-out mice show deficits in behavioral flexibility, working memory, and hippocampal plasticity. J Neurosci. 24, 10117-10127 (2004).
- Olton, D. S., Feustle, W. A. Hippocampal function required for nonspatial working memory. Exp Brain Res. 41, 380-389 (1981).
- Hayashida, K., et al. Hydrogen inhalation during normoxic resuscitation improves neurological outcome in a rat model of cardiac arrest independently of targeted temperature management. Circulation. 130, 2173-2180 (2014).
- Spontaneous alternation behavior. Dember, W. N., Richman, C. L. , (1989).
- Deacon, R. M., Rawlins, J. N. T-maze alternation in the rodent. Nature protocols. 1, 7-12 (2006).
- Wong, K. V., Hernandez, A. A review of additive manufacturing. ISRN Mechanical Engineering. 2012, (2012).
- Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171, 566-576 (2010).
- Lin, H. W., et al. Fatty acid methyl esters and Solutol HS 15 confer neuroprotection after focal and global cerebral ischemia. Transl Stroke Res. 5, 109-117 (2014).
- Lee, R. H., et al. Interruption of perivascular sympathetic nerves of cerebral arteries offers neuroprotection against ischemia. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 312, H182-H188 (2017).
- Bali, Z. K., et al. Differential effects of alpha7 nicotinic receptor agonist PHA-543613 on spatial memory performance of rats in two distinct pharmacological dementia models. Behav Brain Res. 278, 404-410 (2015).
- McDonald, J. H. Handbook of biological statistics. 2, Sparky House Publishing. Baltimore, MD. (2009).
- Castellano, M. A., Diaz-Palarea, M. D., Rodriguez, M., Barroso, J. Lateralization in male rats and dopaminergic system: evidence of right-side population bias. Physiol Behav. 40, 607-612 (1987).
- Andrade, C., Alwarshetty, M., Sudha, S., Suresh Chandra, J. Effect of innate direction bias on T-maze learning in rats: implications for research. J Neurosci Methods. 110, 31-35 (2001).
