Vi beskriver her stenose i de underlegne vena cava som murine modell av dyp venetrombose. Denne modellen viser blod flyte begrensning, en av de største utløserne av venous tromboser hos mennesker.
Dyp vene-trombose (DVT) og dens ødeleggende komplikasjoner, lunge embolism, er et alvorlig helseproblem med høy dødelighet. Mekanismer for dannelse i årer forblir uklar. Mangel på mobilitet (f.eksetter kirurgi eller langdistanseflygninger) er en av de viktigste faktorene som fører til DVT. Patofysiologiske konsekvensen av mangel på mobilitet er blodet flyt stagnasjon i venøs ventiler. Her, er en modell beskrevet som etterligner slik flyt forstyrrelser som en blodpropp-kjøring faktor. I denne modellen opprettes delvis flyt begrensning (stenose) i den underlegne vena cava (IVC). Nedleggelsen av ca 90% av IVC lumen for 48t resulterer i utviklingen av thrombi strukturelt ligner de i mennesker. Likhetene er: i) de fleste av blodpropp volumet er rød, dvs. består av røde blodlegemer og fibrin, ii) tilstedeværelsen av en hvit del (linjer av Zahn), iii) ikke-blottet endotelial monolayer, iv) opphøyet plasma D-Dimer nivåer og v) muligheten til å forhindre blodpropp av lav molekylvekt heparin. Begrensninger omfatter variabel størrelse thrombi og faktum at en viss prosentandel av vill-type mus (0 – 35%) kan ikke produsere en blodpropp. Visuell observasjon og måling, kan thrombi visualiseres ikke-invasive teknologier, for eksempel ultrasonography, som tillater overvåking dynamikken i blodpropp utvikling. På kortere tid poeng (1-6 h), intravital mikroskopi kan brukes til å direkte observere hendelser (f.eks, rekruttering av celler til fartøyet veggen) foregående dannelse. Bruk av denne metoden av flere team verden har gjort det mulig å avdekke grunnleggende mekanismer av DVT og identifisere potensielle mål som kan være gunstig for det forebyggende arbeidet.
Dyp vene-trombose (DVT) er utvikling av thrombi i dype vener, vanligvis (men ikke bare) i bena. I konjunksjoner med lunge embolism (PE; utpekt sammen som venøse Thromboembolism, VTE) det utvikler i ca 900 000 amerikanere årlig og representerer en alvorlige helsemessige problemet og økonomisk problem1,2. PE, en komplikasjon av DVT, oppstår når en blodpropp blir løsrevet fra sin opprinnelige plassering og når lungene, som kan forårsake luftveissykdommer insuffisiens og død. Dødstallene fra VTE overskrider dødeligheten av AIDS, bryst kreft og trafikk ulykker, kombinert3.
Hovedfaktoren forårsaker DVT dessuten er kjent grunner, for eksempel kreft eller traumer, mangelen på mobilitet 4,5. Dette kan skyldes kirurgi (spesielt Ortopedisk), lammelser, langdistanseflygninger eller andre grunner. Blodstrøm i venene avhenger muskel pumpen og derfor lem immobilisering resultater i stagnerende blod flyte i venøs ventiler, som fører til blodpropp. Formålet med metoden beskrevet heri skal recapitulate slike blod flyte forvrengning6,7. Delvis flyt begrensning i dårligere vena cava (IVC) etterligner tilstander opprettet i menneskelig venøs ventiler og resultater i dannelsen av en blodpropp ligner i struktur til menneskelig thrombi6. Store deler av en blodpropp er rød og består av røde blodlegemer, fibrin og innlemmelse av blodplater. Thrombi har en liten “hvit del” beriket i blodplater (figur 1), som ligner “linjer av Zahn” beskrevet i menneskelig venøse thrombi. Begge deler av embolus inneholder også nøytrofile8, som er blant de første cellene å bli rekruttert på stedet av fremtidige blodpropp6,9. Nøytrofile i den røde delen utvise nøytrofile ekstracellulære feller (nett), mens nøytrofile i den hvite delen synes å være blottet for garn8. Tilsvarende til menneskelig DVT, er blodpropp i mus ledsaget av opphøyet plasma D-dimer nivåer (figur 2). Lav molekylvekt heparin (enoxaparin), brukes for DVT profylakse hos pasienter, forhindrer også blodpropp i mus. En viktig fordel med denne metoden er fravær av endotelial denudation9, som er karakteristisk for menneskelig DVT10. Denne funksjonen gjør IVC stenose en mer klinisk relevante modell av DVT enn for eksempel induksjon av tromboser av ferric chloride, som induserer endotelial denudation og der thrombi består hovedsakelig av blodplater11, 12,13. En modell av komplett stasis i IVCEN foretrekkes av flere lag14,15,16. I motsetning til stenose, der gjenværende flyt opprettholdes i fartøyet, anvendelse av stasis stopper helt flyten, og dermed begrenser tilgjengelighet av systemisk administrert stoffer til blodpropp området. Også det synes at mekanismene bak trombose indusert av stenose og stasis er forskjellige: stenose resulterer i utviklingen av lokal betennelse (aktivisering endotelet, utgivelsen av Weibel-Palade kroppen innhold, rekruttering av immunceller og blodplater til fartøyet veggen) forårsaker “immunothrombosis”6,9,17, mens stasis synes å indusere heller trombose basert, spesielt på vev faktor og andre koagulering og fibrinolyse-relaterte mekanismer18,19,20. Dermed reflektere stenose og stasis modellene litt forskjellige aspekter av venøs blodpropp utvikling, selv om deres mekanismer kan sikkert overlappe. Elektrolytisk IVC modell (EIM) DVT21,22 induserer en blodpropp bare delvis skjule fartøyet veggen. Derfor er det praktisk for testing av systemisk administrasjon av ulike på blodpropp vekst. Denne modellen, men antar avbrudd IVC veggen integritet (innsetting av en nål) og induksjon av tromboser av elektrisk strøm gjør patofysiologiske relevansen av denne mekanismen minst diskutabel.
Her presenteres protokollen IVC stenose, som etterligner blodet flyt forvrengning, en stor utløsende faktor for DVT. Stenose til IVCEN induserer utviklingen av thrombi i 65-100% av C57BL/6 mus innen 48 timer og 25-50% av mus innen 2-6 h6,8,23 (Brill A, upublisert data, 2016). En stor begrensning av metoden er variasjon i blodpropp størrelse24 (Figur 4), som er observert etter både kortsiktige (6 h) og langsiktig (48 h) IVC stenose. Årsakene til slike variasjoner (gitt at samme betingelser, for eksempel mellomlegget, anestesi etc., brukes) forblir obskure, men man kan spekulere at anatomiske variasjoner mellom mus (f.eks bredden på IVC, antall og plassering av både side- og rygg grener) ligger dette fenomenet. Variasjon i blodpropp størrelse gjør trombose prevalens (prosent av mus med en blodpropp) viktigste utfallet. Blodpropp prevalens kan sammenlignes med beredskapsplaner bord og den Fisher eksakt test. Ett av forsøkene var et unntak når redusert blodpropp størrelse med samme trombose utbredelsen etter injeksjon av podoplanin-hemmende antistoffer ble observert 7.
Denne metoden er spesielt nyttig når venetrombose innvielse er studert. Det tillater undersøker tidlig hendelser i fartøyet veggen, for eksempel rekruttering av celler, til slutt fører til blodpropp. Pro – eller anti – thrombotic effekter av narkotika kan evalueres ved hjelp av denne modellen trombose utbredelse som en primær avlesning. Stenose 48 h gjelder å avsløre en anti-trombotiske fenotype, mens 6t stenose kan brukes hvis en prothrombotic fenotypen forventes. Histologiske analyse av blodpropp og IVC ringmuren kan også utføres.
Spørsmålet om siden grener skal samskrevet eller venstre patent forblir åpen. En gruppe har vist at ligation av sidegreiner øker ikke blodpropp størrelsen og plasseringen av en side gren nærmere enn 1,5 mm til IVC ligation området dramatisk Hemmer blodpropp utvikling25. Nedleggelsen av sidegreiner kan indusere endothelial skade i dem og også øke kirurgi26. I våre hender reduserer mangel på siden gren nedleggelse betydelig trombose prevalens (ned 10-30% etter 48t stenose; Brill, upublisert) og derfor vi ligate alle synlige siden grener.
Littermate kontroller bør ideelt sett brukes som mus, selv på samme bakgrunnen, men fra ulike kilder, kan ha litt annerledes trombose utbredelse. Hvis effekten av DVT seg på parametere (for eksempel biokjemiske) er undersøkt, bør humbug-opererte dyr brukes. Humbug-opererte mus gjennomgå samme fremgangsmåte, men ligatur rundt IVCEN lukkes løst og igjen der uten å produsere stenose.
Den vanligste feilen (et avgjørende skritt) i denne protokollen er et forsøk på å skille aorta og IVC ikke nettopp på vinkelen mellom fartøyene men litt lavere, som vanligvis resulterer i blødninger. Når en massiv blødning oppstår, god utvinning av musen blir usannsynlig og det anbefales å stoppe eksperimentet og euthanize dyret. Normalt mus gjenopprette godt, flytte innenfor byrået og mister ikke betydelig vekt. Vi anbefaler at du bruker mus over 20 g for både menn og kvinner og holde dyr (spesielt hanndyr) i individuelle bur etter operasjonen til slutten av å unngå kamper og skade. Det har blitt rapportert i en annen (elektrolytisk) modell av DVT at mannlige mus produsere større thrombi enn kvinner27. Analyse av våre data avslørt ikke betydelig forskjell i utbredelsen av tromboser mellom mannlige og kvinnelige mus (Brill, upublisert). Derfor er forskere oppfordres til å utføre eksperimenter med IVC stenose modellen på mus av begge kjønn.
Rakne suturer og/eller stifter kan ikke utelukkes spesielt i lang eksperimenter (uka og lengre). Dermed mus bør kontrolleres minst to ganger om dagen for Sutur integritet og en spesiell oppmerksomhet bør gis til visningen av blod spor på buret bedding.
Det bør bemerkes at som alle andre dyr modell, stenose til IVCEN har sine begrensninger når det gjelder oversettelse til mennesker. Murine IVCer har for eksempel ikke ventiler, mens menneskelige DVT utvikler inne venøs ventiler. Mennesker har også loddrett spinal retning med muskel pumpen er en viktig mekanisme akselererende blodstrøm i venene. Mus har derimot vannrett spinal orientering med ingen rolle av muskel pumpen støtte blodet tilbake til hjertet. Disse begrensningene bør vurderes når oversette musen data til menneskelig sykdom.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av British Heart Foundation (PG/13/60/30406) og University of Birmingham.
C57BL/6 mice | Charles River | 8 – 10 weeks old, bothe genders | |
Scissors | WPI | 15922 | |
Scissors | WPI | 14003 | |
Dumont 5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
7-0 Prolene suture | Ethicon | W8725 | |
6-0 Vicryl suture | Ethicon | W9981 | |
Cotton buds | Spar | ||
Millswabs sterile | Millpledge veterinary | 611950 | |
Drapes | Kruuse | 141765 | |
Glucose Saline-Aqupharm3 | Animal Care | XVD589 | |
Clear H20 HydroGel 98% sterile water | Clearh2o | ||
Buprenorphine | National Veterinary Supplies | ||
Isoflurane vaporizer | General Anaesthetic Services | ||
IsoFlo 100% W/W inhalation vapour, liquid | National Veterinary Supplies | ||
Sterilizer Steri350 | Inotech | ||
Microscope Olympus SZX10 | Olympus |