Este protocolo descreve um método novo, permitindo a visualização quantitativa da formação do complexo de proteínas SNARE, baseado na transferência de energia de ressonância de Förster e vida de fluorescência, microscopia de imagem.
Solúvel N– proteà sensível proteína (NSF) acessório da proteína do receptor (SNARE) proteínas da fusão são chave para tráfico de membrana, como eles catalisam a fusão da membrana dentro das células eucarióticas. A família de proteínas SNARE consiste de cerca de 36 membros diferentes. Rotas de transporte intracelular específico são catalisadas por conjuntos específicos de 3 ou 4 proteínas SNARE que contribuam assim para a especificidade e a fidelidade do tráfico de membrana. No entanto, estudando a função precisa de proteínas SNARE é tecnicamente um desafio, porque armadilhas são altamente abundantes e funcionalmente redundante, com a maioria dos laços tendo múltiplos e sobreposição de funções. Neste protocolo, é descrito um novo método para a visualização da formação do complexo SNARE em células vivas. Este método baseia-se em expressar proteínas SNARE fundidas C-terminal de proteínas fluorescentes e medir sua interação por energia de ressonância de Förster transferir vida de fluorescência (FRET) emprega microscopia (FLIM) de imagem. Encaixando os histogramas de vida de fluorescência com um modelo multicomponente decadência, FRET-FLIM permite (semi-) estimativa quantitativa da fração da formação do complexo SNARE em diferentes vesículas. Este protocolo foi aplicado com sucesso para visualizar a formação do complexo SNARE na membrana plasmática e no CDDP compartimentos em linhas de células de mamíferos e principais células do sistema imunológico e pode ser facilmente estendido para estudar funções SNARE em outras organelas em animal, planta e células fúngicas.
Tráfico de membrana é uma característica central das células eucarióticas, onde vesículas de membrana bud fora de uma organela do doador e depois mover para e fundem-se com um alvo Organela1,2. Com exceção de mitocôndrias, todos estes passos de fusão de membrana são catalisados por membros da família1,proteínas SNARE2. A família de proteínas SNARE consiste de cerca de 36 em células de mamíferos e cerca de 20 membros em fermento2. Proteínas SNARE contêm um ou dois ~ 52 longa de resíduos, nativamente não estruturadas de regiões, chamadas SNARE-motivos. Proteínas SNARE frequentemente estão amarradas a membranas por uma hélice transmembrana de C-terminal1,2. Armadilhas podem ser categorizadas com base na centrais resíduos contribuem para a armadilha complexa em arginina (R) e glutamina (Q) armadilhas1,2. Fusão da membrana é impulsionado pela interação de 3 ou 4 armadilhas cognatas que juntos contribuem 4 SNARE-motivos e são distribuídos sobre o doador e o aceptor de membrana1,2. Um complexo SNARE é composto por três motivos de Q-SNARE (denominados Qa, Qb e Qc) e um motivo de R-SNARE. Formação do complexo começa com a N-termini de SNARE-motivos, formando um so-called trans-SNARE-complexo e prossegue em direção a C-termini, formando um apertado bundle coiled-coil α-hélice, chamado um cis-SNARE-complexo. A formação do complexo de nem um único laço complexo arrasta as membranas doador e aceptor juntos e supera a barreira de energia para fusão de membrana3.
Muitas vezes tecnicamente é um desafio atribuir distintos complexos SNARE para rotas de transporte específicos dentro das células. Embora ciladas claramente contribuem para a especificidade da membrana de tráfico, são promíscuos, funcionalmente redundante, e suas funções se sobrepõem1,2. Por causa disso, experiências de perturbação definião ciladas, tais como nocaute do gene, interferência do RNA, a introdução de anticorpos de bloqueio, ou com fragmentos SNARE solúveis atuando como dominantes negativos, frequentemente não resultam em fenótipos claros como outro SNAREs compensar2,4. Além disso, é difícil diferenciar as etapas de fusão de membrana específicas de montante eventos de tráfico, porque armadilhas podem estar envolvidas em várias rotas de transporte2. Estudos de localização de armadilhas por microscopia abordagens, usando immunolabeling ou fusão genética de proteínas fluorescentes repórter, sofrem com os problemas que: (i) armadilhas localizar para várias organelas como eles muitas vezes mediam várias etapas de tráfico e (ii) suas localizações não significam automaticamente que eles funcionalmente estão envolvidos na formação do complexo SNARE. Finalmente, complexos SNARE podem ser identificados usando imunoprecipitação experimentos usando um dos laços como isca e as outras armadilhas como alvos, mas isso não permite a atribuição destes complexos de organelas específicas ou rotas de tráfico. Assim, atualmente, não existe alternativa técnica para visualizar complexos SNARE com resolução organellar. Imunofluorescência não é capaz de provar interações SNARE, mas pode mostrar apenas a presença ou ausência de localização co, enquanto imunoprecipitação só pode mostrar interações SNARE em toda a população de células, mas não atribuir as organelas onde estas interações ocorrem.
Para ultrapassar estas limitações, um novo método que permite a visualização quantitativa de complexos SNARE dentro de células vivas com resolução organellar recentemente foi desenvolvido por Verboogen et al . 5 este método baseia-se na expressão de pares de armadilhas com proteínas fluorescentes espectralmente deslocadas fundidas C-terminal para suas hélices transmembranares. Após a conclusão da fusão da membrana e a formação de uma cis-SNARE complexas, estes fluorophores na C-termini das hélices transmembranares são imediatamente justapostos uns aos outros. Os fluorophores então estão bem dentro da distância de Förster (tipicamente < 5 nm), resultando em FRET do fluoróforo dador verde-deslocado para o avermelhado aceitador fluoróforo5,6. FRET resultados em têmpera do fluoróforo dador e uma emissão maior do fluoróforo aceitador que pode ser medido a partir os rácios da emissão doador e aceptor (ratiometric FRET). No entanto, ratiometric FRET entre duas moléculas diferentes é um desafio, por causa dos níveis de cross-talk e diferente de fluorescência do doador e aceptor laços em organelas diferentes e entre células7,8. FRET pode também ser medido desde o tempo de vida de fluorescência, que é o tempo entre a excitação e a emissão de um fóton. Se o fluoróforo dador pode liberar sua energia por FRET, este resultado processo concorrentes em um aparente encurtamento do tempo de vida de fluorescência. Isto pode ser medido por FLIM7,8. Tempo de vida FRET é muito mais robusto do que o ratiometric FRET para medir as interações entre duas moléculas diferentes, como o tempo de vida de fluorescência é uma propriedade intrínseca de um fluoróforo e é insensível à sua concentração. Além disso, o FRET é por aproximação quantitativa, porque a eficiência do traste é inversamente proporcional à sexta potência da distância entre o doador e aceptor fluorophores (essencialmente uma função de passo). Portanto, encaixando os histogramas de vida de fluorescência gravados por FLIM com um modelo de decaimento do dobro-componente, FRET-FLIM permite a estimativa quantitativa (semi-) da fração de SNARE moléculas exerçam de formação do complexo SNARE5.
Recentemente, este método FRET-FLIM foi usado por Verboogen et al . para visualizar a formação do complexo SNARE em células dendríticas primárias do sistema imunológico,5. Foi demonstrado que, ao encontrarmos um estímulo patogênico, células dendríticas redirecionar sua membrana tráfico acompanhada por um aumento complexantes da proteína de membrana associada a vesículas do R-SNARE (VAMP) 3 com o q-SNARE syntaxin 4 especificamente na membrana plasmática. Esta formação do complexo SNARE aumentada provavelmente é necessária para atender o aumento da capacidade secretora para a secreção de citocinas inflamatórias, tais como a interleucina-65. Este protocolo descreve as etapas experimentais necessárias para a aquisição de dados FLIM-FRET para a medição quantitativa e visualização (semi-) de complexos SNARE.É explicado como encaixar os histogramas de vida de fluorescência de células inteiras com funções de decaimento mono e bi-exponencial, originando o ciclo de vida de fluorescência aparente como uma estimativa quantitativa de interações SNARE. Neste protocolo, a linha de célula HeLa amplamente usada é usada como um exemplo, mas o método pode ser facilmente estendido para estudar complexos SNARE em outras células eucarióticas.
Este protocolo demonstra o uso do FRET-FLIM para visualização de interações SNARE entre syntaxin 4 e VAMP3 em células HeLa vivas. Syntaxin 4 é uma proteína de Qa-SNARE localização predominantemente na membrana plasmática onde ele Medeia exocitose1,2,20,21. VAMP3 é um R-SNARE, que é descrita principalmente para localizar a reciclagem CDDP compartimentos e Medeia tráfico para outros endossomos, bem como para a membrana plasmática1,2,20. No entanto, o ensaio de FRET-FLIM pode ser facilmente adaptado para estudar outras proteínas SNARE. A única condição é que essas armadilhas contêm uma hélice transmembrana do C-terminal, que é o caso para a maioria das proteínas SNARE por longe1,2. Além disso, o protocolo descrito aqui pode ser adaptado para visualização de complexos SNARE em qualquer tipo de célula eucariótica, incluindo plantas e leveduras. Neste protocolo, usamos o encurtamento do tempo de vida de fluorescência do fluoróforo dador como uma medida de traste. Como uma abordagem complementar, o tempo de vida de fluoróforo o aceitador poderia ser analisado, porque a emissão sensibilizada causa uma fase de ascensão distintas que fornece prova inequívoca essa transferência de energia de ressonância ocorre.
Atualmente, a técnica de FRET-FLIM não poderá visualizar complexos SNARE em compartimentos dos lisossomos. Para a construção de 3-mCitrine-mCherry em tandem syntaxin, a fluorescência de mCherry pode ser encontrada mais acumulada em uma área de juxtanuclear, que provavelmente corresponde a compartimentos de depósito lisossômicas, Considerando que o sinal de mCitrine é mais abundante no celular periferia5. Um acúmulo de juxtanuclear semelhante de mCherry comparado com mCitrine observou-se, quando as mesmas proteínas SNARE fundidas para estas proteínas fluorescentes foram expressas co5. Lisossomos são caracterizados por um extremamente baixo pH (< 4) e uma alta atividade de enzimas proteolíticas. O acúmulo de juxtanuclear de mCherry é provavelmente causado por uma resistência mais elevada do fluoróforo mCherry a degradação lisossomal, em comparação com o fluoróforo mCitrine. Não é devido ao pH-têmpera de mCitrine, como acúmulo de juxtanuclear de mCherry também ocorre após a fixação das células5. Assim, a técnica de FRET-FLIM subestima a quantidade de FRET nas regiões juxtanuclear (lysosomal) e isso exigiria outras proteínas fluorescentes repórter que sobrevivem as condições adversas de lisossomos dentro os lúmens.
FRET-FLIM em princípio permite para obter uma estimativa quantitativa (semi-) da fração de armadilhas em complexo de5. Como explicado no presente protocolo, isto requer a instalação dos histogramas de vida de fluorescência com funções de decaimento exponencial-Duplo (equação 2), onde a amplitude do componente rápido é proporcional a fração de armadilhas no complexo ( Equação 3). No entanto, tal encaixe com um modelo de dois componentes é tecnicamente desafiador. Montagem com vários parâmetros de ajuste livre (dois tempos de vida de fluorescência e duas amplitudes) requer um grande número de fótons, especialmente desde que os parâmetros influenciam uns aos outros e pequenos erros em tempo de vida afetará as amplitudes e vice versa. Para superar estes problemas de montagem, os tempos de vida de fluorescência do componente lento podem ser corrigidos para o tempo de vida da única condição doador (ou seja, não FRET; só mCitrine presente) e que o componente rápido para o tempo de vida do tandem construir ( FRET expectable máxima). No entanto, isto também deve ser interpretado com cuidado, porque os tempos de vida de fluorescência podem não ser o mesmo que esses Estados de controle e podem desviar-se por causa de vários motivos (auto que extingue, orientação do dipolo, variações no microambiente). Vários complexos SNARE nas proximidades (< 10 nm) pode resultar em traste dependente da distância, o mesmo princípio que permite FRET ser usado como uma “régua molecular”, mas neste caso, obscurece a quantificação de complexos SNARE. Além disso, uma estimativa quantitativa não é sempre significativa, porque as ciladas rotuladas competem com endógenas SNAREs (sem rótulo). Como consequência, o nível de expressão de mCherry-rotulado SNARE é um determinante principal para o percentual FRET5. Por causa de todas essas advertências, é recomendável para caber os histogramas de vida fluorescente com uma função de decaimento mono-exponencial (equação 1). Isto tem a vantagem que não exige qualquer conhecimento a priori de tempo de vida e a vida fluorescente média aparente resultante fornece uma medida sólida para SNARE complexantes5.
No entanto, espera-se que a imagem de FRET-FLIM quantitativa por modelos de encaixe do dois-componente terá potentes aplicações futuras. LAÇO-codificação de genes dentro do cromossomo podem ser fundidos com proteínas fluorescentes repórter, por exemplo pelo CRISPR/CAS9. Isso resulta na rotulagem fluorescente de endógenas proteínas SNARE, com níveis de proteína endógena e sem fundo de armadilhas sem rótulo e desse modo permite uma estimativa quantitativa significativa da fração de complexos SNARE por FRET-FLIM. Enquanto os níveis de expressão de armadilhas endógenas podem ser bastante baixo e dar relativamente baixos sinais fluorescentes, espera-se que um número suficiente de fótons pode ser obtido, especialmente para a célula inteira FLIM (que requer apenas alguns 1, 000s de fótons). Além disso, estas medições FRET-FLIM podem ser executadas com detectores de fotodiodo avalanche mais sensíveis que também resultará em sinais de fluorescência maiores e melhor estatística de fóton.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de Hypatia da Radboud University Medical Center, um prêmio de desenvolvimento de carreira do programa ciência humana da fronteira, a gravitação Programa 2013 da organização de países baixos para a investigação científica (NWO; ICI-024.002.009), um VIDI conceder da NWO (ALW VIDI 864.14.001) e uma bolsa a partir do Conselho Europeu de investigação (CEI), no âmbito do sétimo programa-quadro da União Europeia (Grant acordo número 336479).
Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine' | Addgene | ID 92422 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry' | Addgene | ID 92423 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry' | Addgene | ID 92426 | Positive control for maximum achievable FRET. |
Hela cells | |||
35 mm glass bottom dishes | Willco Wells | HBST-3522 | Other live cell imaging chambers will work as a substitute |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco, Life Technologies | 31966-021 | |
Fetal calf serum | Greiner Bio-one | 758093 | |
Antibiotic-antimycotic solution | Gibco, Life Technologies | 15240-062 | Pen/Strep will work as a substitute |
Live cell imaging medium | Thermo Fisher Scientific | A14291DJ | Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented |
Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective | Leica | SP8 | Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used |
Pulsed white light laser | Leica | SP8 | Other pulsed laser sources can also be used |
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system | PicoQuant | PicoHarp 300 | |
PT32ICS conversion software | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | ||
data analysis software programme capable of deconvolution | Originlabs | OriginPro 2016 | |
Fiji ImageJ | |||
Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity | Fiji ImageJ | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | |
Bürker Haemocytometer | VWR | 630-1541 | |
HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
PBS | B Braun Melsungen AG | 362 3140 | |
EDTA 2 mM | Merck | 108417 | CAS: 60-00-4 |
15 mL tubes | Greiner Bio-one | 188271 | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | CAS: 72-57-1 |
NEON cell electroporation device | Thermo Fisher Scientific | MPK5000S |