Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Визуализация биопленки в Candida albicans с помощью автоматизированных Microfluidic устройства

Published: December 14, 2017 doi: 10.3791/56743
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, School of Natural Sciences, University of California, Merced

Summary

Этот протокол описывает использование настраиваемых автоматических microfluidic устройства визуализировать биопленки в Candida albicans физиологических условиях пребывания.

Abstract

Candida albicans является наиболее распространенным грибкового патогена людей, вызывая около 15% случаев внутрибольничных сепсиса. Основные вирулентности атрибут C. albicans является его способность формы биопленки, структурированные общины клеток, придает поверхности биотических и абиотических. C. albicans биоплёнки могут образовывать на хост тканей, таких как слои слизистой оболочки и медицинских устройств, таких как катетеры, кардиостимуляторов, протезы и совместного протезы. Биоплёнки ставят значительные клинические потому, что они обладают высокой устойчивостью к физическим и химическим возмущения и может выступать в качестве резервуаров для семян распространение инфекции. Различные анализы в vitro были использованы для изучения C. albicans биопленки, например микротитровальных пластина анализов, сухой вес измерений, анализов жизнеспособность клеток и сканирования Конфокальная лазерная микроскопия. Все эти анализы являются анализы одной конечной точки, где биопленки оценивается в конкретный момент. Здесь мы описываем протокол для изучения биопленки в режиме реального времени с помощью автоматизированных microfluidic устройства условиях ламинарного потока. Этот метод позволяет для наблюдения за биопленки как биопленки развивается с течением времени, используя настраиваемые условия, которые сходны принимающей таких возникающих в сосудистых катетеров. Этот протокол может использоваться для оценки дефектов биопленки генетических мутантов, а также тормозящее действие антимикробных агентов на развитие биопленки в режиме реального времени.

Introduction

Candida albicans является членом синантропных человека микробиоты, однако это также оппортунистических патогенов, способных привести к поверхностным и тяжелой грибковой инфекции1,2. Основные вирулентности черта C. albicans является его способность формы эластичного и лекарственно биопленки, общины клеток присоединились к поверхности и заключены в внеклеточного матрикса материала1,3. C. albicans биоплёнки хорошо структурированный, содержащих несколько слоев из нескольких типов клеток (раунд многообещающий дрожжей формы клетки, овальные pseudohyphal клеток и трубчатых клетки ГИФ)4. C. albicans биопленки развития начинается именно с соблюдения раунда дрожжей форма клеток на поверхности (посев биопленки), следуют распространения этих клеток на поверхности, и затем созревания незрелых биопленки структуры в полностью сформирована биопленки, которая окружена внеклеточной матрицы материалов4. Зрелые биопленки преимущественно состоит из удлиненных гиф клеток, которые образуют плотные и смежные сети, обеспечивая архитектурных стабильность биопленки4. На протяжении всего жизненного цикла биопленки раунд многообещающий дрожжи клетки расходятся от зрелых биопленки и могут путешествовать в другие регионы тела, чтобы вызвать распространение инфекции или семян новых биопленки на других сайтах4,5. C. albicans может формировать биоплёнки на биотические поверхностях, таких как слизистой поверхности и во всей ткани макроорганизма и на абиотические поверхностях, таких как катетеры, кардиостимуляторов, протезы и протезирование суставов. Благодаря непокорных свойства биопленки они чрезвычайно трудно искоренить, и во многих случаях стратегия только эффективного лечения является удаление инфицированного устройства4. Таким образом важно расследовать биопленки в условиях, аналогичных тем, которые наблюдаются в клинических условиях.

Есть несколько критических в vivo животных моделей для изучения C. albicans биопленки формирования6,,78; Однако эти исследования может быть дорогостоящим, требует много времени и ограничивается количество штаммов и противомикробных препаратов, которые могут быть проверены в любой момент времени. В vitro биопленки, с другой стороны, позволяют для быстрой и высок объём оценки противогрибковые соединений и мутантных штаммов и гораздо более экономически эффективным и этические чем биопленки анализов осуществляется вне в животных моделей9, 10,11,12,,1314. Здесь мы описываем assay в пробирке , который мы разработали и оптимизированы, чтобы наблюдать биопленки височно под ламинарным потоком с помощью настраиваемых microfluidic устройства14,15. Assay позволяет для визуализации каждого этапа биопленки, включая первоначальный присоединение шаг, пролиферации клеток, биопленки созревания и дисперсия клеток. Assay полезен также визуализировать изменения морфологии клеток на протяжении развития биопленки.

Микротитровальных плиты, которые обычно используются в vitro биопленки анализов, при высокой пропускной способности, не предусматривают условий контролируемого потока. Традиционные Ламинарные системы позволяют для непрерывной оценки биопленки в условиях контролируемого потока, но они часто много времени и, как правило, имеют ограниченный динамический диапазон управления и пропускную способность. Microfluidic устройство использованы здесь преодолевает эти ограничения путем сочетания высокой пропускной способности пластины (содержащий 48 скважин) с встроенным ламинарные камеры и воспроизводимость, универсальные и настраиваемые.

Здесь мы описываем протокол для использования коммерчески доступных автоматизированных microfluidic устройства для оценке биопленки одичал тип C. albicans напрягаться, воздействие известных противогрибковые агента на развитие биопленки и биопленки формирование в двух мутантных штаммов (bcr1Δ/Δ и efg1 Δ/Δ), о которых сообщалось ранее иметь биопленки дефекты in vitro и in vivo16,,17-18. Описывается протокол может использоваться для проверить эффективность антимикробных агентов в подавлении биопленки в ходе разработки биопленки и для идентификации генов, необходимых для нормального биопленки развития путем проведения скрининга мутантов библиотек.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка грибные клетки культуры

Примечание: Поведения клеточной культуры работы (т.е. Открытие криогенных запасов трубы, трубы культуры клеток и колбы) в пределах биобезопасности кабинета. Включите кабинет ультрафиолетового (УФ) бактерицидные лампы по крайней мере 1 час до работы и отключите УФ-лампа активно работая в кабинете министров. Надевайте перчатки, защитные очки и надлежащие средства личной защиты и обеззараживанию поверхности скамьи и пипетки с 70% этанол до начала эксперимента. Рекомендуется использовать стерильные фильтр советы и знакомство с основными асептических микробиологических методов.

  1. Полоска C. albicans штаммов (одичал тип, bcr1 Δ/Δ и efg1 Δ/Δ) на дрожжевой экстракт Пептон Декстроза (YPD) среднего (экстракт дрожжей 1%, 2% Пептон, 2% глюкозы; рН 6,8) плиты агара. Инкубируйте на 30 ° C в течение 48 ч, следующие стандартные микробиологических методов19.
  2. Выберите один изолированной колонии от пластины для прививок в 4 мл жидкой среды YPD (экстракт дрожжей 1%, 2% Пептон, 2% глюкозы; рН 6,8) и Инкубируйте на 30 ° C с встряхивания на 225 rpm в стандарт, пожимая инкубатор для 12-15 ч, следующие стандартные микробиологических прак Tices19.
  3. Определить плотность клеток культуры путем измерения оптической плотности (OD) на 600 Нм в кювет (1 мл, 1 см длины пути), следующий стандарт микробиологических методов19.
  4. Разбавить клеточной культуры до окончательного ОД600 0.5, эквивалентно 2 x 107 кл/мл, в Розуэлле парк Мемориальный институт (RPMI)-1640 среднего (содержащие 165 мм 3-morpholinopropane-1-сульфокатиониты кислота (МОПЫ), L-глютамин и без натрия бикарбонат, pH 7.0) или средний паук (питательный бульон 1%, 1% маннит, 0,4% K2HPO4, pH 7.2).
    Примечание: Альтернативные средства массовой информации может использоваться для поддержки роста конкретных штаммов интерес.
    Примечание: Не делайте клеток разведений слишком далеко заранее. Рекомендуется начать разведений после шага 3.3 (описанные ниже) для того, чтобы предотвратить начало формирования гифы до клетки, будучи посеяны в канал просмотра.

2. Подготовка Microfluidic каналов Microfluidic пластины

Примечание: Обратитесь к руководству пользователя microfluidic системы (см. таблицу материалов) для получения информации о пластин и инструмент установки.

  1. Перед запуском microfluidic эксперимент, теплый 20 мл RPMI 1640 СМИ или паука СМИ в инкубаторе при 37 ° C. Объем дополнительных средств массовой информации могут потребоваться на основе расчетов на шаге 2.8. Предварительно потепления СМИ предотвращает образование воздушных пузырей во время эксперимента.
  2. Включите микрофлюидика системы, которая включает в себя контроллер, два блоки питания, Микроскоп, камеры, и компьютер, подключенный к системе. Откройте программное обеспечение, которое контролирует систему (см. таблицу материалов) в меню программы на компьютере. Два окна появится, как только программа открыт.
  3. Найдите номер штрих-кода пластины в использовании и введите номер при запросе программного обеспечения. Использование двух отдельных компьютерных экранов для просмотра программного обеспечения на два окна. Одно окно (модуль управления) содержит элементы управления для пластины и окна второго (монтаж, тепловизионный модуль) содержит элементы управления для Микроскоп и камеры.
  4. Включите кнопку питания нагревателя на контроллере и установите микрофлюидика температуры системы до 37 ° C с помощью кнопок со стрелками на контроллере температуры.
  5. Чистота интерфейс пластины (рис. 1), используя стерильную воду следующим. Спрей в нижней части пластины с стерильной водой и использовать объектив бумаги для удаления грязи/пыли. Отдых интерфейса пластины лицом вниз на бумаге чистый объектив, чтобы высохнуть на воздухе. Очистите верхнюю пластину интерфейс, с помощью 70% изопропиловый спирт и объектив бумаги.
    Примечание: Пластину интерфейс соединяет microfluidic системы к пластине, которая будет содержать клетки и СМИ. Убедитесь, что никакая жидкость остается и удаляются все волокна и грязи. Неправильная очистка может привести к низким качеством изображения и видео.
  6. Удалите конденсат из труб на панели интерфейса.
    1. Оставьте пластины лицом вниз отдыхает на бумаге объектива. В элементе управления окна модуля нажмите на ручной режим для пластины. В разделе меню сдвига управления нажмите на выбранный жидкости для столбцов 1-4 и 5-8 и выберите 37 ° C из раскрывающегося меню. В Секции управления сдвига, установите режим потока константу и задать Макс наклон 2 Дин/см2 (0,2 Па) (рис. 2A).
    2. Нажмите на входе скважины начать поток стерильного воздуха через интерфейс пластины трубы для удаления конденсата. Через 5 мин нажмите на кнопку "стоп" в разделе Управление хорошо пластины (рис. 2A). Наблюдать за трубы в пластину интерфейс для подтверждения, что было удалено все конденсации. Если до сих пор видны капельки, повторите поток стерильного воздуха, как упоминалось выше, для еще 5 мин.
      Примечание: Впускной трубы крепятся к 0,22 микрон фильтры, чтобы убедиться, что только стерильного воздуха вводится в систему микрофлюидика. Поток может контролироваться журнал событий в окне модуля управления на экране.
  7. Место пластину microfluidic 48-ну 0-20 Дина на микроскопа.

3. candida albicans биопленки в системе Microfluidic

  1. Чтобы записать биопленки, мкл 600 подогретым RPMI 1640 среднего или средний паук на входе скважины (см. Рисунок 1 пластина макета). Есть две реплики для каждого экспериментальные условия.
    1. Для тестирования биопленки C. albicans штаммов дикого типа и мутантов, добавить 600 мкл паук среднего входе скважины эксперимент пластины.
    2. Для тестирования биопленки присутствии противогрибковых препаратов (или других соединений интерес), добавить 600 мкл RPMI 1640 средних двух скважин (отрицательный контроль) и 600 мкл RPMI 1640 среднего дополнена амфотерицин B (16 мкг/мл) (или желаемый препарат выбора в концентрация) для двух других скважин входе.
      Примечание: Для эксперимента образование биопленки 12 h, мкл 600 подогретым СМИ на входе скважины. Для больше экспериментов добавить дополнительные средства массовой информации (50 мкл/ч) на входе скважины. Не следует превышать максимальный объем хорошо (1 500 мкл).
  2. Медленно опустите пластину уборка интерфейса поверх 48 хорошо microfluidic плиты. Вставьте пластину интерфейс слегка влево до тех пор, пока трубы на пластину межфазной расположены на входе и выходе скважины.
Поверните рычаг на пластину интерфейса слева направо для блокировки интерфейса пластины в положении, обеспечение эксперимент герметичной.
Примечание: Поток стерильного воздуха из трубы в пластину интерфейс будет толкать жидкости на входе или на выходе скважинах (в зависимости от направления, выбранные с помощью программного обеспечения на компьютере), так, что жидкость проходит через канал просмотра между входным и выходным Уэллс в настроить направление и скорость, продиктовано пользователя.
  • В Секции управления сдвига, установите режим потока константу и задать Макс наклон 1 Дин/см2 (0,1 ПА). Нажмите на входе скважины с СМИ, чтобы начать поток средств массовой информации из входе выходе скважины (рисунок 2A), чтобы премьер канал. После 5 минут нажмите на кнопку Стоп в Секции управления хорошо пластины. Снять пластину интерфейс и наблюдать microfluidic тарелка скважин. После грунтования каналы, только небольшое падение средства массовой информации должны быть видны в выходе скважины. Если падение не видна, премьер каналы с шагом 2 мин до тех пор, пока небольшое падение СМИ в выходе скважины является видимым.
    Примечание: Грунтовки требуется для удаления воздуха из просмотра каналов и убедитесь, что каналы заполнены с желаемой СМИ.
  • Снять пластину интерфейса от microfluidic пластины и отложите на стерильную поверхности. 50 мкл клеточной культуры (описано в шаге 1.5) к каждой розетке хорошо.
    1. Для тестирования C. albicans штаммов дикого типа и мутантов, 50 мкл одичал тип культуры клеток (SC5314) в СМИ паук две розетки скважины, bcr1 Δ/Δ в средствах массовой информации паук для двух скважин розетки и efg1 Δ/Δ в средствах массовой информации паук две розетки скважин. Место пластину интерфейс обратно на пластину microfluidic и зафиксируйте крышку (см. Рисунок 1 пластина макета).
      Примечание: Как описано в шаге 3.1.1, все соответствующие ввода скважины содержат паук СМИ.
    2. Для тестирования C. albicans биопленки в присутствии амфотерицин B или другие соединения интереса, 50 мкл одичал тип (SC5314) культуры клеток в среде RPMI 1640 четырех аутлет скважин. Место пластину интерфейс обратно на пластину microfluidic и зафиксируйте крышку (см. Рисунок 1 пластина макета).
      Примечание: Как описано в шаге 3.1.2, все соответствующие ввода скважины содержат RPMI 1640 СМИ с и без амфотерицин B или другие соединения интереса.
  • В Секции управления сдвига, установите режим потока константу и задать Макс наклон 2 Дин/см2 (0,2 Па). Нажмите на выходе скважины с клетки, чтобы начать поток средств массовой информации из входе выходе скважины (рисунок 2A), чтобы начать посев C. albicans. После 3 s нажмите кнопку stop в элементе управления хорошо пластины раздел для предотвращения проникновения ввода скважин клетки.
    Примечание: Клетки перемещаются из розетки скважин на входе скважины; важно, что поток остановлен до клетки входе скважины. Это гарантирует, что входе скважины не получить загрязненные клеточной культуры и что СМИ в входе скважины остается стерильным в течение всего эксперимента. Поперечной силы и время, необходимое основан на вязкость использовать средства массовой информации и размера ячеек.
  • Позволяют клеткам остаются неподвижными с нет потока (0 Дин/см2) 10-20 мин в канал просмотра для присоединения начальной ячейки. На этом этапе присоединения 10-20 мин настройте компьютер, чтобы захватить позиции этап камеры и начать приобретать заранее скрытой изображения (описано в деталях в разделы 4-6).

    • 4. Настройка стадии позиции для эксперимента Microfluidic

    Примечание: Этап позиции и Плиты поверочные должен быть установлен перед началом эксперимента. Эта установка позволяет компьютеру для хранения позиции каждого канала просмотра для захвата изображений в ходе эксперимента. Microfluidic плиты не будут мешать после настройки на этапе позиции. Если перемещается пластину, стадии позиции придется сбросить до начала эксперимента.

    1. Используйте программное обеспечение визуализации для анализа (см. таблицу материалов), чтобы установить сцену позиций; Каждый канал просмотра представляет собой этап (1-24) (рис. 1 d), и каждый этап имеет три вложенных этапов (1-3) для создания образов на разных позициях вдоль канала просмотра (рис. 1 c). В окне изображений модуля Откройте модуль «Многомерного приобретение» (MDA), нажав на вкладке MDA (рис. 2B).
    2. В MDA модуль перейдите на вкладку «Сцене» в меню с левой стороны (рис. 2B). В разделе Этап загрузки списка мастер этап для 48 хорошо 0 - 20 Дина microfluidic плиты. Каждый канал просмотра должна иметь три этапа для захвата изображений.
    3. Откройте «Образца перезагружать перестройки» (SRA) и «Переместить стадии абсолютное положение» модули (карта), нажав на вкладках SRA и карта (рис. 2B). В модуле SRA нажмите кнопку «Live» для просмотра изображений с перекрестьем.
    4. С помощью джойстика, установите пластину хорошо что кончик стрелки (физически расположены на пластину) рядом с просмотра канала 4 выравнивает с перекрестия на программное обеспечение. В карту меню нажмите кнопку «Установить происхождение» (рис. 2B). Текущая позиция теперь следует читать 0 в X, Y и Z.
    5. В модуле SRA нажмите на «Первоначальные ориентиры» раздел в меню слева (рис. 2B). Нажмите на «Загрузить параметры» и загрузите файл для 48 хорошо 0 - 20 Дина microfluidic пластины.
    6. На стадии секции модуля MDA, дважды щелкните на «этапе позиция 22,2'. Эта позиция указывает в середине (суб. этап 2) Просмотр номер 22 канала. Это принесет просмотра Этап микроскопа и фокус камеры в непосредственной близости от маркера стрелки, просмотрев канал 22. С помощью джойстика, установите пластину хорошо что кончик стрелки (физически расположены на пластину) рядом с просмотра канала 22 выравнивает с перекрестья.
    7. Скопируйте координата Y в модуле MDA в положение Y точки 2 на вкладке «Обновление ориентиров» SRA модуля (рис. 2B).
    8. В закладке «Обновление стадии позиции» СУЖД, нажмите на кнопку «Применить MDA стадии список» (рис. 2B).
      Примечание: Это будет обновлять все Просмотр стадии позиции в пластине (1-24) быть откалиброван для конкретных microfluidic положение пластины на микроскопа.
    Пластину в настоящее время готова для захвата изображений и будет использовать калиброванный стадии позиции для перемещения во время захвата изображений из трех позиций всех 24 просмотра каналов.

    5. Настройка приобретений для образа захвата в ходе эксперимента Microfluidic

    1. В окне изображений модуля используйте модуль MDA и нажмите на вкладку «Сохранить» в левом меню (рис. 2B). Выберите имя файла для эксперимента и папки для сохранения изображений на компьютере.
    2. В модуле MDA нажмите на вкладку «Timelapse» в левом меню и установите его приобрести 145 всего изображения; Установите timelapse между изображениями до 5 мин. Это приведет к 1 изображения каждые 5 минут для развития эксперимента 12 h биопленки.
      Примечание: Временной интервал между изображениями и общее количество изображений может быть скорректирована основе экспериментальных требований. Если изображений более чем на 12 ч, добавьте дополнительные средства массовой информации на входе скважины на шаге 3.1 для того, чтобы обеспечить, что колодцы не работать всухую. Для больше экспериментов дополнительные средства массовой информации, при необходимости добавить (50 мкл/ч) на входе скважины.
    3. В модуле MDA нажмите на вкладку «волны» в левом меню (рис. 2B) и задайте количество волны для эксперимента как 1. Установка длины волны для захвата на 50% Brightfield и 50% камера с Выдержка 12-20 мс, 0.6 выгоды и дигитайзер 20 МГц.
      Примечание: Дополнительные волн могут использоваться, включая длин волн для флуоресценции изображений (например, что на мы успешно визуализируется mCherry и штаммов GFP с тегами C. albicans , используя microfluidic устройство). Параметры приобретения также могут быть изменены на основании экспериментальных требований. Например, создание второй волны и выбрав «Автофокусом на каждом Timepoint» и третьей волны и выбрав «Автоэкспозиция на каждом Timepoint» рекомендуется для новичков, чтобы максимизировать возможности приобретения изображений, которые находятся в центре внимания.
    4. В модуле MDA выберите вкладки Список этап в меню слева. Этапы 1,1 – 24,3 будет отображаться. Один за другим, щелкните на каждом этапе и использовать параметры тонкой фокус вручную сосредоточиться на клетки в канал просмотра для каждого этапа. После того, как поле зрения находится в фокусе, нажмите на черную стрелку рядом со списком стадии обновления и сохранить настройки для каждого этапа. Компьютер будет использовать эти параметры вручную определенные позиции и фокуса для получения изображений в каждый момент времени. Удалите любые неиспользуемые этапов из списка, используя стрелку «Remove».
      Примечание: Модуль MDA и программы относятся к просмотра каналов как этапы взаимозаменяемы, и же терминология используется программное обеспечение.

    6. Запуск Microfluidic эксперимент

    1. В окне модуля обработки изображений с использованием модуля MDA, выберите «Получить» начать захват предварительно скрытой изображения придерживался клеток для всех вложенных этапов (рис. 2B).
      Примечание: Окно модуля визуализации и управления камерой теперь будут отображаться изображения, которые записываются в настоящее время, и больше не будет видна карта, СУЖД и MDA модуль. Изображения, снятые также покажет таймер на стороне, чтобы указать номер изображения захватили и промежуток времени, прежде чем начнется следующий цикл захвата изображения. Подождите один раунд изображения захвачен перед переходом к следующему шагу.
      Примечание: Не используйте кнопки «Пауза» или «Пометить событие» на экране изображений окно модуля. С этой точки зрения во время эксперимента Держите мыши только в окне модуля управления на втором экране компьютера (рисунок 2A). Это важно, чтобы избежать тревожные изображений окно модуля.
    2. В модуль управления окна пребывания на ручной режим для пластины. В Секции управления сдвига, установите режим потока константу и задать Макс наклон 1 Дин/см2 (0,1 ПА). Нажмите на выходе скважины O1, O7, O13 и O19 начать поток средств массовой информации из входе выходе скважины (рисунок 2A) для удаления неприкрепленных клеток. После 5 минут нажмите на кнопку Стоп в Секции управления хорошо пластины. Второй раунд изображения позволяют быть приобретены. Изображения могут быть визуализированы и промежуток времени может контролироваться на втором экране в окне модуля обработки изображений.
    3. В разделе Управление сдвига отрегулируйте поток Макс сдвига 0.5 дин/см2 (0,5 Па), нажав на номер в поле Макс сдвига столбец и с помощью клавиатуры введите 0,5. Нажмите клавишу enter на клавиатуре и подтвердить изменения скорости потока в журнал событий в окне модуля управления (рисунок 2A). Оставьте в темноте для 12 h эксперимент.
      Примечание: Воздействие света и движения/вибрации могут резко уменьшить качество изображения, полученные на протяжении всего эксперимента. В конце эксперимента microfluidic изображений окно модуля не будет показывать любые изображения и возвращается к показаны модули SRA, карты и MDA. Изображений программное обеспечение модуля может использоваться для просмотра изображений, монтаж видео и количественно биоплёнки сформирована (описано ниже).

    7. Анализ результатов

    1. В окне модуля обработки изображений выберите вкладку «Инструменты анализа» и нажмите кнопку «Обзор многомерных данных» (РМД) от падения меню вниз. В модуле РМД нажмите на «Выбрать файл базы». Это откроет окно «Многомерного набора данных утилиты».
    2. Нажмите на кнопку «Выбор каталога» и выберите папку, которая использовалась для сохранения эксперимент в шаге 5.1. В списке «Наборы данных» выберите файл журнала эксперимент (расширение .nd). После загрузки журнала, нажмите на кнопку «Просмотр».
    3. Выберите волны, щелкнув Параметры в меню слева «Волн» и выберите этап позиции для просмотра из раскрывающегося меню. Выберите изображение для загрузки из чисел на вершине модуля, щелкните правой кнопкой мыши номер изображения. После выбора, нажмите на кнопку «Загрузить изображения» для загрузки изображений. Одновременно можно просматривать одной или всех изображений.
    4. Выберите все изображения, чтобы сделать промежуток времени видео. Выбранные изображения будут открыты как видео в новом окне. Нажмите на вкладку «файл» в окне изображений модуль и выберите «Сохранить как» из раскрывающегося меню. Сохраните полученное видео файл по умолчанию (TIFF/метасерии «»).
    5. Открыть и загрузить сохраненный файл видео, с помощью ImageJ программного обеспечения. В ImageJ перейдите на вкладку «файл» и нажмите на «Сохранить как». Выберите «.avi» из раскрывающегося меню и конвертировать файл в файл .avi, используя JPEG преобразования, равным 10 кадров в секунду.
      Примечание: Скорость видео можно регулировать, изменяя кадров/сек.
    6. Для количественного определения биопленки, повторите шаги, 7.2, 7.3 и 7.4.
    Выберите последний снимок (№ 144) и нажмите на «загрузить изображения» кнопку, чтобы загрузить изображения. Изображение откроется в новом окне. Нажмите на кнопку «порог изображение» и выберите «Включено» порог. Переместить курсор, пока биопленки клетки окрашиваются красным, и регионов с не клетки не окрашиваются.
  • Щелкните на кнопке «Open Log» для входа измерения (на кнопке будет отображаться «Open Log» только первоначально; после журнала активна кнопка будет переименован в «F9: данные журнала '). В окне «Открытых данных журнала» выберите «Динамический обмен данными» и нажмите кнопку «ОК».
  • В окне модуля обработки изображений выберите вкладку «Инструменты анализа» и нажмите «Показать область статистики». Это откроет новое окно отображения измерений из образа. Выберите «Образ» в «Измерения» опции и нажмите «F9: данные журнала.» Файл excel с все измерения будет отображаться. Найдите значения для «» и «Показатели области» и разделите последний бывший чтобы получить числовое значение для территории, занятой биопленки.
    Примечание: «Области» для каждого изображения, полученные в ходе эксперимента идентичны и таким образом измерение «Показатели площади» могут использоваться для оценки различий в биопленки дикого штаммов и мутантных штаммов или оценить эффективность испытания препарата на биопленки.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Мы исполняли microfluidic биопленки пробирного описанных здесь с помощью одичал тип штамм C. albicans условиях двух СМИ (RPMI 1640 и паук СМИ), одичал тип деформации в присутствии известных противогрибковый препарат амфотерицин B (16 мкг/мл) в RPMI, и два мутантных штаммов сообщалось ранее иметь дефекты в биопленки (bcr1Δ/Δ и efg1 Δ/Δ) в средствах массовой информации паука.

    Видео 1 показывает развитие одичал тип биопленки в RPMI 1640 среднего и последствия противогрибковый препарат, амфотерицин B, на биопленки. В условиях одичал типа несколько ячеек решительно присоединиться к каналу, клетки формируют гифы течением времени, и толстые биопленки можно наблюдать с вставочный гифы и клеток дрожжей. В конце эксперимента microfluidic одичал тип биопленки полностью заполняет канал просмотра. Присутствие амфотерицин B, однако, имеет выраженный эффект на уменьшение биопленки. В частности присоединение клеток уменьшается, и, в отличие от без лечения условий, в присутствии амфотерицин B, можно увидеть несколько клетки течет от сдвига поток средств массовой информации. Как время прогрессирует, клетки не формы гифы и биопленки не формируется. Эти различия также показано на рисунке 3, который изображает 4 моменты времени от assay в 0 ч, 2 ч, 6 h и 12 ч.

    Видео 2 показывает развитие одичал тип биопленки и два ранее сообщалось биопленки дефектные мутантов (bcr1 Δ/Δ и efg1 Δ/Δ) в СМИ паука. Оба bcr1 Δ/Δ и efg1 Δ/Δ штаммов Показать сильно сниженным биопленки, по сравнению с isogenic дикого штамма. Для напряжения Δ/Δ efg1 мы отметили, что придерживался клетки не образуют гифы и результирующая биопленки серьезно поврежден. Для напряжения Δ/Δ bcr1 , мы наблюдали, что не только является bcr1 Δ/Δ штамм дефектных биопленки, но он также показывает, четкое соблюдение дефект, где можно увидеть клетки дрейфует в направлении сдвига потока, как они не могут присоединиться к Просмотр канала. Эти различия также показано на рис. 4, который изображает 4 моменты времени от assay в 0 ч, 2 ч, 6 h и 12 ч.

    Figure 1
    Рисунок 1: Microfluidic инструмент, используемый в этом эксперименте. Группа A показывает microfluidic инструмент используется, группа B показывает интерфейс пластины, группа C показывает схематическое изложение одного просмотра канала (этапа) и трех вложенных этапов, захваченные камерой во время эксперимента, и Группа D показывает схематическое изложение 48-ну microfluidic тарелка с схема выходе и входе скважины и окно просмотра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Figure 2
    Рисунок 2: система управления выберите скриншоты визуализации modulesoftware и microfluidic пластина. Группа A показывает модуль управления, которая содержит элементы управления для microfluidic плиты, и группа B показывает изображения окно модуля, «Переместить стадии абсолютное положение» (карта) модуль, модуль «Многомерного приобретение» (MDA), и модуль «Образец перезагружать перестройки» (SRA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Figure 3
    Рисунок 3: подверженности амфотерицин B приводит дефектов образование биопленки. Время зависит от визуализация биопленки в СМИ RPMI 1640 (колонка 1) и СМИ RPMI 1640, дополнена амфотерицин B (колонка 2) под динамический поток (0.5 дин/см2) 16 мкг/мл при 37 ° C в течение 12 ч после присоединения в системе microfluidic. Представитель 0 h (после присоединения и первоначальный мыть), 2 ч, 6 h и 12 h изображения (сверху вниз) отображаются для isogenic дикого штамма SN250 (колонки 1 и 2). Масштаб гистограммы являются 20 мкм в каждой панели. В видео 1предоставляются соответствующие видео промежуток времени биопленки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Figure 4
    Рисунок 4: Удаление BCR1 или EFG1 приводит биопленки образования дефектов. Время зависимых визуализация биопленки в СМИ (колонки 1-3) паук под динамический поток (0.5 дин/см2) при 37 ° C 12 ч после присоединения в системе microfluidic. Представитель 0 h (после присоединения и первоначальный мыть), 2 ч, 6 h и 12 h изображения (сверху вниз) отображаются для isogenic дикого штамма SN250 (колонка 1), bcr1Δ/Δ штамм (колонка 2) и efg1 Δ/Δ штамм (колонка 3). Масштаб гистограммы являются 20 мкм в каждой панели. В видео 2предоставляются соответствующие видео промежуток времени биопленки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Видео 1: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

    Видео 2: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Настраиваемые microfluidic биопленки assay описанных здесь позволяет для визуализации биопленки в режиме реального времени на уровне отдельной ячейки при контакте с фиксированной ставкой ламинарного потока и постоянной температуре. Она предоставляет мощные средства для изучения развития биопленки в штаммов дикого типа и мутантов, и последствия антимикробное средство лечения на биопленки в условиях, которые имитируют физиологические условия наблюдаются в клинических условиях. В отличие от большинства в vitro биопленки анализов, этот метод позволяет для изучения развивающихся биопленки в режиме реального времени как он образует.

    Этот метод может использоваться в виде высокой пропускной способности, где до 24 пробы могут быть запущены одновременно оценить биопленки. Метод может также использоваться для проведения генетического экраны мутант библиотек для идентификации генов, необходимых для развития нормальной биопленки и может использоваться для оценки эффективность против биоплёнки антимикробных соединений интерес в составные библиотека экраны. Мы ожидаем, что будущие приложения этого microfluidic устройства будет включать в себя такие экраны. Однако мы отмечаем, что определенные испытания наркотиков лечения будет ограничиваться по толщине биопленки, формируется с помощью этого устройства microfluidic как биопленки, выращенных на > 16 h, как правило, забивают канал просмотра. Таким образом, эксперименты по тестированию на наркотики будет необходимо выполнить для < 16 h.

    В целом это устройство очень настраиваемый и универсальный и может быть скорректирована для оценки различных видов микроорганизмов различных королевств, скорости потока, температуры, инкубации раз и СМИ. Метод, описанный предоставляет информацию о целого ряда различных аспектов биопленки, включая первоначальный сотовый присоединению, созревания биопленки и разгон клеток. Хотя мы только сообщить результаты для одного вида биопленки здесь, этот протокол также может быть адаптирована для исследования двойного и смешанных видов биопленки.

    Два шага имеют решающее значение для успешного выполнения этого протокола. Во-первых пузырьков воздуха в системе должна избежаться путем нагрева СМИ при экспериментальной температуре. Один из распространенных оплошности является разведение клеток в средствах массовой информации, которая не была предварительно разогретой. Клетки должны быть разведен в тех же СМИ, которая используется для входа скважин. Во-вторых, поток клеток от розетки на входе, которые должны быть тщательно проверены скважин; Если клетки слишком далеко, входе СМИ будет загрязняются и эксперимент не даст можно интерпретировать результаты. С другой стороны если клетки не разрешается перемещать всю дорогу в канал просмотра, то ячейки не будут видны в канал во время эксперимента, приводит к пустых изображений. Дополнительные ключевые моменты, чтобы иметь в виду, что объем и движение между скважинами в пластину microfluidic связаны друг с другом для каждого столбца, и это важно для поддержания согласованности столько СМИ как можно (с аналогичными вязкость, плотность, клетки и композиция) и аналогичным размером ячейки (если возможно), как различные средства массовой информации и размеров разных ячеек будет иметь различные расхода в столбце. В ходе эксперимента обратный клетки контролируется с помощью микроскопа; Однако только два канала можно просмотреть одновременно (с помощью 10 X цель). Таким образом настоятельно рекомендуется выполнить пробный эксперимент, чтобы измерить время, необходимое для потока от розетки на входе скважины с использованием клеток и средства массовой информации планируется использовать в фактических эксперимент.

    В целом мы настоятельно рекомендуем использовать этот assay биопленки microfluidic как assay в vitro использоваться до животных в естественных условиях проведения испытания. Assay, однако, по-прежнему assay в пробирке , и результаты должны проверяться в соответствующих животных моделях. В нашем опыте, результаты этот assay биопленки microfluidic имели лучшие прогностическая ценность для в vivo биопленки анализов по сравнению с другими в vitro анализов мы оценивали14.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Кларисса J. Nobile является основателем BioSynesis, Inc., компании, разрабатывающей ингибиторы и диагностика C. albicans биопленки.

    Acknowledgments

    Мы благодарим всех членов Нобиле лаборатории для полезной дискуссии по биопленки анализов. Это исследование было поддержано национальных институтов здравоохранения (НИЗ) Грант R21 AI125801 (C.J.N.). D.L.R. была поддержана докторских стипендий из университета Калифорнии институт Мексики и Соединенных Штатов Америки (UC-MEXUS) и y Consejo Nacional de науки Технология (КОНАСИТ).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BioFlux 1000z Fluxion Automated microfluidic device for live cell analysis
    48-well plate 0-20 dyne Fluxion 910-0047 Microfluidic plate
    Montage Software Fluxion Version 7.8.4.0 Visualization analysis software
    ImageJ Software NIH https://imagej.nih.gov/ij/
    Yeast Extract Criterion C7341
    Bacto Peptone BD Biosciences 211677
    Dextrose (D-Glucose) Fisher Scientific D163
    Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific P285-500
    RPMI-1640 Sigma-Aldrich R6504
    MOPS Sigma-Aldrich M3183
    Nutrient Broth Criterion C6471
    Difco D-Mannitol BD Biosciences 217020
    Agar Criterion C5001
    Amphotericin B Corning 30-003-CF
    Sterile Inoculating Loops VWR 30002-094
    Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
    Disposable Cuvettes Fisher Scientific 14-955-127
    Lens Paper VWR 52846-001
    Microplate and Cuvette Spectrophotometer BioTek EPOCH2TC
    Shaking Incubator Eppendorf M12820004

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
    2. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
    3. Fox, E. P., Nobile, C. J. Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. , Nova Science Publishers. 1-24 (2013).
    4. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
    5. Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
    6. Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
    7. Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
    8. Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
    9. Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
    10. Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
    11. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
    12. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
    13. Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
    14. Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
    15. Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
    16. Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
    17. Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
    18. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
    19. Baker, K. At the bench: A laboratory navigator. 27, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

    Tags

    Инфекционные заболевания выпуск 130 биопленки Candida albicans визуализация microfluidic устройство в пробирке биопленки анализов методы биопленки биопленки протоколов биопленки экраны ламинарного потока
    Визуализация биопленки в <em>Candida albicans</em> с помощью автоматизированных Microfluidic устройства
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, … More

    Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (130), e56743, doi:10.3791/56743 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter