Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisatie van Biofilm vorming in Candida albicans met behulp van een geautomatiseerd Microfluidic-apparaat

Published: December 14, 2017 doi: 10.3791/56743
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, School of Natural Sciences, University of California, Merced

Summary

Dit protocol beschrijft het gebruik van een aanpasbaar geautomatiseerde microfluidic apparaat te visualiseren van biofilm vorming in Candida albicans , onder fysiologische omstandigheden van de gastheer.

Abstract

Candida albicans is de meest voorkomende schimmel pathogeen van de mens, veroorzaakt ongeveer 15% van de gevallen van de ziekenhuizen opgelopen sepsis. Een kenmerk van de grote virulentie van C. albicans is haar vermogen om vorm biofilms, gestructureerde gemeenschappen van cellen die zijn gekoppeld aan de biotische en abiotische oppervlakken. C. albicans biofilms kunnen vormen op host weefsels, zoals mucosale lagen, en op medische apparaten, zoals katheters, pacemakers, kunstgebitten en gewrichtsprotheses. Biofilms vormen belangrijke klinische uitdagingen omdat ze zeer resistent tegen fysische en chemische verstoringen zijn, en fungeren kunnen als reservoirs op zaad dat wordt verspreid infecties. Verschillende in vitro testen hebben gebruikt om te bestuderen van de vorming van het C. albicans biofilm, zoals microtiterplaat plaat testen, metingen van het droge gewicht, cel levensvatbaarheid testen en confocale scanning laser microscopie. Al deze testen zijn één eindpunt testen, waar de biofilm vorming is beoordeeld op een specifiek tijdstip. Hier beschrijven we een protocol om te bestuderen van biofilm vorming in real-time met behulp van een geautomatiseerde microfluidic apparaat onder laminaire stromingscondities. Deze methode zorgt voor de waarneming van biofilm vorming zoals de biofilm na verloop van tijd ontwikkelt, met behulp van aanpasbare voorwaarden die die van de host, zoals die ondervonden in vasculaire katheters nabootsen. Dit protocol kan worden gebruikt ter beoordeling van de tekortkomingen van de biofilm van genetische mutanten alsmede de remmende effecten van antimicrobiële agentia over biofilm ontwikkeling in real-time.

Introduction

Candida albicans is een commensale lid van de menselijke microbiota, maar het is ook een opportunistisch pathogeen, kan veroorzaken oppervlakkig en ernstige schimmelinfecties1,2. Een kenmerk van de grote virulentie van C. albicans is haar vermogen om vorm veerkrachtig en resistente biofilms, Gemeenschappen van cellen vastgehouden aan een oppervlak en omsloten door een extracellulaire matrix materiële1,3. C. albicans biofilms zijn zeer gestructureerd, met verschillende lagen van meerdere celtypen (ronde ontluikende gist-formulier cellen, ovale pseudohyphal cellen en tubulaire hyphal cellen)4. C. albicans biofilm ontwikkeling begint met de hechting van de cellen van de ronde gist-vorm op een oppervlak (zaaien de biofilm), gevolgd door de verspreiding van deze cellen op het oppervlak, en vervolgens de rijping van de onrijpe biofilm structureert in een volledig gevormde biofilm die is omgeven door extracellulaire matrix materiële4. De volwassen biofilm is voornamelijk samengesteld uit langgerekte hyphal cellen die dichte en onderling verbonden netwerken vormen, die de architecturale stabiliteit met de biofilm4. Gedurende de hele levenscyclus van biofilm, ronde ontluikende gist cellen verspreiden van de volwassen biofilm, en kunnen reizen naar andere regio's van het lichaam veroorzaken gedissemineerde infecties of zaad nieuwe biofilms op andere sites4,5. C. albicans kan biofilms vormen op biotische oppervlakken, zoals mucosal oppervlakken en in de gehele weefsel van de gastheer, en op abiotische oppervlakken, zoals katheters, pacemakers, kunstgebitten en prothetische gewrichten. Als gevolg van de weerspannige eigenschappen van biofilms, ze zijn uiterst moeilijk uit te roeien, en in veel gevallen is de enige effectieve behandeling strategie verwijderen van de geïnfecteerde apparaat4. Het is dus van cruciaal belang voor het onderzoeken van biofilm vorming onder omstandigheden die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in klinische instellingen.

Er zijn verschillende kritische in vivo dierlijke modellen gebruikt bij het bestuderen van C. albicans biofilm vorming6,7,8; echter, deze studies kunnen worden duur, tijdrovend, en worden beperkt door het aantal stammen en antimicrobiële stoffen die kunnen worden getest op een bepaald moment. In vitro biofilm testen, aan de andere kant, toestaan voor de beoordeling van het snelle, hoge-doorvoer van antischimmel verbindingen en gemuteerde stammen, en zijn veel meer kosteneffectief en ethische dan biofilm testen uitgevoerd out in dierlijke modellen9, 10,11,12,13,14. Hier beschrijven we een in vitro assay die we ontwikkeld en geoptimaliseerd voor het observeren van biofilm vorming stoffelijk onder laminaire stroom met behulp van een aanpasbare microfluidic apparaat14,15. De bepaling voorziet in de visualisatie van elke fase van de vorming van de biofilm, met inbegrip van de naleving van de eerste stap, celproliferatie biofilm rijping en spreiding van de cel. De bepaling is ook handig om te visualiseren cel morfologie wijzigingen in de gehele ontwikkeling van een biofilm.

Microtiterplaat platen, die meestal worden gebruikt voor in vitro biofilm testen, terwijl de hoge doorvoer, toegestaan niet voor gecontroleerde stromingscondities. Traditionele laminaire flow cel systemen voor de continue beoordeling van biofilm vorming in gecontroleerde stromingscondities toestaan, maar deze zijn vaak tijdrovend te zetten en hebben de neiging te hebben beperkt dynamisch bereik controle en doorvoer. Het microfluidic-apparaat gebruikt hier overwint deze beperkingen door een combinatie van hoge-doorvoer platen (met 48 putten) met een ingebouwde laminaire flow kamer en zeer reproduceerbaar, veelzijdig en aanpasbaar.

Hier beschrijven we een protocol voor het gebruik van een commercieel beschikbare geautomatiseerde microfluidic apparaat te beoordelen van biofilm vorming van een wild-type C. albicans stam, de gevolgen van een bekende antimycoticum voor de ontwikkeling van een biofilm, en de biofilm vorming in twee gemuteerde stammen (bcr1Δ/Δ en efg1 Δ/Δ), die eerder werden gemeld dat biofilm gebreken in vitro en in vivo16,17,18. De beschreven protocol kan worden gebruikt voor het testen van de werkzaamheid van antimicrobiële stoffen in de remming van biofilm vorming in de gehele ontwikkeling van een biofilm, en om genen nodig zijn voor normale biofilm ontwikkeling door screening mutant bibliotheken te identificeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. schimmel cel cultuur voorbereiding

Opmerking: De cultuur van de cel van de gedragscode werken (d.w.z. opening cryogene voorraad buizen, cel cultuur buizen en kolven) binnen een kabinet bioveiligheid. Inschakelen van het kabinet ultraviolette (UV) kiemdodende lamp ten minste 1 h voorafgaand aan werk, en uitschakelen van de UV-lamp terwijl actief in het kabinet. Draag handschoenen, veiligheidsbril en passende persoonlijke beschermingsmiddelen, en ontsmetten van het oppervlak van de Bank en de pipetten met 70% ethanol voor de aanvang van het experiment. Gebruik van steriele filter tips en vertrouwdheid met basistechnieken aseptische microbiologische worden aanbevolen.

  1. Streak C. albicans stammen (wild-type, bcr1 Δ/Δ en efg1 Δ/Δ) op gist extract pepton dextrose (YPD) medium (gistextract 1%, 2% pepton, 2% glucose; pH 6.8) agar platen. Incubeer bij 30 ° C gedurende 48 h, volgende microbiologische standaardprocedures19.
  2. Selecteer een enkele geïsoleerde kolonie van de plaat te enten in 4 mL YPD vloeibare voedingsbodem (gistextract 1%, 2% pepton, 2% glucose; pH 6.8) en Incubeer bij 30 ° C met schudden bij 225 t/min in een standaard schudden incubator voor 12-15 h, volgende standaard microbiologische prac tices19.
  3. Bepalen van de celdichtheid van de cultuur door het meten van de optische dichtheid (OD) bij 600 nm in een cuvet (1 mL, 1 cm weglengte), volgende standaard microbiologische praktijken19.
  4. Verdun de cultuur van de cel tot een definitieve OD600 van 0,5, gelijk is aan 2 x 107 cellen/mL, in Roswell Park Memorial Instituut (RPMI)-1640 medium (165 mM 3-morpholinopropane-1-Sulfonzure zuur (MOPS), L-Glutamine, met en zonder natrium bicarbonaat, pH 7,0) of Spider medium (1% nutriënten Bouillon, 1% mannitol, 0,4% K2HPO4, pH 7,2).
    Opmerking: Alternatieve media kan worden gebruikt ter ondersteuning van de specifieke groeisnelheid van stammen van belang.
    Opmerking: Maak geen cel verdunningen te ver van tevoren. Het is raadzaam om te beginnen verdunningen na stap 3.3 (hieronder beschreven) om te voorkomen dat de inleiding van de schimmeldraden vorming vóór cellen worden overgeënt in het weergavekanaal.

2. voorbereiding van de Microfluidic kanalen van de plaat Microfluidic

Opmerking: Raadpleeg de gebruikershandleiding van microfluidic systeem (zie tabel van materialen) voor informatie over de platen en instrument setup.

  1. Vóór het uitvoeren van de microfluidic experiment, warme 20 mL RPMI-1640 medium of Spider media in een incubator bij 37 ° C. Extra media volume kan worden verlangd op basis van berekeningen in stap 2.8. Vooraf opwarming van de aarde media verhindert de vorming van luchtbellen tijdens het experiment.
  2. Schakel het microfluidics-systeem waarin de controller, de twee voedingseenheden, de Microscoop, de camera en computer aangesloten op het systeem. Open de software die het systeem regelt (zie tabel van materialen) in het menu van het programma op de computer. Twee vensters zullen verschijnen zodra het programma wordt geopend.
  3. Zoek het nummer van de streepjescode van de plaat in gebruik en voer het nummer wanneer u wordt gevraagd door de software. Gebruik twee aparte computerschermen om te zien welke software op de twee windows. Één venster (Besturingsmodule) bevat de besturingselementen voor de plaat en het tweede venster (Montage, imaging module) bevat de controles voor de Microscoop en een camera.
  4. Zet de kachel / uit-knop op de controller en het microfluidics systeemtemperatuur instellen tot 37 ° C met behulp van de pijlknoppen op de temperatuur controller.
  5. Reinig de plaat (Figuur 1) van de interface met steriel water als volgt. Spuiten van de onderzijde van de plaat met steriel water en lens papier gebruiken om vuil/stof te verwijderen. Rusten de interface plaat gezicht naar beneden op schone lens papier te droge lucht. Reinig de bovenkant van de plaat van de interface met behulp van 70% isopropanol en lens papier.
    Opmerking: De interface plaat verbindt het microfluidic systeem aan de plaat die de cellen en de media zal bevatten. Ervoor zorgen dat er geen vloeistof blijft en dat alle vezels en vuil worden verwijderd. Onjuiste schoonmaken kan resulteren in lage kwaliteitsbeelden en video's.
  6. Condensatie van de buizen op de plaat interface verwijderen.
    1. Laat de plaat naar beneden het rusten op het papier van de lens. In het besturingselement modulevenster Klik op de handmatige modus voor de plaat. In de controlesectie menu schuintrekken, klikt u op de vloeistof selectie voor de kolommen 1-4 en 5-8 en 37 ° C te selecteren uit het drop-down menu. In de sectie van de controle van de shear, de stroom-modus instelt op constante en stelt de max schuintrekken op 2 dyne/cm2 (0.2 Pa) (figuur 2A).
    2. Klik op de inlaat putten om te beginnen met de stroom van steriele lucht via de interface plaat buizen om condensatie. Na 5 min, klik op de knop stoppen in de controlesectie goed plaat (figuur 2A). Observeer de buizen in de interface plaat om te bevestigen dat alle condensatie is verwijderd. Als druppeltjes nog steeds zichtbaar zijn, herhaalt u de stroom van steriele lucht, zoals hierboven vermeld, voor een ander 5 min.
      Opmerking: De inlaat buizen zijn gekoppeld aan 0,22 micron filters om ervoor te zorgen alleen steriele lucht is ingevoerd om het microfluidics-systeem. De stroom kan worden gecontroleerd door het gebeurtenislogboek op het scherm in het venster controle module.
  7. Plaats de plaat van de microfluidic 48-well 0-20 dyne in het werkgebied van de Microscoop.

3. candida albicans Biofilm vorming in het Microfluidic-systeem

  1. Registreren biofilm vorming, voeg toe 600 µL voorverwarmde RPMI-1640 medium of spin medium aan de putjes van de inlaat (Zie Figuur 1 voor plaat lay-out). Hebben twee replicatieonderzoeken voor elke experimentele voorwaarde.
    1. Voor het testen van biofilm vorming van C. albicans wil wild-type en gemuteerde stammen, 600 µL Spider medium inlaat putjes van de plaat van het experiment.
    2. Voor het testen van biofilm vorming in het bijzijn van schimmeldodende medicijnen (of andere verbindingen van belang), voeg 600 µL van middellange-RPMI-1640 tot twee putten (negatieve controle) en 600 µL van RPMI-1640 medium aangevuld met amfotericine B (16 µg/mL) (of drug van keuze op gewenst concentratie) aan twee andere inlaat putjes.
      Opmerking: Voor een 12u experiment voor de vorming van de biofilm, voeg toe van 600 µL voorverwarmde media aan de inlaat putjes. Toevoegen extra media (50 µL/h) aan de inlaat putten voor langere experimenten. Overschrijd niet de maximale omvang van de put (1.500 µL).
  2. Langzaam lager de schoongemaakte interface plaat op de top van de plaat van 48 goed microfluidic. Schuif de plaat interface enigszins naar links totdat de buizen op de interfase plaat zijn geplaatst op de top van de inlaat en uitlaat putten.
Zet de hendel op de plaat van de interface van links naar rechts om te vergrendelen van de interface-plaat in positie, het waarborgen van het experiment is luchtdicht.
Opmerking: Stroom van steriele lucht van de buizen in de interface plaat zal duwen de vloeistof in de inlaat of uitlaat putten (afhankelijk van de richting gekozen aan de hand van de software op de computer), zodat de vloeistof door het weergavekanaal tussen de inlaat en uitlaat stroomt putten in de aangepaste richting en snelheid gedicteerd door de gebruiker.
  • In de sectie van de controle van de shear, de stroom-modus instelt op constante en stelt de max schuintrekken op 1 dyne/cm2 (0.1 Pa). Klik op inlaat putjes met media om te beginnen de stroom van media van inlaat uitgang putjes (figuur 2A) tot het kanaal prime. Na 5 min Klik op de knop stoppen in de controlesectie goed plaat. Verwijderen van de plaat van de interface en de putjes van de plaat microfluidic observeren. Na de priming de kanalen, moet alleen een kleine daling van media zichtbaar zijn in de outlet-putten. Als de daling niet zichtbaar is, prime de kanalen in 2 min stappen totdat de kleine daling van de media in de outlet-putten zichtbaar is.
    Opmerking: Priming is vereist voor Verwijder lucht uit de kanalen bekijken en ervoor te zorgen dat de kanalen worden gevuld met de gewenste media.
  • De plaat interface verwijderen uit de microfluidic plaat en zet het opzij op een steriele oppervlak. Voeg 50 µL van cultuur van de cel (beschreven in stap 1.5) ook op elk stopcontact.
    1. Voor het testen van C. albicans toevoegen wild-type en gemuteerde stammen, 50 µL van de cultuur van de cel van wild-type (SC5314) in Spider media aan twee outlet wells, bcr1 Δ/Δ in Spider media aan twee putjes van de uitlaat en efg1 Δ/Δ in Spider media aan twee putjes van de outlet. Plaats de interface plaat terug op het bord microfluidic en sluiten van het deksel (Zie Figuur 1 voor plaat lay-out).
      Opmerking: Zoals beschreven in stap 3.1.1, alle bijbehorende input putjes bevatten Spider media.
    2. Voor het testen van C. albicans biofilm vorming in het bijzijn van amfotericine B of andere verbinding van belang, voeg toe 50 µL van de cultuur van de cel van wild-type (SC5314) in RPMI-1640 medium aan vier outlet putjes. Plaats de interface plaat terug op het bord microfluidic en sluiten van het deksel (Zie Figuur 1 voor plaat lay-out).
      Opmerking: Zoals beschreven in stap 3.1.2, alle bijbehorende input putjes bevatten RPMI-1640 media met en zonder amfotericine B of andere verbinding van belang.
  • In de sectie van de controle van de shear, de stroom-modus instelt op constante en stelt de max schuintrekken op 2 dyne/cm2 (0.2 Pa). Klik op outlet putjes met cellen om te beginnen van de stroom van media van inlaat uitgang putjes (figuur 2A) om te beginnen met het zaaien van C. albicans. Na 3 s-klik op de knop stoppen in het besturingselement goed plaat sectie om te voorkomen dat cellen de input putten.
    Opmerking: De cellen worden verplaatst van de putten van de uitlaat naar de inlaat putten; het is essentieel dat de stroom wordt gestopt voordat de cellen de inlaat putten bereiken. Dit zorgt ervoor dat de inlaat putten niet krijgen gecontamineerd met celkweek en dat de media in de inlaat putten steriele voor de duur van het experiment blijft. De shear kracht en de tijd die nodig is gebaseerd op de viscositeit van de media die worden gebruikt en de grootte van de cellen.
  • De cellen stationaire met geen stroom (0 dyne/cm2) gedurende 10-20 min. in het weergavekanaal voor de naleving van de eerste cel blijven toestaan. Tijdens deze 10-20 min naleving stap, instellen van de computer te vangen de camera podium posities en beginnen het verwerven van vooraf flush beelden (beschreven in detail in de secties 4-6).

    • 4. het opzetten van de posities van de fase voor de Microfluidic Experiment

    Opmerking: De podium posities en de kalibratie van de plaat moeten net voordat het experiment worden ingesteld. Deze instelling kan de computer voor het opslaan van de standpunten van elke weergavekanaal voor het vastleggen van de beelden tijdens het experiment. De microfluidic plaat moet niet gestoord worden na het opzetten van het podium posities. Als de plaat wordt verplaatst, posities van de fase zal hoeven worden gereset voordat de start van het experiment.

    1. Gebruik de software van de analyse van de visualisatie (zie tabel van materialen) aan het decor posities; elke weergavekanaal is een stadium (1-24) (Figuur 1 d) en elke fase heeft drie sub fasen (1-3) voor het vastleggen van het beeld op verschillende posities langs het weergavekanaal (Figuur 1 c). In de beeldvorming modulevenster, opent u de module 'Multidimensionale verwerving' (MDA) door te klikken op het tabblad MDA (figuur 2B).
    2. In de MDA module Klik op het tabblad 'On-stage' in het menu aan de linker kant (figuur 2B). In de sectie fase laden de lijst basispagina fase voor de 48 goed 0 - 20 dyne microfluidic plaat. Elke weergavekanaal moeten drie stadia voor Beeldacquisitie.
    3. Open het "Monster Reload aanpassing" (SRA) en 'Fase verplaatsen naar Absolute positie' (kaart) modules door te klikken op het tabblad SRA en de kaart (figuur 2B). Druk op de knop 'Live' om een voorvertoning van de afbeelding met crosshairs in de module SRA.
    4. De goed plaat met behulp van de joystick positie zodanig dat het uiteinde van de pijl (fysiek bevindt op de plaat) grenzend aan het bekijken van kanaal 4 wordt uitgelijnd met het vizier op de software. In het menu van de kaart, druk op 'Set oorsprong' (figuur 2B). De huidige positie moet nu lezen 0 in X, Y en Z.
    5. Klik in de module SRA op het gedeelte van de 'Eerste referentiepunten' in het linkermenu (figuur 2B). Klik op 'Instellingen laden' en laad het bestand voor de 48 goed 0 - 20 dyne microfluidic plaat.
    6. Dubbelklik op de sectie van de fase van de MDA module, op ' fase positie 22,2'. Deze positie geeft het midden (sub fase 2) van het bekijken kanaalnummer 22. Dit zal de Microscoop bekijken fase en de focus van de camera in de onmiddellijke nabijheid tot de markeerdraad pijl door het bekijken van kanaal 22. De goed plaat met behulp van de joystick positie zodanig dat het uiteinde van de pijl (fysiek bevindt op de plaat) grenzend aan het bekijken van kanaal 22 uitgelijnd op het vizier.
    7. Kopieer de Y-coördinaat in de MDA module naar de Y-positie van punt 2 in het tabblad 'Update referentiepunten' van de SRA-Module (figuur 2B).
    8. In het tabblad 'Update podium posities' van de SRA, klik op 'Toepassen aan MDA fase lijst' (figuur 2B).
      Opmerking: Dit zal bijwerken alle podium posities in de plaat (1-24) worden gekalibreerd naar de specifieke microfluidic plaat positie in het werkgebied van de Microscoop te bekijken.
    De plaat is nu klaar voor Beeldacquisitie en zal gebruik maken van de gekalibreerde podium posities te verplaatsen tijdens het vastleggen van beelden van drie posities in alle 24 kanalen bekijken.

    5. opzetten van acquisities voor beeld vangen tijdens het Experiment Microfluidic

    1. In de beeldvorming venster van de module, de MDA-module gebruiken en klik op het tabblad 'Opslaan' in het linkermenu (figuur 2B). Selecteer de bestandsnaam voor het experiment en de map afbeeldingen op te slaan de verworven op de computer.
    2. Klik op het tabblad 'Timelapse' in het linkermenu in de MDA-module, en stel het verwerven van 145 totale beelden; Stel de timelapse tussen afbeeldingen aan 5 min. Dit zal resulteren in 1 beeld elke 5 min voor een 12u biofilm ontwikkeling experiment.
      Opmerking: Het tijdsinterval tussen de beelden en het totale aantal beelden kan worden aangepast op basis van experimentele eisen. Als imaging voor meer dan 12 h, extra media toevoegen aan de inlaat putten bij stap 3.1 om ervoor te zorgen dat de putten Voer niet droog. Voor langere experimenten extra media toevoegen, zo nodig (50 µL/h) aan de inlaat putten.
    3. In de module MDA, klik op het tabblad 'golflengten' in het linkermenu (figuur 2B) en stel het aantal golflengte voor het experiment als 1. Instellen van de golflengte te vangen op 50% helderveld en 50% Camera met een belichtingstijd van 12-20 ms, 0.6 winst en 20 MHz digitizer.
      Opmerking: Extra golflengten kunnen worden gebruikt, met inbegrip van golflengten voor fluorescentie beeldvorming (bijvoorbeeld, we hebben met succes gevisualiseerd mCherry en GFP gelabeld C. albicans stammen met behulp van dit microfluidic apparaat). De parameters van de overname kunnen ook worden gewijzigd op basis van experimentele eisen. Bijvoorbeeld, het opzetten van een tweede golflengte en selecteren 'Autofocus op elke Timepoint' en een derde golflengte en selecteren 'Automatische belichting op elke Timepoint' wordt aanbevolen voor beginners om te maximaliseren afbeelding overname-opportuniteiten die in focus zijn.
    4. Selecteer in de module MDA de tabbladen lijst fase in het linkermenu. Stadia 1,1 – wordt 24,3 getoond. Één voor één, klik op elk stadium, en met de fijne focus instellingen kunt handmatig scherpstellen op de cellen in het weergavekanaal voor iedere fase. Zodra het gezichtsveld in beeld is, klikt u op de zwarte pijl naast de lijst van de etappe te actualiseren en het opslaan van de instellingen voor elke fase. De computer zal deze positie handmatig gedefinieerde instellingen en focale instellingen gebruiken voor het verkrijgen van beelden op elk punt van de tijd. Verwijder alle ongebruikte fasen uit de lijst met behulp van de pijl 'Verwijderen'.
      Opmerking: De MDA module en het programma verwijzen naar kanalen bekijken als fases door elkaar, en dezelfde terminologie wordt gebruikt door de software.

    6. het uitvoeren van de Microfluidic Experiment

    1. In de beeldvorming venster van de module, met behulp van de module MDA, selecteer 'Ophalen' om te beginnen met het vastleggen van vooraf flush beelden van zelfklevend cellen voor alle sub-fasen (figuur 2B).
      Opmerking: Het modulevenster beeldvorming en de besturingselementen van de camera is nu zichtbaar afbeeldingen dat zijn wordt vastgelegd en de module kaart, SRA en MDA is niet langer zichtbaar. De beelden ziet ook een timer aan de kant, om aan te geven van het nummer van de afbeelding wordt vastgelegd en de time-lapse voordat de volgende beeld vastleggen cyclus zal beginnen. Wachten op een ronde van beelden worden vastgelegd voordat u verdergaat met de volgende stap.
      Opmerking: Gebruik niet de knoppen 'Pause' of 'Mark Event' op de imaging module venster scherm. Vanaf dit punt tijdens het experiment, houd de muis alleen op het venster van de module van het besturingselement op het tweede scherm (figuur 2A). Dit is belangrijk om verstoring van de beeldvorming modulevenster.
    2. In de control module venster verblijf op de handmatige modus voor de plaat. In de sectie van de controle van de shear, de stroom-modus instelt op constante en stelt de max schuintrekken op 1 dyne/cm2 (0.1 Pa). Klik op outlet putjes O1, O7, O13 en O19 om te beginnen de stroom van media van inlaat uitgang putjes (figuur 2A) voor het verwijderen van niet-naleving cellen. Na 5 min Klik op de knop stoppen in de controlesectie goed plaat. Toestaan voor een tweede ronde van beelden aan te schaffen. Afbeeldingen kunnen worden gevisualiseerd en de tijdspanne kan worden gecontroleerd op het tweede scherm in het modulevenster beeldvorming.
    3. Pas in de sectie van de controle van de shear, de stroom max Schuintrekken 0.5 dyne/cm2 (0,5 Pa) door te klikken op het nummer in het veld max schuintrekken kolom en 0,5 invoeren met het toetsenbord. Druk op de enter-toets op het toetsenbord en bevestig de verandering in debiet in het gebeurtenislogboek in het venster van controle module (figuur 2A). Laat het experiment ongestoord in het donker voor 12u.
      Opmerking: Blootstelling aan licht en beweging/trillingen kunnen ernstig verminderen van de kwaliteit van de beelden verkregen gedurende het gehele experiment. Aan het einde van de microfluidic experiment, het imaging modulevenster afbeeldingen niet weergegeven en weer terug naar de SRA, kaart en MDA modules tonen. De beeldbewerkingssoftware module kan worden gebruikt om te bekijken van de beelden, de video's monteren en kwantificeren van de biofilms gevormd (hieronder beschreven).

    7. het analyseren van de resultaten

    1. In de beeldvorming modulevenster, selecteer het tabblad 'analysetools' en klik op 'Review multidimensionale gegevens' (RMD) vanuit naar de waterdruppel waas spijskaart. Klik op 'Selecteer Base File' in de module RMD. Dit opent het venster 'Multidimensionale gegevensset Utilities'.
    2. Klik op de knop 'Selecteer map' en kies de map, die werd gebruikt voor het opslaan van het experiment in stap 5.1. Selecteer in de lijst 'Data Sets' het experiment bestand logboek (met de extensie .nd). Zodra het logboek wordt geladen, klik op de knop 'weergave'.
    3. Selecteer de golflengte door te klikken op de opties in het menu links 'Golflengten' en kies de fase positie om weer te geven uit een drop-down menu. Kies de afbeelding te laden van de nummers op de bovenkant van de module door met de rechtermuisknop op het nummer van de afbeelding. Zodra geselecteerd, klik op de knop 'laden afbeelding(en)' voor het laden van de beelden. U kunt een afbeelding of alle afbeeldingen tegelijk bekijken.
    4. Selecteer alle afbeeldingen om een time-lapse video. De geselecteerde afbeeldingen wordt als een video in een nieuw venster geopend. Klik op het tabblad 'bestand' in het modulevenster beeldvorming en kies 'opslaan als' uit het drop-down menu. De resulterende video opslaan als het standaardbestand (TIFF/gebaseerd).
    5. Open en laad de opgeslagen video bestand met behulp van ImageJ software. In ImageJ, klik op het tabblad 'bestand' en klik op 'opslaan als'. Kies ".avi" uit het drop-down menu en converteer het bestand naar een AVI-bestand met behulp van de JPEG-conversie ingesteld op 10 frames per seconde.
      Opmerking: De snelheid van de video kan worden aangepast door het veranderen van de frames/s.
    6. Om te kwantificeren biofilms, herhaal stap 7.2, 7.3 en 7.4.
    Kies de laatste afbeelding (nummer 144) en klik op 'load afbeelding(en)' knop om de afbeelding te laden. De afbeelding wordt geopend in een nieuw venster. Klik op de knop 'drempel afbeelding' en selecteer 'Inclusive' drempel. De cursor verplaatsen totdat de biofilm cellen zijn rood gekleurd, en regio's met geen cellen zijn niet gekleurd.
  • Klik op de knop 'Open logbestand' te melden metingen (de knop 'Open logbestand' alleen in eerste instantie wordt weergegeven; zodra een logboek actief is de knop zal worden omgedoopt tot ' F9: logboekgegevens '). Selecteer in het venster 'Open Data Log' 'Dynamic Data Exchange' en klik op 'ok'.
  • In de beeldvorming modulevenster, selecteer het tabblad 'analysetools' en klik op 'Toon regio statistieken'. Dit opent een nieuw venster weergeven van metingen van de afbeelding. Selecteer 'Hele afbeelding' in de 'Maatregel' beschikbare opties en klik op ' F9: logboekgegevens.' Een excel-bestand met alle metingen wordt getoond. Zoek de waarden voor 'Area' en ' Thresholded' en de laatste wordt gedeeld door de voormalige om een numerieke waarde voor het gebied bezet door de biofilm te verkrijgen.
    Opmerking: De "ruimte" voor elke afbeelding verkregen tijdens het experiment is identiek en dus de meting van de "Thresholded ruimte" kan worden gebruikt voor de evaluatie van de verschillen in de biofilm formatie wild-type stammen en gemuteerde stammen of de doeltreffendheid van de geteste drug op biofilm vorming.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Wij uitgevoerd de microfluidic biofilm assay beschreven hier met behulp van een wild-type C. albicans stam onder twee media voorwaarden (RPMI-1640 en Spider media), de stam van de wild-type in het bijzijn van de bekende antischimmel drug amfotericine B (16 µg/mL) in RPMI, en twee gemuteerde stammen eerder gemeld dat gebreken in de formatie van de biofilm (bcr1Δ/Δ en efg1 Δ/Δ) in Spider media.

    Video 1 toont de ontwikkeling van een biofilm wild-type in RPMI-1640 medium en de effecten van de antischimmel drug, amfotericine B, over biofilm vorming. Wild-type, meerdere cellen sterk vasthouden aan het kanaal, de cellen vormen schimmeldraden naarmate de tijd vordert, en voorwaarden een dikke biofilm kan worden waargenomen met intercalating schimmeldraden en gist cellen. Tegen het einde van het experiment van de microfluidic vult de wild-type biofilm volledig het weergavekanaal. De aanwezigheid van amfotericine B, heeft echter een uitgesproken invloed op de vermindering van de biofilm. In het bijzonder de hechting van de cellen is verminderd en, in tegenstelling tot onbehandeld voorwaarden, in aanwezigheid van amfotericine B, meerdere cellen kunnen worden gezien stroomt weg met de stroom van de afschuiving van de media. Als de tijd vordert, de cellen niet formulier schimmeldraden en een biofilm is niet gevormd. Deze verschillen worden ook weergegeven in Figuur 3, die 4 tijd-punten van de bepaling op 0 h, 2 h, 6 h en 12 h toont.

    Video 2 toont de ontwikkeling van een biofilm wild-type en twee eerder biofilm-defecte mutanten (bcr1 Δ/Δ en efg1 Δ/Δ) in Spider media gemeld. Beide bcr1 Δ/Δ en efg1 Δ/Δ-stammen Toon ernstig verminderde biofilm formatie ten opzichte van de isogene stam van de wild-type. Voor de efg1 Δ/Δ stam vastgesteld we hebben dat de zelfklevend cellen geen schimmeldraden vormen en de resulterende biofilm ernstig defect. Voor de bcr1 Δ/Δ stam, we waargenomen dat niet alleen is de stam van bcr1 Δ/Δ defect in de biofilm vorming, maar ook geeft een duidelijke naleving defect, waar cellen kunnen worden gezien in de richting van de stroom van de shear drijven als ze niet te houden aan de weergavekanaal. Deze verschillen worden ook weergegeven in Figuur 4, waarin 4 punten van de tijd van de bepaling op 0 h, 2 h, 6 h en 12 h.

    Figure 1
    Figuur 1: Microfluidic-instrument gebruikt in dit experiment. Paneel A toont het microfluidic instrument gebruikt, deelvenster B de interface plaat toont, deelvenster C toont een schematisch overzicht van een enkele weergavekanaal (stage) en drie sub-fasen gevangen genomen door de camera tijdens het experiment, en paneel D toont een schematisch overzicht van de 48-well microfluidic plaat gebruikt met een schematische voorstelling van de uitlaat en inlaat wells en kijkvenster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Figure 2
    Figuur 2: Selecteer screenshots van modulesoftware en microfluidic plaat imaging controleregeling. Deelvenster A toont de controlemodule, met de besturingselementen voor de microfluidic plaat, en paneel B toont het imaging venster van de module, de 'verplaatsen etappe naar Absolute positie' (kaart) module, de 'Multidimensionale verwerving' (MDA) module, en de module 'monster Reload aanpassing"(SRA). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Figure 3
    Figuur 3: blootstelling aan amfotericine B resulteert in een biofilm vorming gebreken. Tijd afhankelijk visualisatie van biofilm vorming in RPMI-1640 media (kolom 1), en RPMI-1640 aangevuld met 16 µg/mL amfotericine B (kolom 2) onder dynamische flow (0.5 dyne/cm2) bij 37 ° C gedurende 12 h na naleving in het microfluidic-systeem. Representatieve 0 h (na hechting en eerste wash), 2 h, 6 h en 12 h beelden (boven naar beneden) worden weergegeven voor de isogene wild-type stam SN250 (kolommen 1 en 2). Schaal bars zijn 20 µm in elk deelvenster. Overeenkomstige tijd vervallen video's van biofilm vorming vindt u in de Video 1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Figure 4
    Figuur 4: Verwijdering van BCR1 of EFG1 resulteert in een biofilm vorming gebreken. Tijd afhankelijk visualisatie van biofilm vorming in Spider media (kolommen 1-3) onder dynamische flow (0.5 dyne/cm2) bij 37 ° C voor 12u na vasthouden in het microfluidic-systeem. Representatieve 0 h (na hechting en eerste wash), 2 h, 6 h en 12 h beelden (boven naar beneden) worden weergegeven voor de isogene wild-type stam SN250 (kolom 1), bcr1Δ/Δ stam (kolom 2), en efg1 Δ/Δ stam (kolom 3). Schaal bars zijn 20 µm in elk deelvenster. Overeenkomstige tijd vervallen video's van biofilm vorming vindt u in de Video 2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Video 1: Klik hier om dit bestand te downloaden.

    Video 2: Klik hier om dit bestand te downloaden.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    De aanpasbare microfluidic biofilm assay hier beschreven staat voor de visualisatie van biofilm vorming in real time op het niveau van een eencellige wanneer blootgesteld aan een vaste rente laminaire flow en constante temperatuur. Het biedt een krachtig instrument om te bestuderen van de ontwikkeling van biofilms bij wild-type en gemuteerde stammen en de effecten van antimicrobiële agent behandelingen op biofilms onder omstandigheden die fysiologische omstandigheden nabootsen waargenomen in klinische instellingen. In tegenstelling tot de meeste in vitro biofilm testen, deze methode die geschikt is voor de behandeling van een ontwikkelende biofilm in real-time omdat het uitmaakt.

    Deze methode kan worden gebruikt in een high-throughput wijze, waar maximaal 24 monsters kunnen gelijktijdig worden uitgevoerd om te kunnen beoordelen van biofilm vorming. De methode kan ook worden gebruikt om genetische schermen van mutant bibliotheken om genen nodig zijn voor normale biofilm ontwikkeling te identificeren en kan worden gebruikt voor het beoordelen van de effectiviteit tegen biofilms van antimicrobiële verbindingen van belang in samengestelde bibliotheek schermen. We anticiperen op toekomstige toepassingen van dit microfluidic apparaat zal bevatten dergelijke schermen. Wij constateren echter dat bepaalde drug behandeling testen zal worden beperkt door de dikte van de biofilm gevormd met behulp van dit microfluidic apparaat als biofilms gekweekt voor > 16 h de neiging om het weergavekanaal verstoppen. Dus, drug testende experimenten zal moeten worden uitgevoerd voor < 16 h.

    Globaal, dit apparaat is zeer aanpasbaar en veelzijdig, en kan worden aangepast om te beoordelen van verschillende soorten van de microbiële over koninkrijken, debiet, temperatuur, incubatie tijden en media. De beschreven methode bevat informatie over een aantal verschillende aspecten van biofilm vorming, met inbegrip van de naleving van de eerste cel, biofilm rijping en versnippering van de cel. Hoewel wij alleen resultaten voor één soort biofilm vorming hier rapporteren, kan dit protocol ook worden aangepast aan het bestuderen van dual - en gemengd-soorten biofilm vorming.

    Twee stappen zijn cruciaal voor het succesvol uitvoeren van dit protocol. Eerst, luchtbellen in het systeem moeten worden vermeden door de media op de experimentele temperatuur voorverwarmen. Één gemeenschappelijke misstap is de verdunning van de cellen in de media dat was niet voorverwarmd. Cellen moeten worden verdund in dezelfde media die wordt gebruikt voor de inlaat putten. Ten tweede, de stroom van cellen uit stopcontact bij inlaat putten moeten zorgvuldig worden gecontroleerd; de cellen doorlopen te ver, zal de inlaat media besmet raken en het experiment niet interpreteerbaar resultaten zal opleveren. Aan de andere kant, als de cellen niet mogen helemaal naar het weergavekanaal, dan geen cellen zichtbaar in het kanaal tijdens het experiment zijn zal, leiden tot lege beelden. Extra belangrijke punten in gedachten te houden dat het volume en beweging tussen putten in de microfluidic plaat met elkaar voor elke kolom verbonden zijn, en het is belangrijk om de consistentie van zo veel media mogelijk zijn (met soortgelijke viscositeit, celdichtheid, en samenstelling) en ook cellen (indien mogelijk), aangezien verschillende media en andere cel maten verschillende debieten in de kolom hebben zal. Tijdens het experiment, wordt de terugvoer van de cellen gecontroleerd met behulp van een Microscoop; echter kunnen slechts twee kanalen worden bekeken op een bepaald moment (met behulp van een 10 X doelstelling). Dus, het is sterk aanbevolen om het uitvoeren van een mock experiment voor het meten van de tijd die nodig is te stromen uit stopcontact aan inlaat putjes met behulp van de cellen en media gepland om te worden gebruikt in de werkelijke experiment.

    We raden in het algemeen gebruik van deze microfluidic biofilm test als een in vitro assay te worden gebruikt voor in vivo dierproeven. De assay, is echter nog steeds een in vitro assay en resultaten zullen moeten worden gevalideerd in relevante diermodellen. In onze ervaringen, de resultaten van deze test van de biofilm microfluidic de beste voorspellende waarde hebben gehad voor in vivo biofilm testen in vergelijking met andere tests in vitro wij14hebben beoordeeld.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Clarissa J. Nobile is een van de oprichters van BioSynesis, Inc., een bedrijf ontwikkelen remmers en diagnostiek van C. albicans biofilms.

    Acknowledgments

    Wij danken alle leden van de lab Nobile voor nuttige discussies over biofilm testen. Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidie R21 AI125801 (C.J.N.). D.L.R. werd gesteund door een doctoral beurs van de Universiteit van California Institute voor Mexico en de Verenigde Staten (UC-MEXUS) en de Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BioFlux 1000z Fluxion Automated microfluidic device for live cell analysis
    48-well plate 0-20 dyne Fluxion 910-0047 Microfluidic plate
    Montage Software Fluxion Version 7.8.4.0 Visualization analysis software
    ImageJ Software NIH https://imagej.nih.gov/ij/
    Yeast Extract Criterion C7341
    Bacto Peptone BD Biosciences 211677
    Dextrose (D-Glucose) Fisher Scientific D163
    Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific P285-500
    RPMI-1640 Sigma-Aldrich R6504
    MOPS Sigma-Aldrich M3183
    Nutrient Broth Criterion C6471
    Difco D-Mannitol BD Biosciences 217020
    Agar Criterion C5001
    Amphotericin B Corning 30-003-CF
    Sterile Inoculating Loops VWR 30002-094
    Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
    Disposable Cuvettes Fisher Scientific 14-955-127
    Lens Paper VWR 52846-001
    Microplate and Cuvette Spectrophotometer BioTek EPOCH2TC
    Shaking Incubator Eppendorf M12820004

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
    2. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
    3. Fox, E. P., Nobile, C. J. Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. , Nova Science Publishers. 1-24 (2013).
    4. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
    5. Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
    6. Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
    7. Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
    8. Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
    9. Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
    10. Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
    11. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
    12. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
    13. Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
    14. Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
    15. Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
    16. Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
    17. Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
    18. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
    19. Baker, K. At the bench: A laboratory navigator. 27, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

    Tags

    Besmettelijke ziekten kwestie 130 Biofilm Candida albicans visualisatie microfluidic apparaat in vitro biofilm testen biofilm methoden biofilm protocollen biofilm schermen laminaire flow
    Visualisatie van Biofilm vorming in <em>Candida albicans</em> met behulp van een geautomatiseerd Microfluidic-apparaat
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, … More

    Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (130), e56743, doi:10.3791/56743 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter