Visualisering af Biofilmdannelse i Candida albicans ved hjælp af en automatiseret mikrofluid enhed
Summary
Denne protokol beskriver brugen af en tilpasselig automatiseret mikrofluid enhed til at visualisere Biofilmdannelse i Candida albicans vært fysiologiske betingelser.
Abstract
Candida albicans er den mest almindelige svampe patogen mennesker, forårsager omkring 15% af hospitalserhvervede sepsis tilfælde. En større virulens attribut for C. albicans er dens evne til form biofilm, struktureret samfund af celler knyttet til biotiske og abiotiske overflader. C. albicans biofilm kan danne på værten væv, såsom slimhinde lag, og om medicinsk udstyr, såsom katetre, pacemakere, proteser og ledproteser. Biofilm udgøre væsentlige kliniske udfordringer, fordi de er meget modstandsdygtigt over for fysiske og kemiske perturbationer, og kan fungere som reservoirer for frø, der spredes infektioner. Forskellige in vitro- assays har været udnyttet til at studere C. albicans Biofilmdannelse, såsom mikrotiter plade assays, tør vægt målinger, celle levedygtighed assays og scanning laser konfokalmikroskopi. Alle disse assays er enkelt end-point assays, hvor Biofilmdannelse vurderes på et bestemt tidspunkt. Her, beskriver vi en protokol for at studere Biofilmdannelse i realtid ved hjælp af en automatiseret mikrofluid enhed laminar flow betingelser. Denne metode giver mulighed for observation af Biofilmdannelse som biofilm udvikler sig over tid, bruger tilpasselig betingelser, der efterligner dem af værten, som dem, der opstod i vaskulære katetre. Denne protokol kan bruges til at vurdere biofilm defekter af genetiske mutanter og de hæmmende virkninger af antimikrobielle midler på biofilm udvikling i realtid.
Introduction
Candida albicans er en commensal medlem af den menneskelige mikrobiota, men det er også en opportunistisk patogen, kan forårsage overfladiske og alvorlige svampeinfektioner1,2. Et større virulens træk af C. albicans er dens evne til at danne modstandsdygtige og resistente biofilm, Fællesskaber af celler levet op til en overflade og indkapslet i en ekstracellulære matrix materiale1,3. C. albicans biofilm er meget struktureret, der indeholder flere lag af flere celletyper (runde spirende gær-form celler, oval pseudohyphal celler og rørformede hyphal celler)4. C. albicans biofilm udvikling begynder med overholdelse af runde gær-form celler til en overflade (såning af biofilm), efterfulgt af udbredelsen af disse celler på overfladen, og derefter modning af umoden biofilm struktur i en fuldt dannet biofilm, der er omgivet af ekstracellulære matrix materiale4. Den modne biofilm består overvejende af langstrakt hyphal celler, der danner tætte og sammenhængende netværk, giver den arkitektoniske stabilitet til biofilm4. Igennem hele livscyklussen biofilm runde spirende gær celler spredes fra de modne biofilm, og kan rejse til andre regioner i kroppen til at forårsage formidles infektioner eller frø nye biofilm på andre websteder4,5. C. albicans kan danne biofilm på biotiske overflader, såsom slimhindeinfektioner og hele værten væv, og abiotiske overflader, såsom katetre, pacemakere, proteser og proteser leddene. På grund af de genstridige egenskaber af biofilm, de er ekstremt vanskeligt at udrydde, og i mange tilfælde den eneste effektive behandlingsstrategi er fjernelse af inficerede enhed4. Det er således vigtigt at undersøge Biofilmdannelse under lignende betingelser som observeret i kliniske indstillinger.
Der er flere kritiske i vivo animalske modeller bruges til at studere C. albicans biofilm dannelse6,7,8; men disse undersøgelser kan være dyrt, tidskrævende, og er begrænset af antallet stammer og antimikrobielle stoffer, der kan testes på et givet tidspunkt. In vitro biofilm assays, på den anden side giver mulighed for hurtig, høj overførselshastighed vurdering af svampedræbende stoffer og mutantstammen, og er langt mere omkostningseffektive og etiske end biofilm assays båret ud i dyre modeller9, 10,11,12,13,14. Her beskriver vi et in vitro- forsøg, der vi udviklet og optimeret til at observere Biofilmdannelse tidsligt under laminar flow ved hjælp af en tilpasselig mikrofluid enhed14,15. Analysen giver mulighed for visualisering af hver fase af Biofilmdannelse, herunder overholdelse af indledende trin, celleproliferation, biofilm modning og celle dispersion. Analysen er også nyttige til at visualisere morfologi celleforandringer i hele udviklingen af en biofilm.
Mikrotiter plader, som udnyttes typisk til i vitro biofilm assays, mens høje overførselshastighed, tillader ikke for kontrollerede strømningsforhold. Traditionelle laminar flow celle systemer giver mulighed for kontinuerlig vurdering af Biofilmdannelse i kontrolleret strømningsforhold, men disse er ofte tidskrævende at sætte op og har tendens til at have begrænset dynamikområde kontrol og overførselshastighed. Mikrofluid enheden udnyttet her overvinder disse begrænsninger ved at kombinere høj overførselshastighed plader (der indeholder 48 wells) med en indbygget laminar flow kammer og er reproducerbare, alsidigt og kan tilpasses.
Her, vi beskriver en protokol til brug af et kommercielt tilgængelige automatiserede mikrofluid enhed at vurdere Biofilmdannelse af et wild-type C. albicans stamme, en kendt svampedræbende middel indvirkning på udviklingen af en biofilm og biofilm dannelse i to mutantstammen (bcr1Δ/Δ og efg1 Δ/Δ), der blev tidligere rapporteret at have biofilm defekter i in vitro og i vivo16,17,18. Den beskrevne protokol kan bruges til at teste effekten af antimikrobielle midler hæmme Biofilmdannelse hele udviklingen af en biofilm og identificere gener nødvendig for normal biofilm udvikling af screening mutant biblioteker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tilpasselig mikrofluid biofilm analysen beskrives her giver mulighed for visualisering af Biofilmdannelse i real-tid på en enkelt celle niveau når de udsættes for en fast rente laminar flow og konstant temperatur. Det giver en kraftfuld måde at studere udviklingen af biofilm i wild-type og mutante stammer, og virkningerne af antimikrobiel agent behandlinger på biofilm på betingelser, der efterligner fysiologiske tilstande observeret i kliniske indstillinger. I modsætning til de fleste in vitro- biofilm as…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle medlemmer af Nobile lab for nyttige diskussioner på biofilm assays. Denne undersøgelse blev støttet af nationale kontorer i Health (NIH) grant R21 AI125801 (til C.J.N.). D.L.R. blev støttet af et ph.d.-stipendium fra University of California Institute for Mexico og USA (UC-MEXUS) og Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).
Materials
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
References
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
- Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
- Fox, E. P., Nobile, C. J., Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. . Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. , 1-24 (2013).
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
- Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
- Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
- Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
- Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
- Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
- Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
- Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
- Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Baker, K. . At the bench: A laboratory navigator. 27, (2005).
