Bu protokol bırakmak Förster rezonans enerji transferi ve floresan mikroskopi Imaging ömür boyu göre SNARE proteinlerin karmaşık oluşumu nicel görselleştirme için yeni bir yöntem açıklanır.
Ökaryotik hücrelerde membran füzyon katalizler çözünür N– ethylmaleimide hassas füzyon proteini (NSF) ek protein reseptörü (tuzak) proteinler membran kaçakçılığı için anahtar şunlardır. SNARE proteini aile 36 farklı üyeleri için oluşur. Belirli hücre içi ulaşım yolları böylece özgüllük katkıda 3 ya da 4 SNARE proteinler belirli kümelerini ve membran ticareti sadakat tarafından katalize. Çünkü tuzaklarına birden fazla olması ve işlevleri üst üste çoğu tuzaklarına ile son derece bol ve işlevsel olarak gereksiz, ancak, tuzak proteinlerin hassas işlev eğitim teknik olarak, meydan okuyor. Bu protokol için görselleştirme canlı hücrelerdeki SNARE karmaşık oluşumu için yeni bir yöntem açıklanır. Bu yöntem SNARE protein C-ölümcül floresan proteinler için erimiş ifade üzerinde temel alır ve onların etkileşim Förster rezonans enerji tarafından ölçme transfer (FRET) istihdam Floresans ömür mikroskobu (FLIM) görüntüleme. Floresans ömür boyu histogramlar özellikli bir uygulamasının çürüme yaklaştırarak, FRET-FLIM farklı veziküller (yarı-) kantitatif tahmini SNARE karmaşık oluşumu kısmını sağlar. Bu iletişim kuralı SNARE karmaşık oluşumu plazma zarı ve endosomal bölmeleri memeli hücre satırları ve birincil bağışıklık hücreleri görselleştirmek için başarıyla uygulandı ve SNARE işlevler diğer organelleri, çalışmaya kolayca genişletilebilir Hayvan, bitki ve mantar hücreleri.
Membran kaçakçılığı nerede membran veziküller kapalı bir donör organel bud ve sonra taşımak ve bir hedef organel1,2ile sigorta ökaryotik hücrelerin merkezi bir özelliktir. Mitokondri hariç, tüm bu membran füzyon adımları SNARE proteini aile1,2üyeleri tarafından katalize. Memeli hücrelerinde yaklaşık 36 üye ve Maya2yaklaşık 20 üye SNARE proteini aile oluşur. TUZAK proteinler SNARE-motifler denilen bir veya iki ~ 52 artıkları-uzun, yerel olarak yapılandırılmamış bölgeler, içerir. TUZAK proteinler kez bir C-terminal transmembran heliks1,2tarafından membranlar için gergin. Tuzaklarına katkıda bulundukları karmaşık tuzak arginin (R) ve glutamin (Q) tuzaklarına1,2olarak Merkezi artıkları göre sınıflandırılabilir. Membran füzyon birlikte 4 SNARE-motifler katkıda bulunmak ve üzerinde donör ve alıcısı membran1,2dağıtılan 3 ya da 4 soydaş tuzaklarına etkileşim tarafından tahrik edilmektedir. Bir tuzak kompleks bir R-tuzak motif ve üç Q-tuzak motifleri (kalite güvence, oyun kurucu ve Qc olarak adlandırılan) oluşur. Karmaşık oluşumu başlar SNARE-motifler, sözde transşekillendirme termini N-tuzak-karmaşık ve CISdenilen bir sıkı α-Helisel dolandı-bobin paket oluşturan C termini doğru gelirleri-tuzak-karmaşık. Hatta tek bir tuzak karmaşık karmaşık oluşumu donör ve alıcısı membranlar birlikte sürükler ve membran fusion3için enerji bariyeri üstesinden gelir.
Hücrelerin içindeki belirli ulaşım yolları ayrı SNARE kompleksleri atama kez teknik olarak zordur. Tuzaklarına açıkça kaçakçılığı membran özgüllük katkıda rağmen önüne gelenle yatıp kalkan, işlevsel olarak gereksiz olduğu ve bunların işlevlerini1,2örtüşmesi. Bu nedenle, pertürbasyon deneyler tuzaklarına, gibi hedefleyerek gen nakavt, RNA müdahale, tanıtım antikorlar engelleme ya da baskın negatif hareket çözünür SNARE parçaları ile sık sık diğer açık fenotipleri neden değil Tuzaklarına telafi etmek2,4. Ayrıca, tuzaklarına birden çok taşıma yolları2‘ dahil belirli membran füzyon adımları ters yönde kaçakçılığı olaylardan ayırt etmek zordur. Tuzaklarına yerelleştirme çalışmalarının mikroskobu yaklaşımlarla, immunolabeling veya floresan muhabir proteinler, genetik fusion kullanarak sorunları muzdarip bu: (i) tuzaklarına bulmak için birden fazla organelleri kez birden çok kaçakçılığı adımları ve (ii) arabuluculuk gibi onların yerelleştirmeler otomatik olarak işlevsel olarak tuzak karmaşık oluşumunda nişanlandıklarını anlamına gelmez. Son olarak, tuzak kompleksleri tuzaklarına birini kullanarak yem ve diğer tuzaklarına hedef olarak immunoprecipitation deneyler kullanılarak belirlenebilir ama bu özel organelleri veya ticaret yolları bu komplekslerin atama izin vermez. Böylece, şu anda, tuzak kompleksleri ile organellar kararlılık görselleştirmek için alternatif hiçbir tekniği yoktur. Ayirt SNARE etkileşimleri kanıtlamak mümkün değil ama sadece varlığı ya da yokluğu co yerelleştirme gösterebilir, immunoprecipitation sadece gösterebilir iken SNARE etkileşimler tüm hücre nüfus ama organelleri atamak değil nerede bunlar etkileşimler meydana gelir.
Bu sınırlamayı aşmak için tuzak kompleksleri organellar çözünürlük ile canlı hücrelerdeki nicel görselleştirme için izin veren bir roman yöntemi son zamanlarda Verboogen ve ark. tarafından geliştirildi 5 bu yöntemi C-ölümcül onların transmembran sarmal erimiş hayalice değiştirdi floresan proteinler ile tuzaklarına çiftlerini ifade üzerinde temel alır. Membran fusion ve CISoluşumu tamamlanmasından sonra-karmaşık tuzak, bu fluorophores C-termini transmembran sarmal, hemen birbirine bitişik. Fluorophores sonra iyi Förster mesafesindedir (genellikle < 5 nm), sonuçlanan FRET yeşil kaymıştır donör fluorophore gelen kırmızı kaymıştır alıcısı fluorophore5,6. Donör fluorophore ve donör ve alıcısı emisyon (ratiometric perde) oranları ölçülebilir alıcısı fluorophore artan bir emisyon Şoklama sonuçlarındaki FRET. Ancak, ratiometric iki farklı molekül arasında perde, Floresans donör ve alıcısı tuzaklarına farklı organelleri ve hücreleri7,8arasında çapraz-hadis ve farklı düzeylerde nedeniyle meydan okuyor. PERDE uyarma ve bir foton emisyon arasındaki zamanı Floresans Lifetime ölçülebilir. Donör fluorophore enerjisini tarafından serbest bırakabilirsiniz Eğer FRET, belirgin bir kısalma Floresans ömür boyu rakip bu işlem sonucu. Bu FLIM7,8tarafından ölçülebilir. Ömür boyu perde perde ratiometric çok daha sağlam Floresans ömür boyu bir fluorophore, içsel bir özelliktir ve onun konsantrasyon için büyük küçük harf duyarlı olarak iki farklı molekül, arasındaki etkileşimler ölçmek için. Ayrıca, FRET yaklaşım nicel, çünkü FRET verimliliğini donör ve alıcısı fluorophores (aslında bir basamak fonksiyonu) arasındaki mesafe altıncı gücüne ters orantılıdır. Bu nedenle, bir çift bileşenli çürüme modeli ile FLIM tarafından kaydedilen Floresans ömür boyu histogramlar yaklaştırarak, FRET-FLIM (yarı-) kantitatif tahmini SNARE karmaşık oluşumu5‘ te nişanlı SNARE moleküllerin fraksiyonunun için sağlar.
Son zamanlarda, bu perde-FLIM yöntemi Verboogen vd tarafından kullanıldı SNARE karmaşık oluşumu birincil dendritik hücreler bağışıklık sistemi5görselleştirmek için. Bu patojen bir uyarıcı gelince, dendritik hücreler kendi membran ile özellikle, Qa-tuzak sözdiziminin 4 R-tuzak vezikül ilişkili membran proteini (VAMPİR) 3 artan bir kompleks eşliğinde ticareti yeniden yönlendirme olduğunu gösterildi Plazma zarı. Bu artan SNARE karmaşık oluşumu büyük olasılıkla İnterlökin-65gibi inflamatuar sitokinlerin salgılanmasını artmış salgı kapasitesini karşılamak için gereklidir. Bu iletişim kuralı SNARE kompleksleri görselleştirme ve (yarı-) kantitatif ölçüm için FRET-FLIM veri edinimi için deneysel adımları açıklar.Bu nasıl için bütün hücreli Floresans ömür boyu histogramlar SNARE etkileşimlerine belirgin Floresans ömür boyu nicel bir tahmin olarak sonuçlanan mono ve BI üstel çürüme işlevleriyle uygun açıklanmıştır. Bu iletişim kuralı, yaygın olarak kullanılan HeLa hücre örnek olarak kullanılır, ancak yöntem SNARE kompleksleri diğer ökaryotik hücrelerde çalışma için kolayca genişletilebilir.
Bu iletişim kuralı FRET-FLIM görselleştirme SNARE sözdiziminin 4 ve VAMP3 canlı HeLa hücreleri arasında bir köprü işlevi için kullanımı gösterilmiştir. Sözdiziminin 4 ağırlıklı olarak nerede ekzositozu1,2,20,21aracılık eder plazma zarı bulma Qa-tuzak bir proteindir. VAMP3 esas olarak endosomal bölmeleri geri dönüştürme bulmak için açıklanan ve diğer endosomes de plazma zarı1,2,20olarak kaçakçılığı aracılık eder R bir tuzak var. Ancak, FRET-FLIM tahlil diğer SNARE proteinler eğitimi için kolayca adapte edilebilir. Bu tuzaklarına hangi çoğu SNARE proteinler tarafından uzak1,2için geçerli bir C-terminal transmembran heliks içeren tek durumdur. Ayrıca, burada açıklanan protokol SNARE kompleksleri bitki ve Maya da dahil olmak üzere herhangi bir ökaryotik hücre tipinde görselleştirme için adapte edilebilir. Bu protokol için donör fluorophore floresan ömrünü kısalma perde ölçüsü olarak kullanılan. Tamamlayıcı bir yaklaşım olarak alıcısı fluorophore ömrünü muayene, kesin kanıt bu rezonans enerji transferi sağlayan duyarlilasmis emisyon belirgin artış faz nedeniyle oluşur.
Şu anda, FRET-FLIM tekniği lizozomal bölmeleri SNARE kompleksleri görselleştirmek mümkün olmayabilir. Sözdiziminin 3-mCitrine-mCherry tandem inşa etmek için mCherry floresan kez mCitrine sinyal içinde cep daha bol ise büyük olasılıkla lizozomal bölmeleri için karşılık gelen bir juxtanuclear alanı, daha fazla birikmiş bulunabilir çevre5. Aynı SNARE protein flüoresan bu proteinler erimiş co ifade5yaşındayken mCitrine için karşılaştırıldığında mCherry benzer bir juxtanuclear birikimi gözlenmiştir. Organellerin karakterize tarafından son derece düşük bir pH (< 4) ve proteolitik enzim yüksek bir etkinlik. MCherry juxtanuclear birikimi büyük olasılıkla mCherry fluorophore mCitrine fluorophore göre lizozomal bozulması için daha yüksek bir direnç nedeniyle oluşur. MCherry juxtanuclear birikimi de hücreleri5fiksasyonu gerçekleştiği sırada için pH-Şoklama nedeniyle mCitrine, biri değil. Bu nedenle, FRET-FLIM tekniği FRET juxtanuclear (lizozomal) bölgelerde miktarı hafife ve bu organellerin sert şartları Lümen içinde hayatta diğer floresan muhabir proteinler gerektirir.
FRET-FLIM ilke (yarı-) kantitatif tahmin karmaşık5tuzaklarına fraksiyonunun elde etmek için izin verir. Bu protokol için açıklandığı gibi bu gerektirir Floresans ömür boyu histogramlar (Denklem 2), çift üstel çürüme işlevleriyle uygun hızlı bileşeni genliği tuzaklarına kısmını orantılı nerede karmaşık () içinde Denklem 3). Ancak, böyle uygun bir iki model ile teknik olarak zordur. Montaj birden fazla ücretsiz uygun parametreleri (iki floresan hayat ve iki genlikleri) ile çok sayıda fotonlar, özellikle parametreleri birbirlerini etkiler ve ömür boyu küçük hataları genlikleri ve Yardımcısı etkiler gerektirir çok yönlü. Bu uydurma sorunların üstesinden gelmek için Floresans yaşam süreleri yavaş bileşeninin donör tek şart (Yani, hiçbir FRET; sadece mCitrine mevcut) ömür boyu sabit olabilir ve bu tandem ömrünü hızlı bileşenine () inşa maksimal expectable perde). Floresans yaşam süreleri bu denetim durumları ile aynı olmayabilir ve birden çok nedenlerle (kendi kendine Şoklama, dipol yönlendirme, microenvironment değişimler) sapma çünkü ancak, bu aynı zamanda bakım ile yorumlanmalıdır. Yakın bir konumda birden fazla tuzak kompleksleri (< 10 nm) mesafe bağımlı perde, perde “moleküler cetvel” kullanılmak üzere izin verir aynı ilke sonuç ama bu durumda, gizlemektedir SNARE kompleksleri miktar. Çünkü etiketli tuzaklarına endojen (etiketsiz) tuzaklarına ile rekabet Ayrıca, nicel bir tahmin her zaman anlamlı değildir. Sonuç olarak, ifade mCherry etiketli SNARE yüzdesinin FRET5temel belirleyici düzeydir. Bu uyarılar yüzünden bu mono üstel çürüme fonksiyonu (Denklem 1) ile floresan ömür boyu histogramlar sığdırmak için tavsiye edilir. Bu yaşam bir temanın herhangi bir bilgi gerektirmez ve elde edilen belirgin ortalama floresan ömür boyu sağlam bir ölçü için tuzak kompleks5sağlar avantajı vardır.
Yine de, bu iki bileşenli uygun modelleri tarafından nicel FRET-FLIM görüntüleme güçlü gelecekteki uygulamalar olacaktır bekleniyor. TUZAK-encoding genlerin kromozom içinde floresan muhabir proteinler ile örneğin CRISPR/CAS9 tarafından erimiş. Bu endojen protein düzeyleri ve etiketsiz tuzaklarına, hiçbir arka plan ile endojen SNARE proteinlerin floresan etiketleme içinde neden olur ve böylece SNARE kompleksleri tarafından FRET-FLIM fraksiyonunun anlamlı bir nicel tahmini için sağlar. Endojen tuzaklarına ifade düzeyleri oldukça düşük olabilir ve vermek floresan sinyallerini nispeten düşük, bu fotonlar yeterli sayıda, özellikle tüm cep telefonu için (ki sadece birkaç 1.000 s fotonlar, gerektirir) FLIM elde edilebilir olduğunu bekleniyor. Ayrıca, bu perde-FLIM ölçümler de daha yüksek floresan sinyallerini ve daha iyi foton istatistikleri neden olur daha duyarlı çığ fotodiyot dedektörleri ile gerçekleştirilebilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser için bilimsel araştırma (NWO; Hypatia bursu Radboud Üniversitesi Tıp Merkezi, kariyer geliştirme Ödülü insan sınır bilim programı, yerçekimi programı 2013 Hollanda organizasyon tarafından desteklenmiştir ICI-024.002.009), bir VIDI vermek NWO (ALW VIDI 864.14.001) ve bir başlangıç Grant Avrupa Birliği’nin yedinci çerçeve programı (hibe sözleşmesi numarası 336479) altında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) üzerinden.
Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine' | Addgene | ID 92422 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry' | Addgene | ID 92423 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry' | Addgene | ID 92426 | Positive control for maximum achievable FRET. |
Hela cells | |||
35 mm glass bottom dishes | Willco Wells | HBST-3522 | Other live cell imaging chambers will work as a substitute |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco, Life Technologies | 31966-021 | |
Fetal calf serum | Greiner Bio-one | 758093 | |
Antibiotic-antimycotic solution | Gibco, Life Technologies | 15240-062 | Pen/Strep will work as a substitute |
Live cell imaging medium | Thermo Fisher Scientific | A14291DJ | Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented |
Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective | Leica | SP8 | Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used |
Pulsed white light laser | Leica | SP8 | Other pulsed laser sources can also be used |
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system | PicoQuant | PicoHarp 300 | |
PT32ICS conversion software | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | ||
data analysis software programme capable of deconvolution | Originlabs | OriginPro 2016 | |
Fiji ImageJ | |||
Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity | Fiji ImageJ | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | |
Bürker Haemocytometer | VWR | 630-1541 | |
HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
PBS | B Braun Melsungen AG | 362 3140 | |
EDTA 2 mM | Merck | 108417 | CAS: 60-00-4 |
15 mL tubes | Greiner Bio-one | 188271 | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | CAS: 72-57-1 |
NEON cell electroporation device | Thermo Fisher Scientific | MPK5000S |