ويصف هذا البروتوكول أسلوب جديد يسمح للتصور الكمي من تشكيل معقدة من البروتينات الفخ، استناداً إلى نقل الطاقة الرنين فورستر، وعمر fluorescence التصوير المجهري.
القابلة للذوبان ن-اثيلماليميدي الانصهار الحساسة البروتين (NSF) مرفق البروتين مستقبلات (الفخ) البروتينات هي المفتاح للغشاء الاتجار بالأشخاص، كما أنها تحفيز الانصهار غشاء داخل الخلايا حقيقية النواة. وتتكون الأسرة البروتين الفخ حوالي 36 عضوا مختلفة. طرق النقل داخل الخلايا المحددة هي تحفزها مجموعات معينة من البروتينات الفخ 3 أو 4 وبالتالي تسهم في خصوصية والإخلاص للاتجار بغشاء. ومع ذلك، دراسة دقيقة وظيفة البروتينات الفخ تقنيا تحدي، نظراً للافخاخ وفرة عالية ووظيفيا زائدة عن الحاجة، مع معظم الافخاخ لها متعددة ومهام متداخلة. ويرد في هذا البروتوكول، وأسلوب جديد للتصور من الفخ تشكيل المعقدة في الخلايا الحية. يستند هذا الأسلوب على الإعراب عن البروتينات الفخ ج-شفاء تنصهر فيها البروتينات الفلورية وقياس التفاعل بينهما بالطاقة الرنين فورستر نقل (بكى) عمر fluorescence توظيف التصوير المجهري (فليم). باحتواء رسوم بيانية عمر الأسفار مع نموذج تسوس متعددة المكونات، يسمح فليم الحنق (شبه-) تقدير كمي لجزء صغير تشكيل معقدة الفخ في حويصلات مختلفة. هذا البروتوكول قد تم تطبيقها بنجاح على تصور الفخ تشكيل معقدة في غشاء البلازما وفي مقصورات اندوسومال في خطوط خلايا الثدييات والخلايا المناعية الأولية، ويمكن تمديدها سهولة لدراسة مهام الفخ في العضيات الأخرى في الحيوان والنبات، والخلايا الفطرية.
غشاء الاتجار هو سمة أساسية من خلايا حقيقية النواة، حيث غشاء الحويصلات برعم الخروج من عضية مانحة ثم الانتقال إلى وتلتحم مع1،عضية هدف2. باستثناء الميتوكوندريا، جميع الخطوات الانصهار الأغشية هي تحفزها أعضاء الأسرة1،البروتين الفخ2. وتتكون الأسرة البروتين كمين حوالي 36 عضوا في خلايا الثدييات وحوالي 20 عضوا في الخميرة2. الفخ البروتينات تحتوي على واحد أو اثنين ~ 52 المخلفات-منذ فترة طويلة، وغير منظم أصلاً المناطق، تسمى الفخ-زخارف. غالباً ما يتم المربوطة البروتينات الفخ للأغشية قبل اللولب transmembrane طرفية ج1،2. ويمكن تصنيف الافخاخ استناداً إلى بقايا المركزية أنها تسهم في كمين المعقدة في ارجينين (R) والجلوتامين (Q) الافخاخ1،2. غشاء الانصهار تحركها التفاعل بين 3 أو 4 من الافخاخ المشابهة التي تسهم الفخ 4-زخارف معا وتوزع على كل من الجهات المانحة ويقبلون غشاء1،2. يتكون مجمع فخ واحد الفخ آر عزر وثلاثة زخارف ف الفخ (يطلق عليها سؤال وجواب، Qb، ومراقبة الجودة). يبدأ تشكيل معقدة في N-تيرميني للفخ الزخارف، تشكل ما يسمى ترانس-الفخ-المعقدة، وتمضي نحو ج تيرميني، تشكيل مجموعة لفائف ملفوف α-حلزوني ضيق يسمى رابطة الدول المستقلة-الفخ-المعقدة. تستمر في الأغشية المانحين ويقبلون معا تشكيل معقدة حتى الفخ واحدة معقدة ويتغلب على الحاجز الطاقة للغشاء الانصهار3.
تعيين متميزة الفخ مجمعات لطرق النقل محددة داخل الخلايا هو التحدي غالباً من الناحية الفنية. على الرغم من وضوح تسهم الافخاخ خصوصية غشاء الاتجار بالأشخاص، هم مختلط، وظيفيا زائدة عن الحاجة، وتداخل وظائفها1،2. وبسبب هذا، تجارب اضطراب استهداف الافخاخ، كما هو الحال بخروج المغلوب الجينات، تدخل الجيش الملكي النيبالي، والأخذ بعرقلة الأجسام المضادة، أو مع أجزاء الفخ القابلة للذوبان بوصفها السلبيات الغالبة، وكثيراً ما لا ينتج واضحة تعمل كغيرها تعويض الافخاخ2،4. وعلاوة على ذلك، من الصعب التفريق بين الغشاء محددة الانصهار الخطوات التمهيدية الاتجار الأحداث، لأن الافخاخ التي يمكن أن تشارك في عدة طرق النقل2. دراسات الترجمة من الافخاخ بالنهج مجهرية، باستخدام إيمونولابيلينج أو الانصهار الوراثية إلى البروتينات الفلورية مراسل، وتعاني من المشاكل التي: الافخاخ (ط) تحديد موقع على العضيات متعددة كما أنها كثيرا ما التوسط متعددة الخطوات الاتجار بالبشر، و (الثاني) تعريب بهم لا يعني تلقائياً كانوا يشاركون في تشكيل معقدة الفخ وظيفيا. أخيرا، يمكن تحديد المجمعات الفخ استخدام تجارب إيمونوبريسيبيتيشن باستخدام واحدة من الافخاخ كالطعم والأفخاخ الأخرى كأهداف، ولكن هذا لا يسمح بإحالة هذه المجمعات على العضيات محددة أو طرق الاتجار. وهكذا، في الوقت الراهن، هناك لا تقنية بديلة لتصور مجمعات الفخ مع القرار أورجانيلار. الفلورة ليس قادراً على إثبات التفاعلات الفخ ولكن يمكن أن تظهر فقط في وجود أو عدم وجود تعريب المشارك، بينما إيمونوبريسيبيتيشن فقط يمكن أن تظهر التفاعلات الفخ في كل خلية السكان ولكن عدم تعيين العضيات فيها هذه تحدث التفاعلات.
وللتغلب على هذه القصور، وضعت مؤخرا طريقة جديدة تسمح للتصور الكمي من مجمعات الفخ داخل الخلايا الحية بالقرار أورجانيلار فيربوجين et al. 5 يستند هذا الأسلوب في التعبير عن أزواج من الافخاخ مع طيفيا تحول البروتينات الفلورية تنصهر فيها على لوالب transmembrane ج-لا شفاء منها. بعد الانتهاء من الغشاء الانصهار وتشكيل رابطة الدول المستقلة-الفخ معقدة، وهذه فلوروفوريس في ج-تيرميني لوالب transmembrane فورا جنبا إلى جنب مع بعضها البعض. ثم يتم فلوروفوريس مسافة فورستر (عادة < 5 نانومتر)، مما أدى إلى الحنق من فلوروفوري الأخضر تحول الجهات المانحة إلى5،فلوروفوري يقبلون تحول أحمر6. تآكل النتائج في تبريد fluorophore المانحين وزيادة انبعاث من fluorophore يقبلون الذي يمكن أن يقاس من نسب انبعاثات البلدان المانحة ويقبلون (راتيوميتريك بكى). ومع ذلك، راتيوميتريك الحنق بين اثنين من جزيئات مختلفة يمثل تحديا، بسبب الأسفار عبر الحديث ومختلف مستويات الافخاخ المانحين ويقبلون في العضيات المختلفة وبين الخلايا7،8. ويمكن أيضا قياس الحنق من عمر الأسفار، وهو الوقت بين الإثارة وانبعاث الفوتون. إذا fluorophore المانحة يمكن الإفراج عن الطاقة بالحنق، هذه النتيجة العملية المتنافسة في الظاهر تقصير عمر الأسفار. وهذا يمكن أن يقاس فليم7،8. عمر الحنق أقوى كثيرا من راتيوميتريك الحنق لقياس التفاعل بين اثنين من جزيئات مختلفة، كما عمر fluorescence خاصية ذاتية فلوروفوري وغير مبال بتركيزه. وعلاوة على ذلك، بكى أنه حسب تقريب الكمية، كفاءة الحنق تناسبا عكسيا مع القوة السادسة من المسافة بين فلوروفوريس المانحة ويقبلون (دالة خطوة أساسا). ولذلك، باحتواء رسوم بيانية في عمر fluorescence سجلتها فليم مع نموذج تسوس مزدوجة-المكون، يسمح فليم الحنق للتقدير (شبه-) الكمية لجزء صغير جزيئات الفخ تشارك في تشكيل معقدة كمين5.
في الآونة الأخيرة، استخدمت هذا الأسلوب فليم الحنق فيربوجين et al. لتصور تشكيل الفخ المعقدة في الخلايا الجذعية الابتدائي المناعي5. وقد تبين أن الخلايا الجذعية توجيهه عند مواجهة حافزا المسببة للأمراض، على غشاء الاتجار برفقة إلى زيادة من البروتين المرتبط حويصلة غشاء الفخ آر (الرقعة) 3 مع سينتاكسين سؤال وجواب-الفخ 4 على وجه التحديد غشاء البلازما. يرجح أن المطلوب تشكيل معقدة زيادة هذا الفخ لتلبية زيادة القدرة الافرازية لإفراز السيتوكينات الالتهابية مثل انترلوكين-65. ويصف هذا البروتوكول التجريبي الخطوات اللازمة للحصول على البيانات فليم الحنق للقياس الكمي والتصور (شبه-) مجمعات الفخ.هو شرح كيفية تناسب المدرج الإحصائي عمر fluorescence كامل الخلية مع وظائف الاضمحلال الأسى أحادية وثنائية، أسفر عن عمر fluorescence الظاهر كتقدير كمي للتفاعلات الفخ. في هذا البروتوكول، خط الخلية هيلا المستخدمة على نطاق واسع ويستخدم كمثال، ولكن يمكن تمديدها الطريقة سهولة لدراسة المجمعات الفخ في الخلايا حقيقية النواة الأخرى.
هذا البروتوكول يوضح استخدام فليم الحنق للتصور من الفخ التفاعلات بين سينتاكسين 4 و VAMP3 في الخلايا الحية من الحلة. 4 سينتاكسين بروتين سؤال وجواب-فخ غالباً تحديد موقع في غشاء البلازما حيث أنها تتوسط الرقابة1،2،،من2021. VAMP3 هو فخ آر الذي يوصف أساسا لتحديد موقع في إعادة تدوير المقصورات اندوسومال ويتوسط الاتجار إلى اندوسوميس الأخرى، وكذلك فيما يتعلق بغشاء البلازما1،2،20. مع ذلك، يمكن مقايسة الحنق فليم سهولة تكييفها لدراسة البروتينات الفخ الأخرى. والشرط الوحيد أن تتضمن هذه الافخاخ اللولب ترانسميمبراني ج-طرفية، مما هو الحال بالنسبة لمعظم البروتينات الفخ ب أقصى1،2. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييفها لتصور مجمعات الفخ في أي نوع من خلايا حقيقية النواة، بما في ذلك النباتات والخميرة البروتوكول هو موضح هنا. في هذا البروتوكول، استخدمنا تقصير عمر fluorescence fluorophore المانحة كمقياس للحنق. كنهج تكميلي، يمكن دراسة عمر fluorophore يقبلون، الذي يوفر دليلاً لا لبس فيه على أن نقل الطاقة الرنين يحدث لأنه يسبب انبعاث وعي مرحلة صعود متميزة.
حاليا، أسلوب فليم الحنق قد لا قادراً على تصور مجمعات الفخ في المقصورات الليزوزومية. لبناء 3-مسيتريني-مشري جنبا إلى جنب سينتاكسين، الأسفار مشري غالباً ما يمكن المتراكمة أكثر في منطقة جوكستانوكلير، التي يرجح أن يناظر المقصورات الليزوزومية، بينما إشارة مسيتريني أكثر وفرة في الخلوي هامش5. ولوحظ إلى تراكم جوكستانوكلير مماثلة من متشيري مسيتريني بالمقارنة مع، عندما كانت نفس الفخ البروتينات تنصهر فيها هذه البروتينات الفلورية شارك أعرب5. ليسوسوميس تتميز بدرجة حموضة منخفضة للغاية (< 4) وارتفاع نشاط الإنزيمات بروتيوليتيك. الأرجح بسبب تراكم جوكستانوكلير مشري مقاومة أعلى من fluorophore مشري لتعويض تدهور بالمقارنة مع فلوروفوري مسيتريني. ليس بسبب تبريد درجة الحموضة من مسيتريني، كما جوكستانوكلير تراكم متشيري كما يحدث عند تثبيت الخلايا5. وهكذا، تقنية فليم الحنق يقلل مقدار الحنق في مناطق جوكستانوكلير (الليزوزومية) وهذا يتطلب البروتينات مراسل الفلورية الأخرى التي تعيش ظروف قاسية داخل لومن lysosomes.
يسمح فليم الحنق من حيث المبدأ الحصول على تقدير (شبه-) كمية لجزء صغير الافخاخ في مجمع5. كما شرحنا في هذا البروتوكول، وهذا يتطلب تركيب رسوم بيانية عمر الأسفار مع وظائف تحلل أسي مزدوج (المعادلة 2)، حيث السعة للمكون سريعة غير متناسب إلى جزء صغير الافخاخ في مجمع ( المعادلة 3). بيد أن مثل هذه المناسب مع نموذج العنصر الثاني تحديا من الناحية التقنية. المناسب مع معلمات تناسب حرة متعددة (اثنين fluorescence عمر وهما ستريك) يتطلب عددا كبيرا جداً من الفوتونات، خاصة وأن المعلمات سوف تؤثر على بعضها البعض، وسوف تؤثر على الأخطاء الصغيرة في العمر ستريك ونائب بالعكس. للتغلب على هذه المشاكل المناسب، يمكن أن تكون ثابتة إعمار fluorescence المكون بطيئة إلى العمر من المانحين والشرط الوحيد (أي، لا بكى؛ فقط مسيتريني الحالية) وأن عنصر السرعة إلى عمر جنبا إلى جنب بناء ( بكى أ القصوى). ومع ذلك، هذا ينبغي أيضا تفسير بعناية، نظراً لإعمار الأسفار قد لا تكون هي نفسها كما هو الحال في هذه الدول المراقبة، ويمكن أن تنحرف بسبب أسباب متعددة (تبريد ذاتي، التوجه ثنائي القطب، والاختلافات في المكروية). عدة مجمعات الفخ مقربة (< 10 نانومتر) يمكن أن يسفر عن الحنق تعتمد على المسافة، المبدأ نفسه الذي يسمح الحنق تكون بمثابة “مسطرة جزيئي”، لكن في هذه الحالة، يحجب التحديد الكمي لمجمعات الفخ. وعلاوة على ذلك، تقدير كمي ليست دائماً مجدية، سبب الافخاخ المسمى تتنافس مع الافخاخ الذاتية (غير مسمى). نتيجة لذلك، مستوى التعبير الفخ المسمى مشري هو أحد المحددات رئيسية للنسبة المئوية الحنق5. وبسبب كل هذه المحاذير، من المستحسن لاحتوائه رسوم بيانية عمر الفلورسنت مع دالة تحلل أسي مونو (المعادلة 1). وهذا له ميزة أن أنها لا تتطلب أي معرفة مسبقة العمر وعمر الفلورسنت متوسط الظاهر الناتج يوفر مقياس صلبة للفخ إلى5.
ومع ذلك، من المتوقع أن كمية الحنق فليم التصوير بواسطة نماذج ملائمة المكون الثاني سيكون لها تطبيقات قوية في المستقبل. يمكن أن تنصهر الفخ-ترميز الجينات داخل الكروموسوم مع مراسل الفلورسنت البروتينات، على سبيل المثال قبل كريسبر/CAS9. هذا ينتج في وصفها الفلورسنت البروتينات الفخ الذاتية، مع مستويات البروتين الذاتية وأي خلفية من الافخاخ غير مسمى، ومما يسمح بتقدير كمي هادف لجزء صغير مجمعات الفخ بالحنق فليم. بينما مستويات التعبير الافخاخ الذاتية قد تكون منخفضة جداً وتعطي نيون إشارات منخفضة نسبيا، فمن المتوقع أن عددا كافياً من الفوتونات يمكن الحصول على، خاصة بالنسبة للخلية كله فليم (الذي يتطلب فقط بضع 1000 من الفوتونات). وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء هذه القياسات فليم الحنق مع أكثر حساسية أجهزة الكشف الضوئي الانهيار الجليدي الذي سيؤدي أيضا إلى أعلى fluorescence إشارات وإحصاءات فوتون أفضل.
The authors have nothing to disclose.
وأيده هذا العمل على زمالة هيباتيا من المركز الطبي في جامعة رادبود في، على جائزة التنمية المهنية من “برنامج العلوم الحدود البشرية”، 2013 برنامج الجاذبية من “منظمة هولندا” “البحث العلمي” (جمعية البحث العلمي الهولندية؛ ICI-024.002.009)، على منحة من جمعية البحث العلمي الهولندية (ALW على 864.14.001)، ومنحة بدءاً من مجلس البحوث الأوروبي (المنسق) ضمن “البرنامج الإطاري السابع” للاتحاد الأوروبي (اتفاق المنحة رقم 336479).
Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine' | Addgene | ID 92422 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry' | Addgene | ID 92423 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry' | Addgene | ID 92426 | Positive control for maximum achievable FRET. |
Hela cells | |||
35 mm glass bottom dishes | Willco Wells | HBST-3522 | Other live cell imaging chambers will work as a substitute |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco, Life Technologies | 31966-021 | |
Fetal calf serum | Greiner Bio-one | 758093 | |
Antibiotic-antimycotic solution | Gibco, Life Technologies | 15240-062 | Pen/Strep will work as a substitute |
Live cell imaging medium | Thermo Fisher Scientific | A14291DJ | Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented |
Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective | Leica | SP8 | Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used |
Pulsed white light laser | Leica | SP8 | Other pulsed laser sources can also be used |
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system | PicoQuant | PicoHarp 300 | |
PT32ICS conversion software | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | ||
data analysis software programme capable of deconvolution | Originlabs | OriginPro 2016 | |
Fiji ImageJ | |||
Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity | Fiji ImageJ | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | |
Bürker Haemocytometer | VWR | 630-1541 | |
HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
PBS | B Braun Melsungen AG | 362 3140 | |
EDTA 2 mM | Merck | 108417 | CAS: 60-00-4 |
15 mL tubes | Greiner Bio-one | 188271 | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | CAS: 72-57-1 |
NEON cell electroporation device | Thermo Fisher Scientific | MPK5000S |