Summary
Bu iletişim kuralı fonksiyonel öğrenme/bellekte boğulma serebral iskemi kalp krizi kaynaklı değerlendirmek için değiştirilmiş bir T-maze açıklar.
Abstract
Arka plan: hafif bir küresel serebral iskemi (yani kalp krizi) modelinde ılımlı kognitif bozukluk için değerlendirmek ameliyattan sonra zavallı hareket nedeniyle zor olabilir. Örneğin, rats kim cerrahi işlemler geçmesi ve Morris su labirent tabi böylece deneme geçersiz kılma yüzmek mümkün olmayabilir.
Yeni yöntem: Değiştirilmiş davranış kendiliğinden münavebe T-maze test kurduk. Değiştirilmiş T-maze Protokolü'nün en büyük avantajı fonksiyonel öğrenme/bellek iskemi sonra değerlendirmek için güçlü nispeten basit tasarımı var. Ayrıca, veri analizi basit ve anlaşılır. T-maze rats öğrenme/bellek açıkları hem varlığı veya yokluğu (6 dk) asphyxial kardiyak arrest (ACA) orta hafif belirlemek için kullanılır. Sıçan keşif için doğal bir eğilim var ve lesioned Hipokampal fareler bir yan-tercih azalmış spontan değişim oranları, Hipokampal ilgili ortaya çıkan kabul eğilimindedir, ancak diğer kollarında T-maze araştıracaktır fonksiyonel öğrenme/bellekte ACA olup.
Bulgular: ACA grupları daha yüksek yan-tercih oranları ve denetim ile karşılaştırıldığında daha düşük değişiklikler var.
Varolan yöntemleri ile karşılaştırma: Morris su ve Barnes labirent öğrenme/Hafıza fonksiyonu değerlendirmek için daha belirgin. Ancak, Morris su labirent diğer labirentine daha fazla stresli. Barnes labirent yaygın olarak süre ACA kaynaklı nörobilişsel açıkları (kısa vadeli) bellek çalışmak için daha yakından ilgili başvuru (uzun vadeli) bellek, ölçmek için kullanılır.
Sonuç: Biz bizim küresel serebral iskemi modelinde (ACA) yolu ile T-maze (kısa vadeli) bellek çalışma betimlemek için basit ama etkili bir strateji geliştirdik.
Introduction
Amerikan Kalp Derneği (2017), kardiyak arrest (CA) göre-indüklenen Ölüm dört dakikada oluşur ve Amerika Birleşik Devletleri1yılda 400. 000'den fazla insanı etkiliyor. CA nöronal beyin hasarı sonucu olarak yetersiz kan perfüzyon2,3,4neden olabilir iyi belgelenmiş. Öğrenme ve bellek8,9için kritik olan sinir hücreleri etkileyen Hipokampus5,6,7, iskemi duyarlı CA1 bölgesindeki CA kaynaklı beyin hasarı oluşur, 10,11,12. Ayrıca, Hipokampus (yani CA1 nöronlar), iskemik koşullarda dendritik omurga yoğunluğu kaybı mekansal hafıza bozukluğu13,14,15' te kritik bir rol oynamaktadır. CA sonra bu patolojik değişiklikler nedeniyle gibi davranış bozuklukları: anksiyete, depresyon, travma sonrası stres bozukluğu ve hafıza kaybı daha yaygın. Tıbbi teknolojisi (Yani verimli Ambulatuar Servisi) geliştirilmiş CA sağkalım oranları ile ilgili gelişmeler rağmen çoğu (dışında hipotermi) nöroprotektif tedavilerin CA16 sonra fonksiyonel sonuçları geliştirmek başarısız ,17. CA hayatta kalanlar genellikle yoksul bir yaşam kalitesine sahip ve16harcama artımlı tıp ile yatar.
Davranış testleri ile serebral iskemi için bilişsel durumu değerlendirme her iki ilaç etkinliğini belirlemek ve sonuçta başarılı bir klinik geliştirmek önemlidir. 1940'larda Edward Tolman Hipokampus tabanlı kayma bellek18çalışmaya ilk davranış deneme tasarlanmış. Daha sonra farklı labirentine (yani Morris su Labirent, Radyal Labirent, T veya Y labirent ve Barnes labirent) Hipokampal tabanlı kayma öğrenme ve bellek fareler19,20,21,22 değerlendirmek için geliştirilmiştir ,23. Daha yaygın olarak kullanılan davranış testi biri kayma öğrenme inceliyor Morris su labirent ve sıçan bellekte24modelleri. Ancak, Morris su labirent yüzmek ve tam motor işlevleri ve kontrol fare gerektirir. Asphyxial kardiyak arrest (ACA, CA'ın bir fare modeli) modeli gibi iskemi deneyler için femoral arter/damarın cannulation hayati kan basıncı, kan gazları ve çeşitli ilaçlar getirilmesi elde etmek için gereklidir. Femoral arter/damar cannulation düzgün yüzmeyi sıçan yetenek işleme bacak hareketlilik inhibe olabilir beri Morris su labirent ACA altında bilişsel bozuklukları test etmek en uygun olmayabilir.
Barnes labirent kayma öğrenme ve hafıza kemirgen modelleri incelemek için diğer yaygın olarak kullanılan davranış testidir. Barnes labirent tam motor işlevleri ve kontrol, efor gerektirmez ve böylece daha az stresli Morris su labirent daha. Geçmişte, biz Barnes labirent fonksiyonel öğrenme/bellek farklılıklar arasında meydana belirlemek için olacak kullanarak deneyler gerçekleştirilen denetim veya sham ACA kaynaklı sıçanlar karşı. Verileri Barnes labirent gerçeğini Barnes labirent başvuru (uzun vadeli) bellek25,26ölçmek için yaygın olarak kullanılan nedeniyle orta ACA için hafif takip bilişsel bozuklukları test etmek için çözünürlük yoktu için elde edilen, süre ACA kaynaklı nörobilişsel açıkları daha yakından Barnes labirent bizim ACA işlevinde bellek değerlendirmek için daha az uygun olduğunu düşündüren (kısa vadeli) bellek27,28,29,30 çalışmaya ilgili modeli.
Biz böylece değiştirilmiş bir T-maze (kısa vadeli) bellek ACA sonra çalışma değerlendirmek için spontan münavebe testi kullanılarak geliştirilmiştir. Gerçeğini değiştirilmiş T-maze does değil istemek de kadar ağır sayısal olarak önceki hayvan eğitim nedeniyle sadeliği ve diğer davranışsal testlere göre fareler üzerinde en az stres değiştirilmiş T-maze spontan münavebe testin büyük avantaj sağlıyor analiz veya alt yordamlar (yani farenin video görüntüleme) Morris su labirent ve Barnes labirent gerektirdiği gibi. İşte değiştirilmiş T-maze spontan münavebe test doğru algılamak ve kısa süreli hafıza kaybına neden hastalıklarda Hipokampal işlevin yeterli çözünürlük sunan bir basit ve henüz son derece verimli davranış deneme paradigma olduğunu göstermektedir (yani ACA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel yordamlar Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarınıza uygun olarak yapılan ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (LSU Sağlık Bilimleri Merkezi-Shreveport) tarafından erkek Sprague Dawley Rat () kullanımı için onaylanmış 300-350 g, 9-10 haftalık). Fareler gecede ACA ameliyattan önce oruç.
1. T-maze cihazları tasarımı ve ayarı
Not: Bankası Deacon ve Rawlins' 2006 model31T-maze tasarım.
- 3D SketchUp32kullanan labirent yapısını tasarlama. T-maze 3D yapısını oluşturmak için bir dış uzunluk 200 mm, 165 mm genişlik ve yüksekliğini 148 mm 3D yazıcı Yazdırma boyutları içinde uygun başlangıç kolla oluşturmak. 5.5 mm et kalınlığı ve zemin kalınlığı 8 mm kullanın.
- Labirent 3D yazıcı kullanarak yazdırmak (malzemelerin tabloya bakın)32. Laboratuvarda bir 3D yazıcı yoksa, tahta, orta yoğunluklu Sunta veya ev geliştirme mağazaları satın alınabilir bir plastik (yani Polivinil klorür), gibi diğer malzemeler kullanın.
- Yazdırma alanındaki yükseklik kısıtlamalar nedeniyle, iki ayrı 3D baskılar labirentinde duvarları inşa ve labirent derleme bir araya (yani, ikinci bir duvar yüksekliği 280 mm toplam duvar yüksekliği için 140 mm yüksekliği artırmak için labirent bölümüne eklendi). Her ayrı 3D yazdırma temel kilitleme mekanizması, nerede bir bölümden diğerine bağlı şeklinde bir "T" yer.
- Hedef silah ile başlangıç kol kavşağında, başlangıç kol genişliği bu amaca silah ile katılmak için 165 mm geniş bir bölüm oluşturun. Başlangıç kolu olarak benzer bir tasarım yöntemi kullanarak hedef silah inşa; Ancak, Deacon ve Rawlins tasarımı başına 100 mm kol genişliğini azaltın.
- Lütfen Resim 1 ayrıntılı şematik/boyutları için T-maze bakın.
- Başlangıç kol ve hedef silah tasarım içine merkezi bir bölüm içerir. Bu bölüm arka duvarından T-maze ve 200 mm hedef silah bölmek için başlangıç kol uzatmak. Bu bölüm Ayrıca labirent (şekil 1) yüksekliğini genişletilmiş.
2. asphyxial kalp durması (ACA)
- Otoklav cerrahi araçlar (121 ° C 15 dakika) önce ameliyat inisiyasyon. Cerrahi tablo 15 dk. tıraş için % 70 etanol tarafından ameliyat yerinde hayvan kılı dezenfekte. Cerrahi operasyon için yüzeyleri cilde betadin çözüm için geçerli.
- Anesthetization
- Fareler %4 isoflurane ve 30:70 karışımı ile O2 ve N2O (300 mL/dk O2 ve 700 mL/dk N2O) maskesi yoluyla anestezi.
- Vermek için mekanik havalandırma endotrakeal entübasyon fareler (entübasyon sonra fareler bir vantilatöre bağlı).
- Anestezi O2 ve N2tutam-yanıt yöntemi kullanın O. anestezi derinliği belirlemek için 30:70 karışımı ile % 2 ile % 4 isoflurane azaltarak korumak.
- Gözleri kuruluk anestezi iken altında önlemek için merhem uygulamak. Regulae vücut sıcaklığı ile sıcaklık başvuru olarak bir anal sonda ile yastık Isıtma bir kemirgen.
- Endotrakeal entübasyon
- Fareyi indüksiyon odasına koyun. O2 ve N2O. % 4 isoflurane ve 30:70 karışımı ile fareler anestezi
- Fareyi indüksiyon odasından kaldırın. Yer hayvan anestezi maskesi doğru fare suratla sırtüstü pozisyonda anestezi.
- Hafifçe sola veya sağa sol başparmak ve işaret parmağı ile hayvan doğru dilini çek.
- 14'lük esnek intravenöz kateter (49 mm uzunluğundaki) 17'lik açık sözlü ipucu pipetting iğne (93 mm uzunluğundaki 10 derece açıyla iğne ucu ile) üzerinde kayma. 17'lik açık sözlü ipucu pipetting iğne nefes borusu yerleştirin.
- 17'lik pipetting iğne Trakea üzerinden yavaşça çekin. 14-kalibre kateter hub vantilatöre bağlamak. Vantilatör inme sesi 0.67 mL/100 g ve 60 nefes/dk solunum hızını ayarlayın.
- Baş ve vücut sıcaklığı 37 ° c sıcaklık başvuru olarak anal sonda ile yastık Isıtma bir kemirgen tarafından bütün prosedür sırasında korumak.
- Femoral Arteryel ve venöz Kateterizasyon
- Kasık alanı (yalpı) yakınında saç tıraş ve betadin yüzeyler Cerrahi operasyon için cilde uygulayın.
- Fareyi sırtüstü pozisyonda yerleştirilir. Bir kesik (10 mm) inguinal bölgede Cerrahi makas ile olun.
- İnguinal ligament maruz kadar bağ dokusu tarafından kör uç forseps ayırın. Bir hemostat inguinal ligament kavramak için kullanın. Femoral arter ve ven altında inguinal ligament vardır.
- Künt ipucu forseps femoral arter ve ven maruz kadar bağ dokusu ayırmak için kullanın.
- Yavaşça femoral arter iyi ipucu Forseps ile çalışan femoral sinir ayırın. Dikkatle femoral arter ayırmak ve iyi ipucu Forseps ile bir birim olarak damar.
- İyi uç forseps femoral arter ven ayırmak için kullanın.
- 5-0 ipek sütür (bir bacak ve diğer vücut doğru doğru) damar altında 2 adet yerleştirin.
- Cesedi yakın tarafında gevşek bir düğüm. Bir hemostat tutun ve vücudun ters tarafı doğru mümkün olduğunca dikişi çekmek için kullanın.
- Bacak yakınındaki tarafında gevşek bir düğüm. Tutun ve dikiş bacak damar kan ile doldurmak izin vermek için bir hemostat ile doğru çekin.
- Mikro diseksiyon makası (45 ° açıyla) tarafından küçük bir insizyon attım ven (yaklaşık 0,1 mm) olun. Steril gazlı bez ile herhangi bir kan emmek.
- Bir künt ucu iğne şırınga (20 U/mL heparin serum dolu) bir PE-50 kateter takın. PE-50 kateter 20 U/mL heparin serum ile doldurun. PE-50 kateter bir noktası oluşturmak veya sonunda keskin için 45 ° açıyla diseksiyon makası ile kesin. Künt ipucu forseps PE-50 kateter sonuna tutmak için kullanın. Yavaşça PE-50 kateter femoral ven yerleştirin.
- Kateter tam olarak eklendikten sonra yavaş yavaş sızıntı yok olması için heparin/serum 0.1 mL yönetmek. PE-50 kateter stabilize etmek sağlam dikiş knot (tek-düğüm) kravat. PE-50 kateter çeşitli ilaçların sürekli intravenöz (IV) enjeksiyon için tutun.
- 1 mL şırınga ile 23 bağlı Kullanım fare prosedürü boyunca hareketsiz femoral ven yoluyla radarı saplama bağdaştırıcı vecuronium bromür (0.67 mg/kg, her 10 min yönetilen) yönetmek için ölçmek.
- 5-0 ipek sütür (bir bacak ve diğer vücut doğru doğru) arter altında 2 adet yerleştirin.
- Bacak yakınındaki tarafında gevşek bir düğüm. Bir hemostat tutun ve bacak doğru mümkün olduğunca dikişi çekmek için kullanın.
- Cesedi yakın tarafında gevşek bir düğüm. Tutun ve dikiş beden arter kan ile doldurmak izin vermek için bir hemostat üzerinden doğru çekin.
- Mikro diseksiyon makası (45 ° açıyla) tarafından küçük bir insizyon attım arter (yaklaşık 0,1 mm) olun.
- Bir künt ucu iğne şırınga (20 U/mL heparin serum dolu) bir PE-50 kateter takın. PE-50 kateter 20 U/mL heparin serum ile doldurun. PE-50 kateter bir nokta veya keskin amaca oluşturmak için bir 45 derecelik açıyla diseksiyon makası ile kesin. Künt ipucu forseps PE-50 kateter sonuna tutmak için kullanın. Künt ipucu forseps PE-50 kateter sonuna tutmak için kullanın. Yavaşça PE-50 kateter femoral arter yerleştirin.
- Kateter tam olarak eklendikten sonra yavaş yavaş şırınga o kateter işlevsel olduğundan emin olmak için geri çek. PE-50 kateter stabilize etmek sağlam dikiş knot (tek-düğüm) kravat. PE-50 kateter atardamar basıncı ve kan gazları sürekli kayıt için tutun.
- Asphyxial kardiyak Arrest (ACA) yordamı
- Fizyolojik parametreler (yani pO2, pCO2, kan basıncı ve pH değeri) inme güç, O2 ya da N2O düzeyleri oransal tarafından gerektiği gibi ayarlayın. Bu parametreler normal fizyolojik aralıklarını kullanın: pO2: 100 mmHg, pCO2: 35-40 mmHg, kan basıncı: 100 mmHg ve pH: 7,4.
- Vecuronium bromür (0.67 mg/kg, damardan) femoral ven yoluyla yönetmek ve beklemek için 2 dk. 23 ölçüm radarı saplama adaptörü ile bağlı bir 1 mL şırınga, kan basıncı olduğundan emin olun kullanmak veya ACA gerçekleştirmeden önce yaklaşık 100 mmHg.
- Apne (6 dk) vantilatör endotrakeal tüp (14-kalibre kateter hub) keserek neden. Diğer endotrakeal tüp tam apne sağlamak için 1 mL şırınga tarafından engellemek.
Not: 6-min boğulma zamanı vantilatör kopukluk ve resüsitasyon başlangıcı arasındaki dönemi olarak tanımlanır. Tam kardiyak arrest 10 mmHg düşük bir ortalama arteriyel basınç olarak tanımlanır. - Son dk apnesi sırasında 80 nefes/dk solunum, solunum hızı ayarlayın ve %0 N2O. O2 2 L/dk artırmak Bu eylem herhangi bir kalan isoflurane veya N2O havalandırma içinde kalan dışarı darbe olacak.
- Apne, takip min 1 mL şırınga endotrakeal tüp sizden kaldırın. Endotrakeal tüp havalandırma için yeniden bağlanın.
- 1 mL şırınga bağlı bir 23 ile kullanım ölçmek radarı saplama adaptör epinefrin (0.005 mg/kg, damardan) femoral ven yoluyla yönetmek ve Manuel Göğüs sıkıştırma başparmak, dizin ve orta parmak hafif dairesel bir hareketle x hayvanın göğsünde yönetmek ve z-ekseni (200/dak) spontan dolaşım (ortalama arteriyel basınç ≥ 50 mmHg)33,34,35dönüşü kadar.
- Başka bir 1 mL şırınga bağlı bir 23 ile kullanım ölçmek radarı saplama bağdaştırıcısı hemen sonra kendiliğinden dolaşım dönüş yolu ile femoral ven sodyum bikarbonat (1 meq/kg, damardan) yönetmek için (50 mmHg veya daha yüksek)33,34, Solunum asidozu hafifletmek için, 35 .
- Ölçü kan tekrar 10 dk sonra asit-baz durumu (ACA yaklaşık 7,35-7,40 olmalıdır sonra pH) belirlemek için canlandırma gazları.
- Bir hemostat femoral arter ve ven kelepçe için kullanın. Yavaş ve nazikçe Arteryel ve Venöz Kateterler künt ipucu forseps kullanarak kaldırın. Femoral arter/damar kanama önlemek için bir 5-0 ipek sütür ile ligate. 3-0 ipek dikiş kullanarak cerrahi sitesi örten cilt kapatın. Kesintiye uğramış dikiş tekniği yara yeniden açma şansını en aza indirmek için kullanın.
- Fareyi kendisi (genellikle 30 dk 60 dk sonra canlandırma) nefes kadar bekleyin, fareyi vantilatör bağlantısını kesin ve Endotrakeal tüpü yavaşça çıkarın.
- Yer fare bebek kuluçka (27 ° C, % 50 nem) bir gecede. Gecede bebek kuluçka makinesi su ve yumuşatılmış gıda (suda ıslatarak yapılmış) yerleştirin.
- Fare bireysel kafes aktarım ve sıçan hayvan tesis düzenli yemek ve su ile geri dönün. T-Maze testleri 3 gün sonra ACA başlatın.
3. T-maze
-
Hayvan hazırlık
- Cerrahi (sahte veya ACA), önceki gün 5 min için her fare başa. Hiç sıçan onların kafes (480 mm x 250 mm x 200 mm, plastik şeffaf kafes) üzerinden ne zaman yükseltmek işleme (Şekil 2).
- Fareyi taşıma sonra yavaşça fare kuyruğunu diğer el destekleyen tek elle tarafından almak onun ' bacaklar. Onları elinden kafes (100 mm yükseklik) 5 kez atlamak izin. Öylesine onlar gıda ve/veya kavga durulurken değil her fare bireysel kafesler ayırın.
- Üç gün sonra sahte veya ACA cerrahi (Resim 2), sessiz ve karanlık bir odaya ilk çalıştırma başlangıcından önce fareler kafesi ile aktarın. Sadece bir düşük güç masa lambası açmak ve minimum aydınlatma korumak için test odanın köşesinde yerleştirin. Karanlık 10 min için uyum sağlamak fare izin.
- Tüm deneyler diurnal varyasyon rats performansı üzerinde herhangi bir etkileri önlemek için öğleden sonra gerçekleştirin. Işleç hangi fare alınan sahte veya ACA ameliyat tavsiye yok.
-
Spontan münavebe
- (~ 10 mm kalınlığında) labirent tüm katı kapsayacak şekilde yatak takımları, ince bir tabaka yayılır. Fareyi, her başlangıç noktası başlangıç kol ("T" alt), çalıştırın ve izin vermek o zaman yer fare sağ veya sol hedef kol keşfetmek için 3 dak.
- Fare (farenin tüm dört paws hedef kol girmiş) bir belirli hedef kol tamamlandıktan sonra Başlat kol ve karşıt hedef kol (fareyi karşı hedef kol girmesini önlemek için,şekil 1) arasında "T" kavşak engelleyin. Farenin labirentte 30 saniye için bırakın sonra fareyi almak ve en az süre (~ 30 saniye) onun kafes geri yerleştirin. "T" birleşim kaldırmak engellemek (125 mm X 230 mm X 65 mm 3D yazıcı tarafından yapılan,) T-maze.
- Fare başlangıç kolunuzu yerleştirin ve 3.2.2 yineleyin. Münavebe olarak tanımlanır: fare ile karşılaştırıldığında önceki36çalıştırmak ters kol girdiği zaman. Günde 4 çalıştırır aşağıdaki gibi yapın fareler var:
1st çalıştırmak
2nd Çalıştır
10 dk mola
3rd Çalıştır
4th çalıştırmak - 10 dk mola sırasında ve koku önyargı ortadan kaldırmak için hayvanlar arasında yatak takımları değiştirmek. T-maze distile su ile deneysel her günün sonunda takip % 75 etanol ile temizleyin.
- 3.2.1 adımları yineleyin. -3.2.4. iki gün için (Toplam 12 skor) olduğu gibi Şekil 2.
-
Değişim oranı ve yan tercih oranı hesaplamalarını
- Münavebe % ve % yan tercih, hesaplamak nerede
L: fareler sol kol seçin
R: fareler sağ kol seçin
Düzeltmek seçim: koşmak 2nd (her kümesi içeren iki çalışır) bir verilen küme 1st farklıdır
Yanlış seçim: fareler aynı kol önceki run benzer seçin
Örnek:
1. gün: L L / L L
2. gün: L L / L R
3. gün: R L / L L
Münavebe: 2 (doğru seçenek) /6 (gerçekleştirilen toplam kümeleri) * 100 = % 33.33
Taraf tercihi: 10 (L, tercih edilen yan) /12 (gerçekleştirilen toplam çalışır) * 100 = %83.33
- Münavebe % ve % yan tercih, hesaplamak nerede
-
Ameliyat sonrası bakım:
- Vermek buprenorfin (0.01 mg/kg IP) ameliyat sonrası 2 gün boyunca her 12 h sıçanlar. Fareler için en fazla 1 saat sonra kalp krizi gözlemlemek.
- Sternal recumbency korumak için yeterli kendine geldi kadar fareler havalandırma ve Isıtma yastığını ekleyin. Ameliyattan sonra hayvanların vücut ısısını korumak için fareyi bir bebek kuluçka (27 ° C, % 50 nem ayarla) yerleştirin.
- Yumuşatılmış chow (suda ıslatarak yapılmış) hayvanlar için ameliyat sonrası ilk 24 saat sağlar. Fareler içme suyu olmasaydı, bakteriyostatik salin yönetmek (100 mL/kg/gün, IP) hayvan kurtarır ve içme suyu serbestçe kadar.
- Fareler topikal antibiyotik ağrı kesici (ilaç ve lidokain merhem) ile tüm yaraları ver. Onlar tamamen iyileştikten sonra sıçan hayvan tesise geri taşıyın.
-
Ötenazi yöntemi
- %5 isoflurane ve %100 N2O deney sonunda hayvanlar ötenazi için kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ACA (küresel serebral iskemi) esas olarak (kısa vadeli) bellek açıkları28,29çalışma neden olur. Öğrenme ve hafıza fonksiyonu ACA sonra değerlendirmek için biz değiştirilmiş spontan münavebe testi (kısa vadeli) bellek30çalışma değerlendirmek için kullanılan. Spontan münavebe test sonuçlarından ACA grubunda (%26.19 ± 4,96) üç gün üst üste gelen değişim oranı (62.96 ± %6,07) kontrol grubu ile karşılaştırıldığında daha düşük olduğuna dair (* p0.05) 35 fareler ACA için gönderilmiş bir yan önyargı kontrolü ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş olması nedeniyle (%4,57 82.14 ± 62.89 ± %2,86, v. * p0.05) böylece daha düşük kendiliğinden değişim oranı ile sunulan (şekil 3a ve 3b)35,. Sonuç olarak tek yönlü ANOVA Türkiye nin post-hoc testi37tarafından takip kullanılarak S.E.M. veri analiz ± anlamına gelir ifade edildi. p < 0,05 (% 95 güven düzeyi) istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Şekil 1. T-maze tasarım.
T şeklinde platformu labirentin sonuna (Rat için) 600 x 165 mm başlangıç kol ve 400 mm x 100 mm hedef arms "T", üst tepe adlı ile inşa edilmiştir. Duvar kalınlığı 5.5 mm x 8 mm (zemin kalınlığı) yapıldı. Başlangıç kolu hedef kolu kavşağında nerede bu bölümü T-maze ve 100 mm arka duvarından hedef silah bölme başlangıç kol genişletilmiş merkezi bir bölüm yapıldı. Noktalı kareler kolunu bloke "T" kavşak blok konumunu temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Deneysel zaman çizelgesi ACA/sahte cerrahisi ve T-maze.
ACA ameliyat gün önce fareler fare insan Touch parkenizin için 4 kez (5 dk/her gün 0 zaman,) ele. ACA ameliyattan sonra fareler iyileşmek ve aşağıdaki 3 gün içinde stabilize etmek üzere izin verilmiştir. Sonra kurtarma, fareler 3 gün üst üste için (12 Skor, 4 çalıştırır/gün) spontan münavebe testleri yapılır. Her fare günde 4 çalıştırır gerçekleştirir. Deneysel zaman çizelgesi sham ameliyat için aynıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Kısa süreli bellek açıkları ACA sonra.
ACA (a) maruz Sıçanlarda yan tercih oranı artış görülebilir. Spontan değişim oranı ACA fareler denetim (b) ile karşılaştırıldığında azalma. Ayraç grubu kullanılan hayvan gösterir. Sonuçları ifade aracı olarak ± S.E.M. * P < 0,05 denetiminden farklı gösterir. İstatistiksel analiz tarafından tek yönlü ANOVA Tukey'nın öğleden hoc testi ile incelendi. Bu rakam üzerinden Lee ve ark., 201735değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deacon ve Rawlins protokolü31ile karşılaştırıldığında da çalışmanın içinde değişiklikler yapıldı. 3D yazıcı T-maze oluşturmak için kullanılan. 3D baskı ticari T-maze uygun fiyatlı ve düşük maliyetli alternatifler sağlar. Test sırasında rats anksiyete azaltmak için minimum aydınlatma ile karanlık odada T-maze gerçekleştirildi. Bir kez fareyi hedef silah biri girdi, biz yavaşça karşı kol engelledi. Bu test yanı sıra olası hasar mümkün stresten rats kuyruğuna Giyotin kapı düşürürken önler. Herhangi bir gereksiz stres sıçan performans sonraki çalıştırıldığında yapılmasını engeller. Böylece, bir "T" kavşak blok plastik Giyotin kapı test sırasında kayan bileme gürültü ortadan kaldırmak için mevcut çalışmada kapısı olarak kullanılmaktadır. Bu adımı rats anksiyete T-maze deneme sırasında önemli ölçüde azaltabilir.
Endişeli fareler labirentte çalıştırmak için motive değil çünkü habituation başarılı T-maze çalışmalar için kritik bir adımdır. Böylece, bu fareler insan sıcaklığı, yükseklik ve labirent deneyler önce kafes hareketli parkenizin sağlamak için zorunludur. Endişeli fareler gıcırdıyor veya işleçleri onlara dokunmak çalıştığınızda ses tıslama olun. Ayrıca, endişeli fareler de uzun dondurucu yanıt veya labirentinde sırasında tüm çalıştırmak için çöp ile mevcut T-maze deneyleri. Onlar genellikle çoğu zaman başlangıç kolundan labirent keşfetmek olmadan harcama. Fareler labirentte çalıştırmazsanız, kuyruğunu hafifçe dokun ve onlar-ecek koşmak. Diğer olası fareler yetersiz habituation alınan nedenidir. Yavaşça fare geri koyarlar ve onların anksiyete azaltmak 10 dakika bekleyin. Fareyi Çalıştır tamamlamak başarısız olursa, o sıçan çalışma söz konusu değildir. Fareler 3 dk. tek bir vadede tamamlayamazsanız, onun kafes için koyun ve 10 min için bekleyin. Fareyi yine çalıştır tamamlamak başarısız olursa, sıçan çalışma tutulmalıdır. Fareler içerik bir uzun süre veya Frekans testi gerçekleştirmek veya test oda için bir saatten fazla kalmak gerekir, aksi halde onlar yenilik eksikliği nedeniyle çalışmayı durdurur.
Önceki çalışmalar fareler % 70'i sol veya sağ önyargı38,39sergi göstermiştir. Yanal bu önyargı sıçan39' T-maze performans kötüleşir. Böylece, bu da çalışmanın fareler için içerme ve dışlama ölçütleri belirtilen. Bizim T-maze çalışmada toplam 15 sıçan alınan ACA cerrahinin test ettik. Ortalama münavebe ACA tedavi Sıçanlarda 29 ± % 4 oranıdır. Denetim veya sham fareler Hipokampal herhangi bir yaralanma ya da öğrenme/bellek açıkları var mı, denetleyen onaylanmadığına karar veya sahte fareler ACA tedavi hayvanlar ile karşılaştırıldığında daha iyi T-maze performans (değişim oranı ≥ 29 ± %4) olmalıdır. Bu nedenle, fareler yan tercih var ya da labirent öğrenmek başarısız öneren denetim veya sham farelerle değişim oranı % < 29 (münavebe ≤ 1 toplam sayısı), çalışma dışlanmaları gerekir. 25 kontrol fareler için bu dışlama kriterleri uyguladınız. 6 tanesi (% 24) yüksek yan tercih oranı (%85 ± 3) ve düşük kendiliğinden değişim oranı (% 29'ten düşük) ile gerçekleştirilen çalışmalardan dışlandı.
T-maze spontan münavebe deney fareleri doğal eğilim üzerinde yenilik keşfetmek için son derece bağlıdır. Böylece, büyük T-maze spontan değişim Protokolü labirentinde çalıştırmak fare sonunda sona erecek kısıtlamasıdır. Bizim geçmiş deneyimlerine dayanarak, fareyi sadece labirentinde üç gün üst üste çalıştırmak istekli olduğunu. Asphyxial kardiyak arrest esas olarak kısa vadeli bellek açıkları sonuçları beri biz şu anki bulgularımız diğer beyin yaralanması/da ilişkili hastalıklar (örneğin Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve Geçici iskemik atak) parçası olan tahmin edebilir kısa-bellek açıkları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Ulusal kurumları, sağlık/Ulusal Enstitüsü, nörolojik bozukluklar tarafından desteklenen ve kontur vermek 1R01NS096225-01A1, Amerikan Kalp Derneği verir AHA-13SDG1395001413, AHA-17GRNT33660336, AHA-17POST33660174, Louisiana State Üniversitesi hibe yardım Araştırma Konseyi, Malcolm Feist kardiyovasküler araştırma bursu ve Evelyn F. McKnight beyin Enstitüsü içinde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | MakerBot | Replicator | Fifth generation |
| 3D Printer Filament | Hatchbox | PLA, 1.75 mm filament diameter | |
| 200 Proof Pure Ethanol | Koptec | V1005SG | |
| Sani-Chips | PJ Murphy-Forest Products | Size: 8 to 20 mesh; 2.2 cubic foot/package; autoclavable bags | |
| Rat | Charles River Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Vecuronium bromide | Sun Pharmaceutical | 47335-931-40 | 10 mg |
| Epinephrine | Par Pharmaceutical | 42023-103-01 | Adrenalin Chloride Solution 1 mg/mL, 1:1000 |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection | Pfizer | 00409-2012-32 | 0.3mg/mL |
| SketchUp | Trimble Inc. | 3D modeling software | |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | Animals raging in size from mouse to guinea pig (10g to 1kg) |
| PowerLab 8/35 | Adinstruments | PL3508 | 8 analog input channels – 4 of which can be used in differential mode. |
| Bio Amps | Adinstruments | FE132 | The Bio Amp is a galvanically isolated, high-performance differential bio amplifier optimized for the measurement of a wide variety of biological signals such as ECG, EMG and EEG recordings. |
| Quad Bridge Amp | Adinstruments | FE224 | A four-channel, non-isolated bridge amplifier designed to allow the PowerLab to connect to most DC bridge transducers. |
| LabChart 8 | Adinstruments | ||
| ABL80 FLEX CO-OX blood gas analyzer | Radiometer | pH / p CO2 / p O2 | |
| SURFLO Teflon I.V. Catheter | Terumo | sc-361556 | Only use the flexible thin wall catheter (49-mm long) |
| Pipet/Infusion Needle | Hamilton | 7748-03 | 17-gauge; 93-mm long; 10-degree angle |
| Classic T3 Vaporizer | SurgiVet | VCT302 | Classic T3 Isoflurane Funnel Fill |
| ENVIRO-PURE Charcoal Canister | SurgiVet | 32373B10 | Designed to absorb waste anesthetic gas |
| O2 single flowmeter | SurgiVet | 32375B1 | 0-1000 mL |
| N2O Flowmeter | VetEquip | 401721 | 0-4LPM |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter (Sterile) | Becton Dickinson | 427565 | 23 gauge |
| Micro Forceps | Black and Black surgical | B3FRC-18 RM-8 | 7 1/4" (18 cm), 8mm RH, counterweight w/ guide pin 2mm, platform 6 x .3 mm, curved. |
| Halstead Mosquito Forceps | Roboz | RS-7111 | Curved; 5" Length, 1.3 mm tip diameter, 2.1 mm jaw width |
| Mixter Forceps | Roboz | RS-7291 | 5.25" Curved Extra Delicate, 1.1 mm tips |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | Straight, Sharp Points; 9 mm Cutting Edge; 0.15 mm Tip Width; 3 1/2" Overall Length |
| Mayo-Stille Scissors | Roboz | RS-6891 | 5.5" Round Curved |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | 45 Deg Dumoxel Tip Size .10 x .06 mm |
| Olsen-Hegar Combination Scissor And Needle Holder | Roboz | RS-7884 | Cross Serration Tip; 5.5" Length |
| Moloney Forceps | Roboz | RS-8254 | Serrated; Slight Curve; 4.5" Length |
References
- Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133, e38-e360 (2016).
- Beuret, P., et al. Cardiac arrest: prognostic factors and outcome at one year. Resuscitation. 25, 171-179 (1993).
- Kim, Y. J., et al. Long-term neurological outcomes in patients after out-of-hospital cardiac arrest. Resuscitation. 101, 1-5 (2016).
- Earnest, M. P., Yarnell, P. R., Merrill, S. L., Knapp, G. L. Long-term survival and neurologic status after resuscitation from out-of-hospital cardiac arrest. Neurology. 30, 1298-1302 (1980).
- Cerchiari, E. L., Safar, P., Klein, E., Cantadore, R., Pinsky, M. Cardiovascular function and neurologic outcome after cardiac arrest in dogs. The cardiovascular post-resuscitation syndrome. Resuscitation. 25, 9-33 (1993).
- Petito, C. K., Feldmann, E., Pulsinelli, W. A., Plum, F. Delayed hippocampal damage in humans following cardiorespiratory arrest. Neurology. 37, 1281-1286 (1987).
- Schmidt-Kastner, R., Freund, T. F.
- Corkin, S. What's new with the amnesic patient H.M.? Nat Rev Neurosci. 3, 153-160 (2002).
- Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. 1957. J Neuropsychiatry Clin Neurosci. 12, 103-113 (2000).
- Smith, T. D., Calhoun, M. E., Rapp, P. R. Circuit and morphological specificity of synaptic change in the aged hippocampal formation. Neurobiol Aging. 20, 357-358 (1999).
- Gage, F. H., Dunnett, S. B., Bjorklund, A. Spatial learning and motor deficits in aged rats. Neurobiol Aging. 5, 43-48 (1984).
- Tulving, E., Markowitsch, H. J. Episodic and declarative memory: role of the hippocampus. Hippocampus. 8, 198-204 (1998).
- Neigh, G. N., et al. Cardiac arrest with cardiopulmonary resuscitation reduces dendritic spine density in CA1 pyramidal cells and selectively alters acquisition of spatial memory. Eur J Neurosci. 20, 1865-1872 (2004).
- Volpe, B. T., Davis, H. P., Towle, A., Dunlap, W. P. Loss of hippocampal CA1 pyramidal neurons correlates with memory impairment in rats with ischemic or neurotoxin lesions. Behav Neurosci. 106, 457-464 (1992).
- Astur, R. S., Taylor, L. B., Mamelak, A. N., Philpott, L., Sutherland, R. J. Humans with hippocampus damage display severe spatial memory impairments in a virtual Morris water task. Behav Brain Res. 132, 77-84 (2002).
- Lee, R. H., et al. Fatty acid methyl esters as a potential therapy against cerebral ischemia. OCL. 23, D108 (2016).
- Lee, R. H., et al. Chapter 1. Palmitic acid: occurrence, biochemistry and health effects. Porto, L. F. , Nova Science Publishers, Inc. 1-15 (2014).
- Tolman, E. C., Gleitman, H. Studies in spatial learning; place and response learning under different degrees of motivation. J Exp Psychol. 39, 653-659 (1949).
- Koopmans, G., Blokland, A., van Nieuwenhuijzen, P., Prickaerts, J. Assessment of spatial learning abilities of mice in a new circular maze. Physiol Behav. 79, 683-693 (2003).
- Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J Comp Psychol. 93, 74-104 (1979).
- Paul, C. M., Magda, G., Abel, S. Spatial memory: Theoretical basis and comparative review on experimental methods in rodents. Behav Brain Res. 203, 151-164 (2009).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. ILAR J. 55, 310-332 (2014).
- Sharma, S., Rakoczy, S., Brown-Borg, H.
- Poon, T. P., et al. Spinal cord toxoplasma lesion in AIDS: MR findings. J Comput Assist Tomogr. 16, 817-819 (1992).
- Sunyer, B., Patil, S., Höger, H., Lubec, G. Barnes maze, a useful task to assess spatial reference memory in the mice. Nat Protoc. 390, (2007).
- Shoji, H., Hagihara, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. T-maze forced alternation and left-right discrimination tasks for assessing working and reference memory in mice. J Vis Exp. , (2012).
- Seeger, T., et al. M2 muscarinic acetylcholine receptor knock-out mice show deficits in behavioral flexibility, working memory, and hippocampal plasticity. J Neurosci. 24, 10117-10127 (2004).
- Olton, D. S., Feustle, W. A. Hippocampal function required for nonspatial working memory. Exp Brain Res. 41, 380-389 (1981).
- Hayashida, K., et al. Hydrogen inhalation during normoxic resuscitation improves neurological outcome in a rat model of cardiac arrest independently of targeted temperature management. Circulation. 130, 2173-2180 (2014).
- Spontaneous alternation behavior. Dember, W. N., Richman, C. L. , (1989).
- Deacon, R. M., Rawlins, J. N. T-maze alternation in the rodent. Nature protocols. 1, 7-12 (2006).
- Wong, K. V., Hernandez, A. A review of additive manufacturing. ISRN Mechanical Engineering. 2012, (2012).
- Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171, 566-576 (2010).
- Lin, H. W., et al. Fatty acid methyl esters and Solutol HS 15 confer neuroprotection after focal and global cerebral ischemia. Transl Stroke Res. 5, 109-117 (2014).
- Lee, R. H., et al. Interruption of perivascular sympathetic nerves of cerebral arteries offers neuroprotection against ischemia. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 312, H182-H188 (2017).
- Bali, Z. K., et al. Differential effects of alpha7 nicotinic receptor agonist PHA-543613 on spatial memory performance of rats in two distinct pharmacological dementia models. Behav Brain Res. 278, 404-410 (2015).
- McDonald, J. H. Handbook of biological statistics. 2, Sparky House Publishing. Baltimore, MD. (2009).
- Castellano, M. A., Diaz-Palarea, M. D., Rodriguez, M., Barroso, J. Lateralization in male rats and dopaminergic system: evidence of right-side population bias. Physiol Behav. 40, 607-612 (1987).
- Andrade, C., Alwarshetty, M., Sudha, S., Suresh Chandra, J. Effect of innate direction bias on T-maze learning in rats: implications for research. J Neurosci Methods. 110, 31-35 (2001).
