Visualisering af Biofilmdannelse i Candida albicans ved hjælp af en automatiseret mikrofluid enhed

Summary

Denne protokol beskriver brugen af en tilpasselig automatiseret mikrofluid enhed til at visualisere Biofilmdannelse i Candida albicans vært fysiologiske betingelser.

Abstract

Candida albicans er den mest almindelige svampe patogen mennesker, forårsager omkring 15% af hospitalserhvervede sepsis tilfælde. En større virulens attribut for C. albicans er dens evne til form biofilm, struktureret samfund af celler knyttet til biotiske og abiotiske overflader. C. albicans biofilm kan danne på værten væv, såsom slimhinde lag, og om medicinsk udstyr, såsom katetre, pacemakere, proteser og ledproteser. Biofilm udgøre væsentlige kliniske udfordringer, fordi de er meget modstandsdygtigt over for fysiske og kemiske perturbationer, og kan fungere som reservoirer for frø, der spredes infektioner. Forskellige in vitro- assays har været udnyttet til at studere C. albicans Biofilmdannelse, såsom mikrotiter plade assays, tør vægt målinger, celle levedygtighed assays og scanning laser konfokalmikroskopi. Alle disse assays er enkelt end-point assays, hvor Biofilmdannelse vurderes på et bestemt tidspunkt. Her, beskriver vi en protokol for at studere Biofilmdannelse i realtid ved hjælp af en automatiseret mikrofluid enhed laminar flow betingelser. Denne metode giver mulighed for observation af Biofilmdannelse som biofilm udvikler sig over tid, bruger tilpasselig betingelser, der efterligner dem af værten, som dem, der opstod i vaskulære katetre. Denne protokol kan bruges til at vurdere biofilm defekter af genetiske mutanter og de hæmmende virkninger af antimikrobielle midler på biofilm udvikling i realtid.

Introduction

Candida albicans er en commensal medlem af den menneskelige mikrobiota, men det er også en opportunistisk patogen, kan forårsage overfladiske og alvorlige svampeinfektioner^1,2. Et større virulens træk af C. albicans er dens evne til at danne modstandsdygtige og resistente biofilm, Fællesskaber af celler levet op til en overflade og indkapslet i en ekstracellulære matrix materiale^1,3. C. albicans biofilm er meget struktureret, der indeholder flere lag af flere celletyper (runde spirende gær-form celler, oval pseudohyphal celler og rørformede hyphal celler)⁴. C. albicans biofilm udvikling begynder med overholdelse af runde gær-form celler til en overflade (såning af biofilm), efterfulgt af udbredelsen af disse celler på overfladen, og derefter modning af umoden biofilm struktur i en fuldt dannet biofilm, der er omgivet af ekstracellulære matrix materiale⁴. Den modne biofilm består overvejende af langstrakt hyphal celler, der danner tætte og sammenhængende netværk, giver den arkitektoniske stabilitet til biofilm⁴. Igennem hele livscyklussen biofilm runde spirende gær celler spredes fra de modne biofilm, og kan rejse til andre regioner i kroppen til at forårsage formidles infektioner eller frø nye biofilm på andre websteder^4,5. C. albicans kan danne biofilm på biotiske overflader, såsom slimhindeinfektioner og hele værten væv, og abiotiske overflader, såsom katetre, pacemakere, proteser og proteser leddene. På grund af de genstridige egenskaber af biofilm, de er ekstremt vanskeligt at udrydde, og i mange tilfælde den eneste effektive behandlingsstrategi er fjernelse af inficerede enhed⁴. Det er således vigtigt at undersøge Biofilmdannelse under lignende betingelser som observeret i kliniske indstillinger.

Der er flere kritiske i vivo animalske modeller bruges til at studere C. albicans biofilm dannelse^6,7,8; men disse undersøgelser kan være dyrt, tidskrævende, og er begrænset af antallet stammer og antimikrobielle stoffer, der kan testes på et givet tidspunkt. In vitro biofilm assays, på den anden side giver mulighed for hurtig, høj overførselshastighed vurdering af svampedræbende stoffer og mutantstammen, og er langt mere omkostningseffektive og etiske end biofilm assays båret ud i dyre modeller^{9, 10,11,12,13,14}. Her beskriver vi et in vitro- forsøg, der vi udviklet og optimeret til at observere Biofilmdannelse tidsligt under laminar flow ved hjælp af en tilpasselig mikrofluid enhed^14,15. Analysen giver mulighed for visualisering af hver fase af Biofilmdannelse, herunder overholdelse af indledende trin, celleproliferation, biofilm modning og celle dispersion. Analysen er også nyttige til at visualisere morfologi celleforandringer i hele udviklingen af en biofilm.

Mikrotiter plader, som udnyttes typisk til i vitro biofilm assays, mens høje overførselshastighed, tillader ikke for kontrollerede strømningsforhold. Traditionelle laminar flow celle systemer giver mulighed for kontinuerlig vurdering af Biofilmdannelse i kontrolleret strømningsforhold, men disse er ofte tidskrævende at sætte op og har tendens til at have begrænset dynamikområde kontrol og overførselshastighed. Mikrofluid enheden udnyttet her overvinder disse begrænsninger ved at kombinere høj overførselshastighed plader (der indeholder 48 wells) med en indbygget laminar flow kammer og er reproducerbare, alsidigt og kan tilpasses.

Her, vi beskriver en protokol til brug af et kommercielt tilgængelige automatiserede mikrofluid enhed at vurdere Biofilmdannelse af et wild-type C. albicans stamme, en kendt svampedræbende middel indvirkning på udviklingen af en biofilm og biofilm dannelse i to mutantstammen (bcr1Δ/Δ og efg1 Δ/Δ), der blev tidligere rapporteret at have biofilm defekter i in vitro og i vivo^16,17,18. Den beskrevne protokol kan bruges til at teste effekten af antimikrobielle midler hæmme Biofilmdannelse hele udviklingen af en biofilm og identificere gener nødvendig for normal biofilm udvikling af screening mutant biblioteker.

Protocol

1. svampe celle kultur forberedelse

Bemærk: Adfærd cellekultur arbejde (dvs. åbne kryogene stock rør, celle kultur rør og -kolber) inden for en fryser biosikkerhed. Drej på regeringens ultraviolet (UV) bakteriedræbende lampe mindst 1 h før arbejde og slukke UV-lampe mens du aktivt arbejder i kabinettet. Bære handsker, sikkerhedsbriller og passende personlige værnemidler, og rense overfladen af bænken og pipetter med 70% ethanol forud for starten af forsøget. Brug af sterile filter tips og indgående kendskab til grundlæggende aseptisk mikrobiologiske teknikker anbefales.

1. Streak C. albicans stammer (wild-type, bcr1 Δ/Δ og efg1 Δ/Δ) på gær extract pepton dextrose (YPD) medium (1% gærekstrakt, 2% pepton, 2% glucose, pH 6,8) agar plader. Der inkuberes ved 30 ° C for 48 h, følgende standard mikrobiologisk praksis¹⁹.
2. Vælg en enkelt isoleret koloni fra plade til podes i 4 mL af YPD flydende medium (1% gærekstrakt, 2% pepton, 2% glucose, pH 6,8) og inkuberes ved 30 ° C under omrystning ved 225 rpm i en standard ryster inkubator for 12-15 h, følgende standard mikrobiologisk prak praksis¹⁹.
3. Bestemme den celle tæthed af kultur ved at måle optisk densitet (OD) på 600 nm i en kuvette (1 mL, 1 cm lysvej), følgende standard mikrobiologisk praksis¹⁹.
4. Fortynd cellekultur til en afsluttende OD₆₀₀ af 0,5, svarende til 2 x 10⁷ celler/mL, i Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium (indeholdende 165 mM 3-morpholinopropane-1-sulfonsyre syre (MOPPER), L-glutamin, og uden natrium bikarbonat, pH 7,0) eller Spider medium (1% næringsstof bouillon, 1% mannitol, 0,4% K₂HPO₄, pH 7,2).
   Bemærk: Alternative medier kan bruges til at støtte den specifikke tilvækst af stammer af interesse.
   Bemærk: Gør ikke celle fortyndinger for langt i forvejen. Det anbefales at begynde fortyndinger efter trin 3.3 (beskrevet nedenfor) for at forhindre indledningen af hyfer dannelse før cellerne bliver seedet i gennemsyn kanalen.

2. forberedelse af mikrofluid kanaler af den mikrofluid plade

Bemærk: Se i brugervejledningen til brugeren af mikrofluid system (se tabel over materialer) oplysninger om plader og instrument setup.

1. Inden du kører mikrofluid eksperiment, varm 20 mL af RPMI-1640 medier eller Spider medier i en inkubator ved 37 ° C. Yderligere medier volumen kan være påkrævet baseret på beregninger i trin 2.8. Før opvarmning media forhindrer dannelsen af luftbobler under eksperimentet.
2. Tænd den mikrofluidik system, som omfatter controlleren, to strømforsyningsenheder, mikroskop, kamera og computer tilsluttet systemet. Åbn den software, der kontrollerer systemet (se tabel af materialer) fra programmenuen på computeren. To windows vises, når programmet er åbnet.
3. Find stregkode antallet af pladen i brug og input nummer når du bliver spurgt af softwaren. Brug to separate computerskærme til softwaren på de to vinduer. Ét vindue (control module) indeholder kontrolelementer til pladen og det andet vindue (Montage, billeddiagnostiske modul) indeholder kontrolelementer til mikroskop og kamera.
4. Skifte på radiator power-knappen på controlleren og indstille mikrofluidik system temperaturen til 37 ° C ved hjælp af pileknapperne på temperatur controller.
5. Ren grænseflade plade (figur 1) ved hjælp af sterilt vand som følger. Spray i bunden af pladen med sterilt vand og bruge objektivet papir til at fjerne snavs/støv. Hvile interface plade ansigt ned på ren linse papir at lufttørre. Rense toppen af sammenkoblingsplade bruger 70% isopropanol og linse papir.
   Bemærk: Sammenkoblingsplade forbinder mikrofluid systemet på pladen, der skal indeholde celler og medier. Sikre, at ingen væske forbliver og at alle fibre og snavs fjernes. Ukorrekt rengøring kan resultere i lav kvalitetsbilleder og videoer.
6. Fjern kondens fra rør på sammenkoblingsplade.
   1. Forlade pladen nedad hvilende på linsen papir. I kontrolelementet modulvinduet skal du klikke på manuel tilstand til pladen. Klik på den flydende markering for kolonne 1-4 og 5-8 i afsnittet shear kontrol menu, og vælg 37 ° C fra drop-down menuen. I afsnittet styring af shear sæt flow tilstand til konstant og angive den max shear til 2 dyne/cm² (0,2 Pa) (figur 2A).
   2. Klik på fjorden wells til at starte sterile luftstrømmen gennem grænsefladen plade rør til fjerne kondensvand. Efter 5 min, klik på stopknappen i afsnittet godt plade kontrol (figur 2A). Observere rør i sammenkoblingsplade at bekræfte, at alle kondens er blevet fjernet. Hvis dråberne er stadig synlige, Gentag strømmen af steril luft, som nævnt ovenfor, til en anden 5 min.
      Bemærk: Fjorden rør er knyttet til 0,22 micron filtre til at sikre, at kun sterile luft er introduceret til mikrofluidik system. Strømmen kan overvåges af den begivenhed log på skærmen i vinduet control modulet.
7. 48-godt 0-20 dyne mikrofluid pladen anbringes på stadiet mikroskop.

3. candida albicans Biofilmdannelse i det mikrofluid System

1. For at registrere Biofilmdannelse, tilføje 600 µL af pre varmede RPMI-1640 medium eller spider medium inlet brønde (Se figur 1 for plade layout). Har to flergangsbestemmelser for hver eksperimentelle betingelse.
   1. For at teste Biofilmdannelse af C. albicans tilføje wild-type og mutante stammer, 600 µL Spider medium til indløb pladens huller eksperiment.
   2. For at teste Biofilmdannelse svampemidler (eller andre forbindelser af interesse), tilføje 600 µL af RPMI-1640 medium to brønde (negativ kontrol) og 600 µL af RPMI-1640 medium suppleret med amphotericin B (16 µg/mL) (eller narkotika af valg på ønskede koncentration) to andre inlet brønde.
      Bemærk: For en 12 h biofilm dannelse eksperiment, tilføje 600 µL af pre varmede media inlet brønde. Tilføje yderligere medier (50 µL/h) indløb brønde for længere eksperimenter. Ikke overstige den maksimale lydstyrke af brønden (1.500 µL).
2. Langsomt sænke den rensede sammenkoblingsplade oven på 48 godt mikrofluid plade. Skub sammenkoblingsplade lidt til venstre indtil rør på interfasen plade er placeret på toppen af indsugnings- og udstødningsporte brøndene.

Drej håndtaget på sammenkoblingsplade fra venstre til højre hen til afløse sammenkoblingsplade i holdning, at sikre, at eksperimentet er lufttæt.
Bemærk: Strømmen af steril luft fra rør i sammenkoblingsplade vil presse væsken i inlet eller outlet brøndene (afhængigt af retningen valgt ved hjælp af software på computeren), således at væsken løber gennem gennemsyn kanalen mellem ind- og udløb brønde i tilpassede retning og hastighed dikteres af brugeren.

I afsnittet styring af shear sæt flow tilstand til konstant og angive den max shear til 1 dyne/cm² (0,1 Pa). Klik på fjorden brønde med medier at begynde strømmen af medier fra indløb til outlet wells (figur 2A) til prime kanalen. Efter 5 min Klik på stopknappen i afsnittet godt plade kontrol. Fjerne sammenkoblingsplade og observere mikrofluid plade brønde. Efter grunding kanaler, skal kun en lille dråbe medier være synlig i outlet brønde. Hvis faldet ikke er synlige, førsteklasses kanaler i 2 min ad gangen indtil den lille dråbe medier i outlet brønde er synlige.
Bemærk: Priming er forpligtet til at fjerne luft fra tv-kanaler og sikre, at kanalerne er fyldt med den ønskede medier.

Fjerne sammenkoblingsplade fra mikrofluid pladen og sæt det til side på en steril overflade. Tilføje 50 µL af cellekultur (beskrevet taktfast 1,5) til hver stikkontakt godt.

1. For test C. albicans tilføje wild-type og mutante stammer, 50 µL af wild-type (SC5314) cellekultur i Spider medier til to outlet brønde, bcr1 Δ/Δ i Spider medier to outlet brønde og efg1 Δ/Δ i Spider medier to outlet brønde. Placer sammenkoblingsplade tilbage på mikrofluid pladen og lås låget (Se figur 1 for plade layout).
   Bemærk: Som beskrevet i trin 3.1.1, alle tilsvarende input wells indeholde Spider medier.
2. For at teste C. albicans Biofilmdannelse amphotericin B eller andre sammensatte af interesse, tilføje 50 µL af wild-type (SC5314) cellekultur i RPMI-1640 medium til fire outlet brønde. Placer sammenkoblingsplade tilbage på mikrofluid pladen og lås låget (Se figur 1 for plade layout).
   Bemærk: Som beskrevet i trin 3.1.2, alle tilsvarende input wells indeholde RPMI-1640 medier med og uden amphotericin B eller andre sammensatte af interesse.

I afsnittet styring af shear sæt flow tilstand til konstant og angive den max shear til 2 dyne/cm² (0,2 Pa). Klik på outlet brønde med celler til at starte flow af medier fra indløb til outlet wells (figur 2A) til at starte såning af C. albicans. Efter 3 s Klik på stopknappen i kontrolelementet godt plade sektion til at forhindre cellerne i at angive input brøndene.
Bemærk: Cellerne er flyttet fra outlet brøndene mod fjorden brøndene; Det er vigtigt, at strømmen er stoppet før cellerne når fjorden brønde. Dette sikrer, at inlet brøndene ikke få forurenet med cellekultur og at medierne i inlet wells forbliver sterilt i varigheden af forsøget. Shear kraft og tid, der er baseret på media brugt viskositet og størrelsen på cellerne.

Tillad celler til at forblive stationære med ingen flow (0 dyne/cm²) i 10-20 min i gennemsyn kanalen for første celle overholdelse. Under denne 10-20 min overholdelse af trin, konfigurere computeren til at indfange scenen kamerapositioner og begynde at erhverve pre flush billeder (beskrevet i detaljer i afsnit 4-6).

4. opsætning af fase positioner for mikrofluid eksperiment

Bemærk: Fase positioner og plade kalibrering bør fastsættes lige før du starter eksperimentet. Denne konfiguration giver mulighed for computer til at gemme positioner i hver visning kanal til at indfange billeder under eksperimentet. Mikrofluid plade bør ikke blive forstyrret efter opsætning fase positioner. Hvis pladen er flyttet, vil fase holdninger have til at blive nulstillet før starten af forsøget.

1. Brug visualisering analyse software (se tabel over materialer) til at sætte scenen positioner; hver visning kanal er en fase (1-24) (fig. 1 d) og hver fase har tre sub stadier (1-3) for billedcapture på forskellige positioner langs gennemsyn kanal (figur 1 c). I modulvinduet billeddiagnostiske, skal du åbne modulet 'Flerdimensionel erhvervelse' (MDA) ved at klikke på fanen MDA (figur 2B).
2. I MDA modul skal du klikke på fanen 'Fase' i menuen i venstre side (figur 2B). I afsnittet scene indlæse listen master fase for 48 godt 0 - 20 dyne mikrofluid pladen. Hver visning kanal bør have tre faser for image erhvervelse.
3. Åbn 'Prøve Reload justering' (SRA) og «Flytte Stage til absolutte Position» (kort) moduler ved at klikke på fanen SRA og fanen kort (figur 2B). Tryk på knappen 'Live' at se et billedeksempel med sigtekorn i modulet SRA.
4. Brug joysticket, placere godt pladen sådan at spidsen af pilen (fysisk placeret på pladen) støder op til visning af channel 4 flugter med sigtekornet på software. Tryk på knappen "Sæt oprindelse" (figur 2B) i menuen kort. Den aktuelle position skal nu læse 0 i X, Y og Z.
5. I modulet SRA Klik på afsnittet 'Initial referencepunkter' i menuen til venstre (figur 2B). Klik på 'Indlæse indstillinger' og indlæse filen til 48 godt 0 - 20 dyne mikrofluid pladen.
6. På afsnittet fase i modulet MDA Dobbeltklik på ' scenen holdning 22,2'. Denne holdning viser i midten (sub fase 2) af visning kanalnummer 22. Dette vil bringe lup visning fase og kameraet fokus i umiddelbar nærhed af pilen markøren ved at få vist kanal 22. Brug joysticket, placere godt pladen sådan at spidsen af pilen (fysisk placeret på pladen) støder op til visning af kanal 22 flugter med sigtekornet.
7. Kopiere Y-koordinaten i modulet MDA til Y position i punkt 2 i 'Opdatering referencepunkter' fanen for modulet SRA (figur 2B).
8. Klik på 'Anvend på MDA fase liste' i fanen «Opdatering fase positioner» på SRA (figur 2B).
   Bemærk: Dette vil opdatere alle visning fase positioner i plade (1-24) kalibreres til specifikke mikrofluid plade position på stadiet mikroskop.

Pladen er nu klar til billede erhvervelse og vil bruge kalibreret fase stillinger at bevæge sig samtidig indfange billeder fra tre positioner i alle 24 visning af kanaler.

5. opsætning af erhvervelser til billed fange under mikrofluid eksperiment

1. I modulvinduet billeddiagnostiske bruger modulet MDA og klik på fanen 'Gem' i menuen til venstre (figur 2B). Vælg filnavn for eksperimentet og den omslag hen til opmagasinere de erhvervede billeder på computeren.
2. I modulet MDA, klik på fanen 'Timelapse' i menuen til venstre og placere sig hen til erhverve 145 samlede billeder; indstille timelapse mellem billeder til 5 min. Dette vil resultere i 1 billede hvert 5 min til en 12 h biofilm udvikling eksperiment.
   Bemærk: Tidsintervallet mellem billeder og det samlede antal billeder kan justeres baseret på eksperimentel krav. Hvis imaging længere end 12 h, tilføje yderligere medier inlet brønde på trin 3.1 for at sikre, at brøndene ikke køre tør. For længere eksperimenter tilføje yderligere medier, efter behov (50 µL/h) indløb brønde.
3. Klik på fanen 'bølgelængde' i menuen til venstre (figur 2B) i modulet MDA og indstille antallet af bølgelængden for eksperimentet som 1. Bølgelængden at fange på 50% Brightfield og 50% kamera med en eksponeringstid 12-20 ms, 0,6 gevinst og 20 MHz digitizer.
   Bemærk: Yderligere bølgelængder kan bruges, herunder bølgelængder for fluorescens imaging (for eksempel, vi har med held visualiseret mCherry og normal god landbrugspraksis markeret C. albicans stammer ved hjælp af denne mikrofluid enhed). Parametrene for erhvervelse kan også ændres baseret på eksperimentel krav. For eksempel, at oprette en anden bølgelængde og vælge 'Autofokus på hvert tidspunkt' og en tredje bølgelængde og vælge 'AE på hvert tidspunkt' anbefales til begyndere at maksimere billede erhvervelse muligheder, der er i fokus.
4. Vælg fase listen faner i menuen til venstre i modulet MDA. Stadier 1,1-vil 24,3 blive vist. Én efter én, klik på hvert trin, og bruge indstillingerne fine fokus til manuelt fokus på cellerne i gennemsyn kanalen for hver etape. Når synsfeltet er i fokus, skal du klikke på den sorte pil ved siden af listen fase at opdatere og gemme indstillingerne for hver etape. Computeren vil bruge disse indstillinger for manuelt defineret holdning og fokale for at erhverve billeder på ethvert tidspunkt. Fjern eventuelle ubrugte faser fra listen ved hjælp af 'Fjern' pil.
   Bemærk: Modulet MDA og programmet henviser til visning kanaler som faser flæng, og den samme terminologi er brugt af softwaren.

6. løb mikrofluid eksperiment

1. I modulvinduet billeddiagnostiske bruger modulet MDA Vælg 'Erhverve' at begynde optagelse overholdt celler pre flush for alle underordnede trin (figur 2B).
   Bemærk: Modulvinduet billeddiagnostiske og kameraet kontrol vil nu vise billeder, der er ved at blive fanget og kort, SRA og MDA modulet vil ikke længere være synlige. Billeder taget vil også vise en timer på siden til at angive det billede er fanget og tiden før den næste billed fange cyklus starter. Vente på en runde af billeder til at blive fanget, før du fortsætter til næste trin.
   Bemærk: Brug ikke 'Pause' eller 'Mark Event' knappen på billeddiagnostiske modul vindue skærmen. Fra dette punkt på under eksperimentet, holde musen kun på control modulet vindue på den anden computerskærmen (figur 2A). Det er vigtigt at undgå forstyrrende billeddannelse modulvinduet.
2. I kontrol modul vindue ophold på manuel tilstand til pladen. I afsnittet styring af shear sæt flow tilstand til konstant og angive den max shear til 1 dyne/cm² (0,1 Pa). Klik på outlet wells O1, O7, Ø13 og O19 til begynder strømmen af medier fra indløb til outlet wells (figur 2A) til at fjerne ikke-overholdt celler. Efter 5 min Klik på stopknappen i afsnittet godt plade kontrol. Mulighed for en anden runde af billeder skal erhverves. Billeder kan visualiseres og tid bortfalder kan overvåges på det andet skærmbillede i modulvinduet billeddiagnostiske.
3. I afsnittet styring af shear justere max shear strømmen til 0,5 dyne/cm² (0,5 Pa) ved at klikke på nummeret i max shear kolonne og bruge tastaturet til at indtaste 0,5. Tryk på enter-tasten på tastaturet, og bekræft ændringen i strømningshastigheden i hændelsesloggen i vinduet kontrol modul (figur 2A). Forlade eksperimentet uforstyrret i mørke i 12 timer.
   Bemærk: Eksponering for lys og bevægelse/vibrationer kan alvorligt reducere kvaliteten af billeder erhvervet gennem hele eksperimentet. For enden af mikrofluid eksperiment modulvinduet billeddiagnostiske vil ikke vise nogen billeder og vender tilbage til viser modulerne SRA, kort og MDA. De billeddiagnostiske modul software kan bruges til at se billeder, samle videoer og kvantificere biofilm dannet (beskrevet nedenfor).

7. analysere resultaterne

1. I modulvinduet billeddiagnostiske Vælg 'analyseværktøjer' fanen og klik 'Anmeldelse flerdimensionel Data' (RMD) fra drop down menuen. Klik på 'Vælg Base fil' i modulet RMD. Dette åbner vinduet 'Flerdimensionel datasæt Utilities'.
2. Klik på knappen Vælg mappe og vælge den mappe, som blev brugt til at gemme eksperimentet i trin 5.1. Vælg eksperiment fil log (ND forlængelse) i listen 'Datasæt'. Når loggen er indlæst, skal du klikke på knappen 'Vis'.
3. Vælg bølgelængden ved at klikke på indstillinger i menuen til venstre 'Bølgelængde' og vælg fase stand til at se fra en drop-down menuen. Vælg billedet, der indlæses fra numre på toppen af modulet ved at højreklikke på billede nummer. Når det er valgt, klik på 'load billedet' knappen for at indlæse billederne. Du kan se et billede eller alle billeder på én gang.
4. Vælg alle billeder til at gøre en gang lapse video. De valgte billeder åbner som en video i et nyt vindue. Klik på fanen 'fil' i modulvinduet billeddiagnostiske og vælge 'Gem som' fra drop-down menuen. Gem den deraf følgende video som standardfil (TIFF/MetaSeries).
5. Åbne og indlæse gemte video-fil ved hjælp af ImageJ software. Klik på fanen 'filer' i ImageJ, og klik på 'Gem som'. Vælg ".avi" fra drop-down menuen og Konverter filen til en .avi-fil ved hjælp af JPEG-konvertering til 10 rammer/s.
   Bemærk: Hastigheden af videoen kan justeres ved at ændre rammer/s.
6. For at kvantificere biofilm, Gentag trin 7.2, 7.3 og 7.4.

Vælg det sidste billede (nummer 144) og klik på 'load billedet' knappen for at indlæse billedet. Billedet åbner i et nyt vindue. Klik på knappen 'tærskel billede' og vælg 'Inclusive' tærskel. Flyt markøren, indtil biofilm celler er farvet røde, og regioner med ingen celler er ikke farvet.

Klik på knappen 'Åbn Log' logge målinger (knappen vil vise 'Åbn Log' kun i første omgang, når en log er aktive knappen vil blive omdøbt til ' F9: Log Data'). Vinduet 'Open Data Log' Vælg 'Dynamic Data Exchange' og klik på 'ok.'

I modulvinduet billeddiagnostiske Vælg 'analyseværktøjer' fanen og klik på 'Vis Region statistik'. Dette vil åbne et nyt vindue, der viser målinger fra billedet. Vælg «Hele billedet» i «Foranstaltning» muligheder og klik på ' F9: logdata.» En excel-fil med alle målinger vil blive vist. Find værdierne for "Område" og "Thresholded område" og dividere sidstnævnte med den tidligere at få en numerisk værdi for området besat af biofilm.
Bemærk: 'Område' for hvert billede, der er opnået under eksperimentet er identiske og dermed "Thresholded område" måling kan bruges til at vurdere forskelle i Biofilmdannelse mellem vildtype stammer og mutantstammen eller evaluere effektiviteten af de testede stof på Biofilmdannelse.

Representative Results

Vi udførte mikrofluid biofilm analysen beskrives her ved hjælp af et wild-type C. albicans stamme to medier betingelser (RPMI-1640 og Spider media), wild-type stamme i nærværelse af den kendte svampedræbende stof amphotericin B (16 µg/mL) i RPMI, og to mutantstammen tidligere rapporteret for at have fejl i Biofilmdannelse (bcr1Δ/Δ og efg1 Δ/Δ) i Spider medier.

Video 1 viser udviklingen i en vildtype biofilm i RPMI-1640 medium og virkningerne af de svampedræbende stoffer, amphotericin B, på Biofilmdannelse. Wild-type betingelser, flere celler overholder kraftigt kanalen, cellerne danner hyfer som tiden skrider frem, og en tyk biofilm kan observeres med intercalating hyfer og gær celler. I slutningen af mikrofluid eksperimentet fylder vildtype biofilm helt gennemsyn kanal. Tilstedeværelsen af amphotericin B, men har en udtalt effekt på at reducere biofilm. Specifikt, overholdelse af celler er formindsket, og i modsætning til ubehandlet betingelser, i overværelse af amphotericin B, der kan ses flere celler flyder væk med shear strømmen af medierne. Som tiden skrider frem, celler, der ikke form hyfer og en biofilm er ikke dannet. Disse forskelle er også vist i figur 3, der skildrer 4 tid-point fra assay 0 h, 2 h, 6 h og 12 timer.

Video 2 viser udviklingen i en vildtype biofilm og to tidligere rapporterede biofilm-defekt mutanter (bcr1 Δ/Δ og efg1 Δ/Δ) i Spider medier. Begge bcr1 Δ/Δ og efg1 Δ/Δ stammer Vis alvorligt reducerede Biofilmdannelse i forhold til den isogene vildtype stamme. For efg1 Δ/Δ stamme konstaterede vi, at de overholdt celler ikke udgør hyfer og den resulterende biofilm er alvorligt defekt. For bcr1 Δ/Δ stamme, vi observerede, at ikke blot er bcr1 Δ/Δ stamme defekt i Biofilmdannelse, men det også viser en klar overholdelse defekt, hvor cellerne kan ses drivende i retning af shear flow, som de undlader at overholde de tv-kanal. Disse forskelle er også vist i figur 4, der skildrer 4 tid point fra assay 0 h, 2 h, 6 h og 12 timer.

Figur 1: mikrofluid instrument, der anvendes i dette eksperiment. Panel A viser mikrofluid instrument bruges, bedømmelseskomite B viser sammenkoblingsplade, bedømmelseskomite C viser en skematisk oversigt over en enkelt visning kanal (fase) og tre sub faser fanget af kameraet under eksperimentet, og panel D viser en skematisk oversigt over 48-godt mikrofluid pladen benyttes med en skematisk af luftindtag og -udtag brønde og visningsvinduet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Vælg screenshots af imaging modulesoftware og mikrofluid plade kontrolsystem. Panel A viser den kontrolmodul, der indeholder kontrolelementer til mikrofluid pladen, og panelet B viser modulvinduet billeddiagnostiske, 'Flytte scenen til absolutte Position' (kort) modul, modulet 'Flerdimensionel erhvervelse' (MDA) og modulet 'Prøve Reload justering' (SRA). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: eksponering for amphotericin B resulterer i biofilm dannelse mangler. Tid afhængige visualisering af Biofilmdannelse i RPMI-1640 medier (kolonne 1) og RPMI-1640 medier suppleret med 16 µg/mL amphotericin B (kolonne 2) under dynamiske flow (0,5 dyne/cm²) ved 37 ° C i 12 timer efter tilslutning i mikrofluid systemet. Repræsentative 0 h (efter tilslutning og indledende vask), 2 h, 6 h og 12 h billeder (top til bund) er vist for de isogene vildtype stamme SN250 (kolonner 1 og 2). Skala barer er 20 µm i hvert panel. Tilsvarende tid lapse video af Biofilmdannelse leveres i Video 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Sletning af BCR1 eller EFG1 resulterer i biofilm dannelse defekter. Tid afhængige visualisering af Biofilmdannelse i Spider medier (kolonner 1-3) under dynamiske flow (0,5 dyne/cm²) ved 37 ° C til 12 timer efter tilslutning i mikrofluid systemet. Repræsentative 0 h (efter tilslutning og indledende vask), 2 h, 6 h og 12 h billeder (top til bund) er vist for de isogene vildtype stamme SN250 (kolonne 1), bcr1Δ/Δ stamme (kolonne 2), og efg1 Δ/Δ stamme (kolonne 3). Skala barer er 20 µm i hvert panel. Tilsvarende tid lapse video af Biofilmdannelse leveres i Video 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1: Venligst klik her for at downloade denne fil.

Video 2: Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Tilpasselig mikrofluid biofilm analysen beskrives her giver mulighed for visualisering af Biofilmdannelse i real-tid på en enkelt celle niveau når de udsættes for en fast rente laminar flow og konstant temperatur. Det giver en kraftfuld måde at studere udviklingen af biofilm i wild-type og mutante stammer, og virkningerne af antimikrobiel agent behandlinger på biofilm på betingelser, der efterligner fysiologiske tilstande observeret i kliniske indstillinger. I modsætning til de fleste in vitro- biofilm assays, denne metode giver mulighed for undersøgelse af en tredje biofilm i realtid som danner.

Denne metode kan anvendes på en måde, høj overførselshastighed, hvor op til 24 prøver kan køres samtidig for at vurdere Biofilmdannelse. Metoden kan også bruges til at foretage genetiske skærme af mutant biblioteker til at identificere gener, der er nødvendig for normal biofilm udvikling og kan bruges til at vurdere effektivisering mod biofilm af antimikrobielle forbindelser af interesse i sammensatte bibliotek skærme. Vi forventer, at fremtidige anvendelser af denne mikrofluid enhed vil omfatte sådanne skærme. Vi bemærker imidlertid, at visse stof behandling test vil være begrænset af tykkelsen af den biofilm, dannet ved hjælp af denne mikrofluid enhed som biofilm vokset til > 16 h har tendens til at blokere visning kanal. Således drug test forsøg skal udføres for < 16 h.

Samlet set denne enhed er meget tilpasselig og alsidig, og kan justeres til at vurdere forskellige mikrobielle arter på tværs af kongeriger, strømningshastigheder, temperaturer, inkuberingstider og medier. Den beskrevne metode giver oplysninger om en række forskellige aspekter af Biofilmdannelse, herunder overholdelse af oprindelige celle, biofilm modning og celle spredning. Selv om vi kun indberette resultater for enkelt art Biofilmdannelse her, kunne denne protokol også tilpasses studere dual og blandet arter Biofilmdannelse.

To trin er afgørende for at kunne udføre denne protokol. Først, skal luftbobler i systemet undgås ved forvarmning medierne på den eksperimentelle temperatur. Én fælles fejltrin er fortyndingen af celler i medier, der ikke var forvarmes. Celler skal fortyndes i de samme medier, der bliver brugt til indløb wells. Andet, strømmen af celler fra stikkontakt til indløb brønde skal overvåges nøje; Hvis cellerne flow for langt, indløb medier vil blive forurenet og eksperimentet vil ikke give fortolkelige resultater. På den anden side, hvis cellerne ikke er tilladt at flytte hele vejen ind i den visning, så ingen celler vil være synlige i kanalen under eksperimentet, fører til tomme billeder. Yderligere vigtige punkter at huske er at volume og bevægelse mellem brønde i mikrofluid pladen er knyttet sammen for hver kolonne, og det er vigtigt at bevare så meget media konsistens som muligt (med lignende viskositet, celle tæthed, og sammensætning) og tilsvarende størrelse celler (hvis muligt), som forskellige medier og forskellige cellestørrelser vil have forskellige strømningshastigheder i kolonnen. Under eksperimentet overvåges tilbagestrømning af cellerne ved hjælp af et mikroskop; men kun to kanaler kan ses på én gang (ved hjælp af en 10 X mål). Således, det anbefales at udføre en mock eksperiment for at måle den tid, der kræves til at flyde fra stikkontakt til indløb brønde med celler og medier planlagt til at blive anvendt i den faktiske eksperiment.

I almindelighed, anbefale vi varmt brug af denne mikrofluid biofilm assay som en i vitro assay kan udnyttes før i vivo dyreforsøg. Analysen, er dog stadig en in vitro- analyse, og resultaterne skal valideres i relevante dyremodeller. I vores erfaringer, resultaterne af denne mikrofluid biofilm assay har haft den bedste prædiktive værdi i vivo biofilm assays sammenlignet med andre in vitro- assays har vi vurderet¹⁴.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioFlux 1000z	Fluxion		Automated microfluidic device for live cell analysis
48-well plate 0-20 dyne	Fluxion	910-0047	Microfluidic plate
Montage Software	Fluxion	Version 7.8.4.0	Visualization analysis software
ImageJ Software	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
Yeast Extract	Criterion	C7341
Bacto Peptone	BD Biosciences	211677
Dextrose (D-Glucose)	Fisher Scientific	D163
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	P285-500
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R6504
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183
Nutrient Broth	Criterion	C6471
Difco D-Mannitol	BD Biosciences	217020
Agar	Criterion	C5001
Amphotericin B	Corning	30-003-CF
Sterile Inoculating Loops	VWR	30002-094
Petri Dishes with Clear Lid	Fisher Scientific	FB0875712
Disposable Cuvettes	Fisher Scientific	14-955-127
Lens Paper	VWR	52846-001
Microplate and Cuvette Spectrophotometer	BioTek	EPOCH2TC
Shaking Incubator	Eppendorf	M12820004