Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Samtidige skelnen mellem monofagligt og blandet DFS70 mønstre under ANA Screening med en roman HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout substrat

Published: January 17, 2018 doi: 10.3791/56722
Automatic Translation
1, 1
1Research & Development, Immco Diagnostics, A Trinity Biotech Company

Summary

DFS70 autoantistoffer efterligne fælles sygdom-associerede antinukleare antistof mønstre gør nøjagtig fortolkning udfordrende, når ved hjælp af konventionelle HEp-2 substrater. Protokollen beskriver fordele af roman manipuleret HEp-2 substrat i forhold til konventionelle HEp-2 i ANA screening og skelne DFS70 mønstre med høj tillid til både monofagligt og blandet ANA positive tilfælde.

Abstract

Systemisk autoimmun bindevæv er karakteriseret af cirkulerende Antinukleære antistoffer (ANA). Selv om der er flere teknologier til ANA screening, indirekte immunofluorescens (IIF) ved hjælp af menneskelige epitel celler-2 (HEp-2) substrat er fortsat den primære og anbefalede metode på grund af sin overlegne følsomhed. HEp-2 substrater kan registrere et væld af mønstre som følge af autoantistof binding til forskellige protein- og nukleinsyre autoantigens fordelt over hele kernen og cytoplasmaet af celler. Den store mangfoldighed af monofagligt og blandet mønstre som følge af positive reaktioner på HEp-2 substrat også komplicere fortolkningen og nøjagtigheden af rapportering. Et konkret eksempel, som for nylig har modtaget allerstørste opmærksomhed er den tætte fine plettet 70 (DFS70) mønster som følge af autoantistoffer, der specifikt binder til et protein kaldet linse epitel afledt vækstfaktor (LEDGF). Manglen på klare association med en bestemt systemisk autoimmun sygdom og høj prævalens i sunde befolkninger har gjort nøjagtig fortolkning af DFS70 mønster vigtigt. Nøjagtig skelnen mellem DFS70 mønster fra sygdom-associerede mønstre ved hjælp af konventionelle HEp-2 substrat er udfordrende. Endvidere hyppige samtidig forekomst af DFS70 mønster sammen med sygdom-associerede mønstre som homogene, plettet og blandet homogene-plettet mønstre komplicere IIF fortolkning. Målet med dette papir er at påvise nytten af en roman manipuleret HEp-2 IIF substrat, der bevarer alle fordelene ved konventionel HEp-2 substrat samtidig samtidig evnen til at skelne DFS70 mønster med høj tillid i begge monofagligt og blandet ANA positive eksempler. Den nye substrat er yderligere at afsløre sygdomme-associerede ANA mønstre tidligere skjult af DFS70 mønster.

Introduction

ANAs er kendetegnende for autoimmune medieret systemisk bindevæv sygdomme1. Flere metoder er ansat til screening og bekræftelse af ANAs. IIF teknikken ved hjælp af HEp-2 substrat er stadig den mest udbredte og ofte anbefalet metode til screening af ANAs1,2. Trods fremskridt i faste fase diagnostiske assay metoder, enzym forbundet immunosorbent assay (ELISA), enzym immunoassay (VVM), kemiluminescens-immunassay (CLIA) og perle-baserede multiplex assays er IIF af HEp-2 den mest udbredte screening metoden på grund af dens diagnostiske nytte og omkostninger effektivitet1,2,3. De ovennævnte assay teknologier er afhængige af et begrænset sæt af renset indfødte eller rekombinante autoantigens HEp-2 celle éncellelag præparater på glas dias wells forelaegge en omfattende vifte af autoantigens i deres naturlige form, fordelt på kernen og cytoplasmaet, der reagerer med autoantistoffer fra patient sera eller positive kontroller, hvilket resulterer i et væld af mønstre, der er forbundet med forskellige autoimmune sygdomme. Disse mønstre er klassificeret i nukleare, cytoplasmatisk og mitotiske mønstre baseret på placeringen af antigen i cellerne. Hvert mønster og tilhørende antigen/antigener og sygdom stater er godt præget4. I metoden IIF inkuberes patienten og kontrol sera på glas dias brønde, der præsenterer en éncellelag kultur af HEp-2 celler forsvarligt fastgjort til bevare et væld af autoantigens i deres naturlige konfiguration. Autoantistoffer i patient sera eller positive kontroller er tilladt at binde til autoantigens præsenteret af HEp-2 celler på substrat (glas dias godt) under inkubation. Inkubation, ubundne antistoffer vaskes indlæg af og bundne antistoffer af IgG-klasse er registreret med fluorescein/fluorescein isothiocyanat (FITC) konjugeret-anti-humant IgG reagens. Ubundne rapporterede-konjugat er skyllet væk og glas coverslips er monteret på toppen af dias ved hjælp af en montering medium, der bevarer Reaktionerne og letter observation under et mikroskop for fluorescerende. Reaktioner er observeret under et fluorescens mikroskop udstyret med passende excitation-emission filter kombination, der er konfigureret som reporter bruges (for FITC reporter, en diagnostisk mikroskop typisk bruger filtre med excitation række 467 -498 nm og en emission række 513-556 nm). Tilstedeværelsen af ANA er påvist ved en lyse grønne fluorescens af bestemte strukturer i cellerne. I modsætning til automatiseret assay platforme bygger IIF metode på den besværlige proces med seriel fortynding af sera og visuelle positiv bestemmelse af farvning mønstre som kræver betydelig bruger ekspertise5,6. På trods af disse begrænsninger, IIF af HEp-2 er stadig den mest udbredte og anbefalet metode til screening af ANAs på grund af standardisering indsats mod mønster fortolkning og nomenklatur af den internationale konsensus om ANA mønstre (ICAP) Udvalget, Øget tilgængelighed af automationsløsninger til IIF slide behandling, og resultatet fortolkning3.

Blandt mange mønstre opdaget af HEp-2 IIF metode, autoantistoffer rettet mod psip1 -gen produktet (også benævnt p75-LEDGF-DFS70), har fået betydelig interesse i de seneste år for flere grunde4,5 ,6,7,8,9,10. DFS70 autoantistoffer er til stede i høje titers i raske kontrolpersoner, og undersøgelser har hidtil ikke formået at påvise en særskilt klinisk association for tilstedeværelsen af DFS70 autoantistoffer7,8,9 ,10,11,12,13. Satserne for rapporteret positive resultater for DFS70 autoantistoffer i forskellige sygdomstilstande og sund kohorter varierede meget mellem undersøgelser6,8,9,10,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Monofagligt DFS70 mønster er godt differentieret fra en homogen eller plettet mønster men fortolkning af blandet homogene-plettet mønstre og anti-DFS70 antistoffer Co forekommer med andre ANAs er udfordrende selv til ekspert læsere. Den nuværende generation af IIF screening metoder og DFS70 specifikke faste fase assays er ikke i stand til at skelne en monofagligt DFS70 reaktion fra blandet mønstre (figur 1A, gule skraverede område af algoritme). Fejlfortolkning af DFS70 mønster som homogene, plettet, eller blandet mønster, eller omvendt, kan have alvorlige følger på patientpleje. Den aktuelle anvendte protokol er som følger: de kliniske labs beskæftiger en række faste fase bekræftende prøver for sygdom-associerede ANAs og/eller en immunoadsorption metode til DFS70/LEDGF når tætte fine plettet (AC-2) mønster er mistænkt (figur 1a)4,5.

Målet med denne protokol er at påvise nytten af en roman manipuleret HEp-2 IIF substrat (HEp-2 ELITE/DFS70 knockout (KO), vil blive henvist til som HEp-2 ELITE), bevarer alle fordelene ved konventionel HEp-2 for screening ANAs mens samtidig skelne DFS70 mønster med høj tillid til både monofagligt og blandet ANA positive tilfælde (figur 1B, gule skraverede område af algoritmen)5. HEp-2 ELITE substrat er sammensat af en omtrentlig blanding af umodificerede konventionelle HEp-2 celler og manipulerede celler LEDGF/p75/DFS70 antigen i 1:9 forholdet5. IIF proceduren for HEp-2 ELITE er identisk med metoden konventionelle HEp-2. Den unikke konfiguration af HEp-2 ELITE substrat ikke kun bevarer alle fordelene ved konventionel HEp2 men kan differentiere homogene, plettet og blandet reaktionsmønstre fra DFS70 mønster på den indledende screening eller prøvning af en prøve (figur 1B )5. Patient sera at være reagerede på dias med HEp-2 IIF substrat bør være fortyndet 1:40 med screening fortynding eller som enkelte laboratorium kriterium. En specifik reaktion på 1:40 eller højere titer betragtes som positive.

I denne undersøgelse, positive sera for homogen, plettet, centromer, nucleolar, cytoplasmatisk retikulære/AMA og DFS70 mønstre, der produceres en mellemlang positivt signal (i forhold til den negative kontrol og positiv ANA kontrol af kit) på screening fortynding på 1:40 blev udvalgt til simulering af mono-specifikke og blandet mønstre på substrater til HEp-2 (konventionelle og HEp-2 ELITE). 1:40 fortyndet DFS70 positive sera blev blandet med 1:40 fortyndinger af enkelte sygdom-associerede ANA mønster kontrol (homogen, plettet, centromer, nucleolar, eller cytoplasmatisk retikulære-AMA) i forskellige nøgletal (kontrol: DFS70 i 100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80, og 0:100) og vurderet på konventionelle og HEp-2 ELITE substrater efter standard IIF proceduren beskrevet nedenfor.

Protocol

Protokollen følger retningslinjerne i Trinity Biotech institutionelle menneskelige videnskabsetisk Komité.

1. prøven og substrat forberedelse

  1. Tillade poser indeholdende substrat dias (glas dias med 12 brønde på hvert dias, der indeholder enten HEp2 eller HEp-2 + HEp2 KO celle blanding) til Reagensglasset stuetemperatur til optimal ydeevne og forhindre kondens fugt på dias overflade forud for den tilsætning af prøven. Dette skal tage cirka mellem 10-15 min.
  2. Når ekvilibreres til stuetemperatur, forsigtigt fjerne substrat dias ved hjælp af fingre uden dem røre siderne af posen.
  3. Etiket dias og placere dem i en inkubation kammer (stuetemperatur) foret med papirservietter fugtet med vand for at forhindre udtørring af dias under prøven og konjugat inkubation.
    Bemærk: Uspecifik farvning kan skyldes tørre brønde; en våd køkkenrulle inde inkubation kammer giver fugt og forhindrer godt tørhed.

2. tilføjelse af kontrol og prøver

  1. Dispensere ca 50 µL af negativ/positiv kontrol, kombinationer af DFS70-ANA positive sera, som beskrevet i denne undersøgelse, eller patienten serumprøver på enkelte dias brønde.
  2. Undvære betjeningsorgan(er) og prøver i hver brønd på diaset.
  3. For at forhindre godt krydskontaminering, undgå overfyldning brøndene. Mens ikke overfylde wells, sørge for fuldstændig dækning af godt overflade og undgå luftbobler.
    Bemærk: Den anbefalede mængde er 50 µL pr. trin 2.1.
  4. Låget lægges på inkubation kammer og inkuberes dias i 30 min. ved stuetemperatur. Hvis der er nogen til stede i serum patientens ANA, vil det bindes til stede i hver brønd under denne inkubationsperiode celler.
  5. Når Inkubationstiden er overstået, skal du fjerne diasset fra inkubation kammer. Hold diasset på fanen ende og skylles forsigtigt med ca 10 mL phosphat bufferet saltvand (PBS) vaskebuffer findes i kit, ved hjælp af en pipette eller i et bægerglas, fyldt med PBS for 10-15 s. overføre diaset straks i et Coplin krukke med PBS wash buffer og vask ( Soak) i 10 min. Gentag processen med alle resterende dias.
    Bemærk: Når placere flere dias i en Coplin krukke, sikre at den celle side af diaset ikke kontakte et andet dias, da dette vil resultere i skader cellerne overholdes på glas dias.

3. tilsætning af fluorescerende konjugat

  1. Fjern kun ét dias ad gangen fra Coplin krukke. For at fjerne den overskydende PBS wash buffer på diaset, blidt tryk eller DUP dias på et stykke køkkenrulle. Hvert sæt leveres med FITC mærket-anti-humant IgG fluorescerende konjugat. Til hver brønd, forsigtigt anvende 1 dråbe (ca 50 µL) af den medfølgende konjugat.
  2. Glassene inkuberes i den lukkede farvning inkubation kammer i 30 min.
    Bemærk: Brugen af Fc specifikke IgG konjugat anbefales. Hvis der er nogen til stede i serum patientens ANA, konjugationen vil binde sig til stede i hver brønd under denne inkubationsperiode, hvilket resulterer i den specifikke fluorescens af celler findes i brøndene celler. Konjugationen er følsomme over for lys. Lukket inkubation kammer vil bidrage til at forhindre lys interferens med den konjugerede reaktion af celler i hver brønd.
  3. Når Inkubationstiden er overstået, skal du fjerne diasset fra inkubation kammer. Hold diasset på fanen slutningen og skylles forsigtigt med ca 10 mL PBS wash buffer i kit, ved hjælp af en pipette eller i et bægerglas, fyldt med PBS. Overføre diaset straks i et Coplin krukke med PBS wash buffer og vask (blød) for 10 min. Gentag processen med alle de resterende dias.
    Bemærk: Når placere flere dias i en Coplin krukke, sikre at den celle side af diaset ikke kontakte et andet dias, da dette vil resultere i skader cellerne overholdes på glas dias.
  4. Sted den coverslips, der er leveret i kittet på en tør køkkenrulle. Montering medier leveres med kittet. Til den nederste kant af coverslip, anvende mellem 3-4 dråber af montering medierne i en linje.
  5. Tegne ét dias ad gangen fra den Coplin krukke indeholdende wash buffer. For at fjerne den overskydende vaskebuffer, blidt tryk eller DUP dias på et stykke køkkenrulle.
  6. Lavere skub forsigtigt til coverslip ved at placere den nederste kant af dias til kanten af coverslip. Dette giver mulighed for montering medier til stede på den nederste kant coverslip til at flyde på den øverste kant af diaset, og minimerer dannelsen af luftbobler, som kan interferere med læsning af den hver brønd af et dias.
    Bemærk: Minimal pres bør bruges til at montere diasset dækning på diaset. Nogen overtryk kan forårsage lateral bevægelse af dæksel glider. Dette kan forårsage skader på éncellelag forberedelse af celler og resultatet i forvrængning.
  7. Gemme diasene i mørke ved 2-8 ° C. Undersøge diasene, så snart de er monteret eller inden for 48 timer.
    Bemærk: Længere opbevaring kan resultere i forringelse af det mønster og fluorescerende signal.

4. identifikation af Positive og Negative resultater

  1. Se dias med et fluorescerende mikroskop ved hjælp af et FITC filtersæt, placeret i et mørkt rum.
  2. Undersøge for specifik lyse grønne fluorescens under et fluorescens mikroskop ved en forstørrelse på 200 X eller højere for at foretage den endelige fortolkning vedrørende positivitet og mønster. Overholde de positive og negative kontroller.
    Bemærk: Den positive kontrol vil vise lyse grønne fluorescens i cellekernen (figur 2A, homogen). Den negative kontrol viser ingen særlige grønne fluorescens under et fluorescens mikroskop.
  3. Optage den positive/negative resultat for hver brønd og omfatter ANA mønster for positive tilfælde.

Representative Results

HEp-2 ELITE/DFS70 KO substrat bevarer klassisk ANA mønstre og letter klar skelnen af DFS70 mønster:

Konventionelle og manipulerede celler på HEp-2 ELITE/DFS70 KO substrat er identiske, bevare alle autoantigens med undtagelse af LEDGF/p75. Den negative kontrol, forudsat af sættet etablerer baseline fluorescerende signal. Positive kontroller for homogen, plettet, centromer, nucleolar og mitokondriel mønstre på HEp-2 ELITE producere en identisk med forventede mønstre på konventionelle HEp-2 IIF substrat (figur 2A) mønster. Disse henvisning mønstre er blevet beskrevet i detaljer med hvert mønster antigener og sygdom association tidligere4,29. En kort beskrivelse af mønstre observeret i figur 2A er fastsat i tabel 1.

DFS70 mønster på HEp-2 ELITE:

Ca 10% af celler i hver godt vise et tætte fine plettet mønster (ICAP tildelt nomenklatur: AC-2) der kan iagttages på interfasen kernen, og kromatin forbundet farvning ses på mitotiske kerner (figur 2B). På konventionelle HEp-2 substrat, vil alle cellerne har dette mønster når reagerede med en DFS70 positiv prøve. De resterende ~ 90% af HEp-2-celler har psip1 gen kodning LEDGF antigen slået ud og derfor ikke vil producere et signal eller mønster når reagerede med et monofagligt DFS70 positivt serum (figur 2B). Hvis 10% HEp-2 cellernes har lysere fluorescens svarende til DFS70 mønster og resten af celler findes yderligere mønstre (f.eks, fint plettet eller nucleolar), angiver tilstedeværelsen af blandet mønstre. Nærmere undersøgelse af sådanne mønstre er vigtigt at bekræfte alle autoantistof særlige kendetegn, der findes ud over DFS70 mønsteret. For at demonstrere evnen til HEp-2 ELITE substrat, et panel af sera prøver blev skabt med forskellige koncentrationer af DFS70 og ANA positiv kontrol sera og testet på både konventionelle og HEp-2 ELITE substrater ved hjælp af en standard IIF protokol (figur 3 , Figur 4, figur 5, figur 6, figur 7).

Fortolkning af DFS70 monofagligt og blandede reaktioner på konventionelle og HEp-2 ELITE substrater:

For hver specifik sygdom-associerede ANA mønster (figur 3, figur 4, figur 5, figur 6, figur 7), et monofagligt ANA mønster på venstre de fleste kolonne og en monofagligt DFS70 mønster på højre de fleste kolonne kan observeres. De tre kolonner i midten repræsenterer forskellige nøgletal for sygdom-forbundet og DFS70 mønster positive kontroller. De resulterende blandet mønstre udfordrende for at skelne på konventionelle HEp-2 substrat (figur 3, figur 4, figur 5, figur 6, figur 7, øverste række). Dog med den roman Hep-2 ELITE substrat, i de fleste af prøverne, adskiller intensiteter forskellen mellem uforandret og manipulerede celler sig som ikke blot bekræfter tilstedeværelsen af DFS70 autoantistoffer (når forholdet mellem lysere til mindre lyse celler er 1:9), men afslører også en sekundær ANA mønster. For homogene DFS70 eller plettet-DFS70 blandede reaktioner, er det umuligt at trygt forudsige den korrekte mønster, hvilket fører til labs vælger for at køre en række yderligere assays (figur 1A). Centromer-DFS70 og nucleolar-DFS70 af blandede reaktioner, mistanke om DFS70 positivitet er meget udfordrende (figur 5, figur 6). Med nucleolar og cytoplasmatisk retikulære/AMA reaktioner er DFS70 mønster ikke dominerende indtil sera forholdet når 50%. I alle eksemplerne, HEp-2 ELITE substrat kan præsentere DFS70 mønster og den underliggende sekundære mønster over en bredere vifte af intensitet niveauer og dermed letter en mere nøjagtig ANA fortolkning.

Nøje overholder de blandede mønstre, resultater for forskellige 50/50 kombinationer af ANA og DFS70 positiv kontrol blev udvidet (figur 8) for både konventionelle og HEp-2 ELITE substrater. Det opfordres til at observere både interphase og mitotiske farvning for alle ANA mønstre herunder DFS70 på HEp-2 substrater for at forbedre fortolkningen og nøjagtigheden af de rapporterede mønster. Dog for blandet mønstre, kan differential mønstret præsenteret ved at dividere cellekerner ikke være tilstrækkeligt til at lette korrekte fortolkning. Røde pile (figur 8) angiver de mitotiske kerner i både konventionelle og manipuleret celle. Det kan konstateres, at blandet DFS70 reaktioner på dividere celler ikke er i overensstemmelse med de etablerede regler for fortolkning af sygdom-associerede ANA mønstre. Gul og blå pile angiver uforandret og manipuleret (DFS70 KO) HEp-2 cellekerner, henholdsvis. I alle kombinationerne (figur 8), en klar intensitet forskel mellem umodificeret celle nukleare farvning (~ 10%) og manipuleret celle nukleare (~ 90%) mønster i den samme mikroskopiske synsfelt er observeret, som muliggør samtidige screening og bekræftelse af DFS70 mønster.

Figure 1
Figur 1: ANA screening algoritmer ved hjælp af konventionelle HEp-2 og HEp-2 ELITE/DFS70 KO IIF metoder. (A) skematisk optrevler mangel på konventionelle HEp-2 IIF i at identificere monofagligt og blandet DFS70 positive mønstre på stadiet screening (gule skraverede område) og dets manglende evne til at udelukke en sekundær sygdom-associerede ANA mønster, kan være skjult af DFS70 mønster. Yderligere, den nuværende generation af DFS70 specifikke faste fase konfirmatoriske analyser ikke er i stand til at bekræfte monofagligt DFS70 positivitet, hvilket fører til yderligere bekræftende prøvning for ANAs. (B) skematisk afslører kapaciteter af HEp-2 ELITE for screening af ANAs, samtidige skelnen mellem monofagligt og blandet DFS70 reaktioner, og eliminerer behovet for faste fase DFS70 undersøgelser, bekræftelse. Algoritme ved hjælp af HEp-2 ELITE betydeligt forenkler ANA screening og reducerer det nødvendige antal bekræftelse assays. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: klassiske ANA og DFS70 mønster på HEp-2 ELITE/DFS70 KO substrat. (A) HEp-2 ELITE/DFS70 KO substrat bevarer klassisk ANA mønstre. Klassiske homogene reaktion og DFS70 positive reaktioner blev produceret ved hjælp af positive kontroller forudsat af sættet. Andre reaktioner blev produceret ved hjælp af tidligere etablerede positiv kontrol sera for plettet, centromer, nucleolar, og cytoplasmatisk retikulære/AMA reaktioner5. (B) HEp-2 ELITE/DFS70 KO substrat giver både konventionelle og manipulerede celler, som letter let skelnen af DFS70 mønster. Skematisk viser den resulterende DFS70 monofagligt reaktion og farvning mønster på interfasen og dividere cellekerner for både konventionelle og manipuleret (DFS70-KO) celler. Manipuleret HEp-2 celler er blottet for p75-LEDGF-DFS70-antigen, der muliggør samtidige påvisning af sekundære mønstre, som normalt er skjult af DFS70 autoantistof reaktion på konventionelle HEp-2 substrater. Pilene (gul) angiver eksempler på mitotiske cellekerner. Skala søjler repræsenterer 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: DFS70 og homogen sera i kombination. DFS70 monofagligt sera blev kombineret med en positiv homogent mønster kontrol i forskellige nøgletal (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 og 0:100) og testet på konventionelle og manipuleret (DFS70-KO) HEp-2 substrater. Skala søjler repræsenterer 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: DFS70 og plettet sera i kombination. DFS70 monofagligt sera blev kombineret med en positiv plettet mønster kontrol i forskellige nøgletal (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 og 0:100) og testet på konventionelle og manipuleret (DFS70-KO) HEp-2 substrater. Skala søjler repræsenterer 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: DFS70 og centromer sera i kombination. DFS-70 monofagligt sera blev kombineret med en positiv centromer mønster kontrol i forskellige nøgletal (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 og 0:100) og testet på konventionelle og manipuleret (DFS70-KO) HEp-2 substrater. Skala søjler repræsenterer 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: DFS70 og nucleolar sera i kombination. DFS-70 monofagligt sera blev kombineret med en positiv nucleolar mønster kontrol i forskellige nøgletal (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 og 0:100) og testet på konventionelle og manipuleret (DFS70-KO) HEp-2 substrater. Skala søjler repræsenterer 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: DFS70 og cytoplasmatisk retikulære/AMA sera i kombination. DFS70 monofagligt sera blev kombineret med en positiv mitokondrie mønster kontrol i forskellige nøgletal (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 og 0:100) og testet på konventionelle og manipuleret (DFS70-KO) HEp-2 substrater. Skala søjler repræsenterer 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: blandet mønstre (50/50 forhold) produceret på konventionelle og HEp-2 ELITE substrater. Forskelle mellem de to substrater er afsløret. Røde pile indikerer de mitotiske kerner i både konventionelle og manipulerede celler på begge substrater. For disse kombinationer er differential mønstret præsenteret ved at dividere cellekerner på konventionelle HEp-2 substrat ikke tilstrækkelig til præcis fortolkning af blandet mønstre. Det kan konstateres, at blandet DFS70 reaktioner på dividere celler kan forurolige den etablerede sæt regler for fortolkningen af sygdom-associerede ANA mønstre. Gul og blå pile angiver uforandret og manipuleret (DFS70 KO) HEp-2 cellekerner, henholdsvis. Resultaterne for alle kombinationerne testes på manipuleret underlaget: en klar intensitet forskel mellem interphase nukleare mønster tilhører umodificerede celler (~ 10%) og manipulerede celler (~ 90%) blev observeret, som aktiveret samtidige påvisning og bekræftelse af DFS70 mønster. Skala søjler repræsenterer 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

ANA mønster Beskrivelse
Homogene Hele kernen fluorescerer jævnt med en diffus farvning mønster.
Plettet Diskret, grove til fine prikker af fluorescerer i hele kernen.  Fine plettet og grove plettet mønstre er blevet beskrevet.
Nucleolar Nucleoli pletten som flere faste eller plettet organer i kernen. Undertyper er blevet beskrevet tidligere.
Centromer Store pletter af endeligt tal. Reaktiv antigen udskiller med kondenseret kromosomer i celler under mitosen.
Cytoplasmatisk retikulære/AMA Cytoplasmaet vises granulatform med positive farvning af mitokondrier.
DFS70 •Conventional HEp-2 celler: en tætte fine plettet mønster er observeret på interfasen kernen og kromatin forbundet farvning ses på mitotiske kerner.
•Engineered DFS70 KO celler: Anti-DFS70 antistoffer producere negative farvning
HEp-2 Elite / DFS70 KO har konventionelle og manipuleret (DFS70 KO) celler i ca 1:9 forholdet. Konventionelle celler producerer typisk DFS70 mønster og manipulerede celler producerer et negativt mønster når reagerede med en DFS70 monofagligt/isoleret positive reaktioner.

Tabel 1: Beskrivelse af ANA mønstre.

Discussion

Autoantistoffer mod nukleare og cytoplasmatisk antigener er meget udbredt i systemiske autoimmune sygdomme. Selv om ingen enkelt analyse giver den bedst mulige følsomhed og specificitet, er IIF af HEp-2 bredt anerkendt som en yderst følsom og omkostningseffektive screeningsmetode for systemiske autoimmune sygdomme2,3,4 . Trods forekomsten af IIF protokol for mere end 50 år er nøjagtigheden af IIF assay stærkt afhængige af dygtighed af tekniker, omhyggelig udførelse af de enkelte trin i protokollen, og præcis fortolkning af resultater ved hjælp af en velholdt Fluorescens mikroskop. Diagnosticering af systemisk autoimmun sygdom bør ikke baseres på resultaterne af en enkelt serologiske test såsom IIF af HEp-2.

Rekonstituering af reagenser ved hjælp af høj kvalitet vand (destilleret/deioniseret), brug af standardiseret kit komponenter (dias med HEp-2 celle encellelag, prøve fortyndingsmiddel, positive og negative kontroller, forud fortyndede optimeret FITC-konjugat og montering medium) have en positiv indvirkning på resultaterne. Springer tilføjelsen af kontroller eller prøver på brønde kan tilskynde falsk negative fortolkninger. Tørring af dias på ethvert tidspunkt efter tilsætning af prøve eller kontrol kan medføre i kunstig falsk positive reaktioner og/eller forkert mønstre. For meget vaskebuffer tilbage på dias eller tørring af dias wells før dispensationen af montering medium kan resultere i artefakter. Tilføje utilstrækkelig mængde af montering medium eller generere bobler på dias overflade før en coverslip kan resultere i reaktioner, som ser slørede eller ud af fokus når observeret under mikroskop. Monterede dias skal opbevares ved 2-8 ° C og analyseres inden for det anbefalede vindue af tid til at minimere falske negative eller kunstig resultater.

Ved hjælp af en velholdt epi-fluorescerende mikroskop, som huser en passende LED/Hg/Xenon lyskilde og ren optiske komponenter herunder excitations- og filtre, der ikke beskadiges er afgørende for at opnå korrekt IIF resultater. Slut bruger træning for kræsne positiv/negativ reaktion Støtteintensiteter og fortolkning af mønstre er kritisk. HEp-2 IIF assays er sårbare over for manglende standardisering i procedurer, mikroskop konfiguration, og undervisning af slutbrugere eller færdighed. Konsensus nomenklatur og repræsentant mønstre og eksempler på billeder anskaffes ved hjælp af forskellige producenter er stillet til rådighed af ICAP (< www.ANApatterns.org>) til undervisningsbrug4. En HEp-2 celle mønster klassificeringen træ fra ICAP for forskellige nukleare, cytoplasmatisk og mitotiske mønstre er en værdifuld ressource for at lære de subtile forskelle mellem forskellige mønstre, der kan ligne at utrænede øjne4. En af de primære eksempler på en udfordrende mønster er den DFS70, som også mangler en tydelig tilknytning til en autoimmun tilstand, og som beskrevet i tidligere afsnit dette mønster er meget udbredt i sunde befolkninger5.

Undersøgelsen, forekomsten af anti-DFS70 autoantistoffer variere mellem sund kohorter, ANA screening populationer, og ANA positive personer med ingen tegn på systemisk autoimmun sygdom9,16,20 ,30,31. DFS70 autoantistoffer er blevet rapporteret at forekomme i isolation samt med andre sygdomme-associerede ANA mønstre. Isoleret eller monofagligt DFS70 mønster er rapporteret i 2-22% af raske kontrolpersoner, men i mindre end 1% af tilfældene med autoimmun reumatiske sygdom32. Baseret på disse tendenser, blev DFS70 mono-positive mønster foreslået som kriterium til at udelukke i autoimmun reumatiske sygdomme af ICAP Udvalget3,31,32. ICAP Komité, oprettet for at fremme harmoniseringen af autoantistof test nomenklatur og fortolkning af HEp-2 IIF resultater, anbefaler rapportering DFS70 positivitet mens rapportering ANA screening resultater4.

Før udelukke en systemisk autoimmun sygdom baseret på DFS70 mono-positivitet, er det vigtigt at foretage den nuværende screening og bekræftelse metoder (navnlig specifikt for DFS70). Aftale mellem DFS70 positivitet af HEp-2 IIF og faste fase genfremsatte assays nemlig ELISA, CLIA og line immunassay/dot skamplet metoder) varierede meget mellem forskellige studier13,22,25,33 . IIF fortolkning og bekræftende assay parametre, der bidrager til denne uenighed har været drøftet tidligere5,13,34. En nyligt foreslåede immunoadsorption tilgang til anti-DFS70 antistof bekræftelse omhandler nogle af manglerne i nuværende faste fase assays (for DFS70) men kræver labs til at udføre et ekstra trin i IIF procedure på mistænkte prøver, som øger omkostninger og turnaround tid til rapportering af resultater13. Denne ekstra trin er ikke påkrævet, når HEp-2 ELITE/DFS70 KO celler anvendes til rutine ANA screening. Dette reducerer de samlede omkostninger og desuden er der ingen påvirkning af behandlingstid som DFS70 mønster er skimtes i den indledende screening trin27. En yderligere ulempe ved hjælp af konventionelle HEp-2 IIF metode er, at det er i stand til at skelne DFS70 mønster Co forekommer med andre ANA mønstre på stadiet screening. Denne ulempe er imidlertid overvinde ved hjælp af HEp-2 ELITE/DFS70 KO celler27.

Sammenlignende evaluering af konventionelle HEp-2 og den nye manipuleret HEp-2 (HEp-2 ELITE/DFS70 KO) ved hjælp af ANA positive kontroller og deres kombinationer med et mono-positive DFS70 kontrol, påvise nytten af den nye substrat evne til samtidigt skærm for ANAs og bekræfte DFS70 mønster (figur 1). IIF-protokollen til de nye substrat er identisk med den konventionelle HEp-2 IIF metode. Fortolkning ordning for alle sygdom-associerede ANA mønstre er identiske med undtagelse af DFS70 mønsteret (tabel 1). Fortolkning af både mono-positive og blandet DFS70 mønstre var relativt lettere ved hjælp af den nye metode og det garanterer ikke yderligere assays (figur 1B). Gennemførelsen af denne nye metode i kliniske lab forenkler udfordringen forbundet med fortolkningen af DFS70 mønster og forbedrer den samlede nøjagtighed af ANA screening af yderligere afslører sygdom-associerede ANA mønstre tidligere skjult af DFS70 (blandet mønstre).

Disclosures

Forfatterne Kishore Malyavantham og Lakshmanan Suresh er medarbejdere i Trinity Biotech, USA.

Acknowledgments

Vi takke Andrew Zenger udfører IIF eksperimenter og indsamle billeder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouch Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240
ANA positive control Trinity Biotech  part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
DFS70 antibody positive control Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240
Negative control Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan's blue counterstain Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Buffer diluent for serum Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Phosphate buffered saline (PBS) Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Mounting medium Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Coverslips  Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouch Trinity Biotech part of kit# 1103, 1103-240
Name Company Catalog Number Comments
Materials used in the study but not provided by the kits
Diagnostic fluorescent microscope Nikon Eclipse 50i Equipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1
Incubation chamber Trinity Biotech provided for customers (no catalog #)
Coplin jar n/a General labware
Paper towels n/a General lab supplies
distilled/deionized water n/a General lab supplies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American College of Rheumatology. Position Statement. Methodology of testing for antinuclear antibodies. , Available from: https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf (2011).
  2. Meroni, P. L., Schur, P. H. ANA screening: an old test with new recommendations. Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).
  3. Agmon-Levin, N., et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).
  4. Chan, E. K., et al. Report of the First International Consensus on Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns 2014-2015. Front Immunol. 6, 412 (2015).
  5. Malyavantham, K., Suresh, L. Analysis of DFS70 pattern and impact on ANA screening using a novel HEp-2 ELITE/DFS70 knockout substrate. Auto Immun Highlights. 8 (1), 3 (2017).
  6. Sperotto, F., Seguso, M., Gallo, N., Plebani, M., Zulian, F. Anti-DFS70 antibodies in healthy schoolchildren: A follow-up analysis. Autoimmun Rev. , (2017).
  7. Ayaki, M., et al. Detection of cytotoxic anti-LEDGF autoantibodies in atopic dermatitis. Autoimmunity. 35 (5), 319-327 (2002).
  8. Ochs, R. L., et al. Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions. J Allergy Clin Immunol. 105 (6 Pt 1), 1211-1220 (2000).
  9. Watanabe, A., et al. Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers. Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).
  10. Yamada, K., et al. Humoral immune response directed against LEDGF in patients with VKH. Immunol Lett. 78 (3), 161-168 (2001).
  11. Seelig, C. A., Bauer, O., Seelig, H. P. Autoantibodies Against DFS70/LEDGF Exclusion Markers for Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases (SARD). Clin Lab. 62 (4), 499-517 (2016).
  12. Ochs, R. L., et al. The significance of autoantibodies to DFS70/LEDGFp75 in health and disease: integrating basic science with clinical understanding. Clin Exp Med. 16 (3), 273-293 (2016).
  13. Bizzaro, N., et al. Specific chemoluminescence and immunoasdorption tests for anti-DFS70 antibodies avoid false positive results by indirect immunofluorescence. Clin Chim Acta. 451 (Pt B), 271-277 (2015).
  14. Bizzaro, N., et al. Antibodies to the lens and cornea in anti-DFS70-positive subjects. Ann N Y Acad Sci. 1107, 174-183 (2007).
  15. Daniels, T., et al. Antinuclear autoantibodies in prostate cancer: immunity to LEDGF/p75, a survival protein highly expressed in prostate tumors and cleaved during apoptosis. Prostate. 62 (1), 14-26 (2005).
  16. Dellavance, A., et al. The clinical spectrum of antinuclear antibodies associated with the nuclear dense fine speckled immunofluorescence pattern. J Rheumatol. 32 (11), 2144-2149 (2005).
  17. Gundin, S., et al. Measurement of anti-DFS70 antibodies in patients with ANA-associated autoimmune rheumatic diseases suspicion is cost-effective. Auto Immun Highlights. 7 (1), 10 (2016).
  18. Kang, S. Y., Lee, W. I. Clinical significance of dense fine speckled pattern in anti-nuclear antibody test using indirect immunofluorescence method. Korean J Lab Med. 29 (2), 145-151 (2009).
  19. Lee, H., Kim, Y., Han, K., Oh, E. J. Application of anti-DFS70 antibody and specific autoantibody test algorithms to patients with the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells. Scand J Rheumatol. 45 (2), 122-128 (2016).
  20. Mariz, H. A., et al. Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).
  21. Marlet, J., et al. Thrombophilia Associated with Anti-DFS70 Autoantibodies. PLoS One. 10 (9), e0138671 (2015).
  22. Mercado, M. V., et al. Detection of autoantibodies to DSF70/LEDGFp75 in Mexican Hispanics using multiple complementary assay platforms. Auto Immun Highlights. 8 (1), 1 (2017).
  23. Muro, Y., Sugiura, K., Morita, Y., Tomita, Y. High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease. Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).
  24. Muro, Y., Sugiura, K., Nakashima, R., Mimori, T., Akiyama, M. Low prevalence of anti-DFS70/LEDGF antibodies in patients with dermatomyositis and other systemic autoimmune rheumatic diseases. J Rheumatol. 40 (1), 92-93 (2013).
  25. Mutlu, E., Eyigor, M., Mutlu, D., Gultekin, M. Confirmation of anti-DFS70 antibodies is needed in routine clinical samples with DFS staining pattern. Cent Eur J Immunol. 41 (1), 6-11 (2016).
  26. Okamoto, M., et al. Autoantibodies to DFS70/LEDGF are increased in alopecia areata patients. J Autoimmun. 23 (3), 257-266 (2004).
  27. Pazini, A. M., Fleck, J., dos Santos, R. S., Beck, S. T. Clinical relevance and frequency of cytoplasmic and nuclear dense fine speckled patterns observed in ANA-HEp-2. Rev Bras Reumatol. 50 (6), 655-660 (2010).
  28. Schmeling, H., et al. Autoantibodies to Dense Fine Speckles in Pediatric Diseases and Controls. J Rheumatol. 42 (12), 2419-2426 (2015).
  29. Wiik, A. S., Hoier-Madsen, M., Forslid, J., Charles, P., Meyrowitsch, J. Antinuclear antibodies: a contemporary nomenclature using HEp-2 cells. J Autoimmun. 35 (3), 276-290 (2010).
  30. Mahler, M., Fritzler, M. J. The Clinical Significance of the Dense Fine Speckled Immunofluorescence Pattern on HEp-2 Cells for the Diagnosis of Systemic Autoimmune Diseases. Clin Dev Immunol. 2012, 494356 (2012).
  31. Mahler, M., et al. Anti-DFS70/LEDGF Antibodies Are More Prevalent in Healthy Individuals Compared to Patients with Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases. J Rheumatol. 39 (11), 2104-2110 (2012).
  32. Conrad, K., Rober, N., Andrade, L. E., Mahler, M. The Clinical Relevance of Anti-DFS70 Autoantibodies. Clin Rev Allergy Immunol. , (2016).
  33. Miyara, M., et al. Clinical Phenotypes of Patients with Anti-DFS70/LEDGF Antibodies in a Routine ANA Referral Cohort. Clin Dev Immunol. 2013, 703759 (2013).
  34. Bizzaro, N., Tonutti, E., Villalta, D., et al. Recognizing the dense fine speckled/lens epithelium-derived growth factor/p75 pattern on HEP-2 cells: not an easy task! Comment on the article by Mariz et al. Arthritis Rheum. 63 (12), 4036-4037 (2011).

Tags

Immunologi sag 131 tætte fine plettet 70 linse epitel-afledt vækst faktor Antinukleære antistoffer menneskelige epitel celler-2 indirekte immunfluorescens homogen plettet
Samtidige skelnen mellem monofagligt og blandet DFS70 mønstre under ANA Screening med en roman HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout substrat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Malyavantham, K. S., Suresh, L.… More

Malyavantham, K. S., Suresh, L. Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate. J. Vis. Exp. (131), e56722, doi:10.3791/56722 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter