Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שילוב cross-linking כימי ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון שלם ללמוד את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון להרכבות

Published: November 28, 2017 doi: 10.3791/56747
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1
1Interdisciplinary research center HALOmem, Martin Luther University Halle-Wittenberg, 2Department of Chemistry, Kings College London
* These authors contributed equally

Summary

הארכיטקטורה של מתחמי חלבון חיוני לתפקוד שלהם. שילוב של טכניקות שונות המוני spectrometric הוכיח עוצמה ללמוד ההרכבה שלהם. אנחנו מספקים פרוטוקולים cross-linking כימי, יליד ספקטרומטר מסה ולהראות כמה שיטות משלימות אלה לעזור להבהיר את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון הרכבות.

Abstract

חלבונים אינטראקציה עם שלהם ליגנדים ל טופס פעיל ודינמי הרכבות שמבצעים תאיים שונים. אינטראקציות אלה שחקרתי לכן יסוד על ההבנה של תהליכים תאיים. עם זאת, רבים מתחמי חלבון הרכבות דינמיות הינם אינם נגישים באמצעות טכניקות מבניים שגרתיות. ספקטרומטר מסה תורמת החקירה מבנית של מהרכבות אלה, במיוחד את השילוב של טכניקות שונות המוני spectrometric מספק תובנות לתוך הסידור מבניים שלהם.

במאמר זה, אנו מתארים את יישום, שילוב של שתי טכניקות המוני spectrometric משלימים, כלומר cross-linking כימי בשילוב עם ספקטרומטר מסה, יליד ספקטרומטר מסה. Cross-linking כימי כרוך ניגודים קוולנטיות חומצות אמינו בסמיכות באמצעות ריאקטיבים כימיים. לאחר העיכול עם פרוטאזות, di צולבים-פפטידים מזוהים באמצעות ספקטרומטר מסה, אתרי אינטראקציות חלבון חשופה. ספקטרומטר מסה מקורית מצד הוא הניתוח של חלבון שלם הרכבות בשלב גז של ספקטרומטר מסה. היא מגלה stoichiometries חלבון, כמו גם אינטראקציות חלבון וליגנד. בשתי הטכניקות ולכן מספקים מידע משלים על המבנה של החלבון-ליגנד הרכבות, שילוב שלהם הוכיח עוצמה במחקרים קודמים.

Introduction

החקירה מבנית של חלבון הרכבות הפך חשוב במיוחד להבנת תהליכים תאיים. כתוצאה מכך, רבים, טכניקות יש כבר פיתח ומשופר ביולוגיה מבנית1. עם זאת, שיטות אלה מוגבלים לפעמים ביישום שלהם עקב גודל, גמישות או הטרוגניות של מתחמי חלבון תחת חקירה. ספקטרומטר מסה יכולה להתמודד עם האתגרים הללו ו, לכן, הגיח ככלי רב עוצמה ביולוגיה מבנית2,3,4,5. היתרון הגדול ביותר של ספקטרומטר מסה, עם זאת, היא היכולת לזהות חלבונים אפילו בתערובת הטרוגנית ומורכבת6חד משמעית. למטרה זו, חלבונים מתעכלים בדרך כלל עם endoproteinases ואת התערובת המתקבלת פפטיד הוא המופרדים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, eluted ישירות לתוך ספקטרומטר מסה. פפטיד גושים לאחר מכן נקבע, קודמן יונים שנבחרו עבור פיצול נוסף של פפטידים. חלבונים מזוהים ואז על ידי חיפוש פפטיד וגושים שבר המתאים מול מסד נתונים הידועים. הליך זה מאפשר לא רק הזיהוי של פפטידים/חלבונים, אלא גם את השינויים post-translational אשר גורמים לשינוי בנפח גדול של פפטידים של קודמן, היונים פרגמנט נושאת את השינוי7. כמה מן הטכניקות רבים מבני ספקטרומטריית מבוססים על העיקרון הזה,4,8. למשל, תיוג טכניקות כגון מימן דאוטריום exchange9,10, כימי תיוג אסטרטגיות11,12, או רדיקלי הידרוקסיל רגליים ההדפסה13,14 , לתת תובנות הנגישות משטח של החלבונים בתנאים מסוימים.

טכניקה נוספת היא (כימית) cross-linking מעורבים ניגודים קוולנטיות חומצות אמינו בסמיכות דרך קבוצות פונקציונליות שלהם. בשביל זה, ריאקטיבים כימיים, ריאגנטים UV-activatable, או חומצות אמינו הם מועסקים15,16. לאחר cross-linking, החלבונים הם בדרך כלל הידרוליזה עם פרוטאזות, di צולבים-פפטידים מנותחים באמצעות ספקטרומטר מסה מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית. הזיהוי של cross-linking מוצרים על-ידי מסד חיפוש, לעומת זאת, מחייב שימוש תוכנות מיוחדות אשר לשרשר פפטיד רצפים של חלבונים שונים באזורים שונים17,18,19. שימוש cross-linkers כימיים יש יתרון שזה יכול להיות מועסק מתחם חלבון כמעט בכל עניין, לא דורשת שילוב של חומצות אמינו UV-activatable, אשר תושג רק כאשר הבעת החלבון עניין בתוך התאים המארחים. ככזה, cross-linking הוא כלי רב-תכליתי, הועסק בהצלחה במחקרים מבניים רבים של חלבונים גדולים הרכבות20.

ספקטרומטר מסה של חלבון שלם מתחמי (מכונה לעתים 'מקורי' ספקטרומטר מסה), לעומת זאת, כולל הניתוח של חלבונים שלמים, מתחמי חלבון ללא הידרוליזה לתוך פפטידים. היא מגלה קומפוזיציה, הטרוגניות, סטויכיומטריה, טופולוגיה, יחידת משנה אינטראקציות של חלבונים מתחמי21,22. בשילוב עם יון ניידות, יליד ספקטרומטר מסה נוספת מאפשרת קביעה של23,שלהם קונפורמציה24. דבר זה הופך לכלי רב עוצמה החקירה מבנית של מתחמי חלבון שקשה להעריך על ידי טכניקות מבניים שגרתיות. עם זאת, יליד ספקטרומטר מסה מחייבת ניתוח מאגרי המקיימות אינטראקציות חלבון קשרי ערכיות במהלך ספקטרומטריית electrospray יינון. זו מושגת בדרך כלל על-ידי שימוש מאגרי מימית, נדיפים כגון אמוניום אצטט25. בנוסף, מכשיר שינויים נחוצים למנוע דיסוציאציה במהלך שידור לתוך השלב גז של ספקטרומטר מסה26. החלת בדרך זו, נותחו רבים מתחמי חלבון (גדול). הדוגמאות המרשימות הם המחקרים של ריבוזומים שלמים27, ATP synthases28או וירוסים29.

השילוב של יליד ספקטרומטר מסה ו- cross-linking הוכיח מוצלח במיוחד במחקרים קודמים. למשל, stoichiometries של מתחמי המלווה, כולל דיימר Hsp70 לא צפויה, יכול להיות המתקבל ניסויים ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון שלם, בעוד cross-linking כימי חשף את הסידורים של החלבונים ב הרכבות30,31. במחקר אחר, ההשפעות של שינויים post-translational שלם ATP סינתאז מורכבים נחקרו. ספקטרומטר מסה יליד מסופקים תובנות יציבות קומפלקס חלבונים נוכחות או היעדרות של32,של זרחון או acetylation-33. השוואתי cross-linking אסטרטגיה34 גילה הסתגלותי שינויים של החלבונים בתנאים שונים.

כאן, אנו מספקים את הפרוטוקולים לזיהוי חלבון באמצעות ספקטרומטר מסה cross-linking (כימית), יליד ספקטרומטר מסה, כולל ניתוח נתונים ופרשנות (איור 1). השילוב של תוצאות משלימים המתקבל בשיטות אלה בעזרת שני מתחמי חלבון מאופיין היטב הוא והפגינו35. פרוטוקול שלנו ניתן ליישם כל הרכבה חלבון אשר יכול להיטהר על טוהר של ריכוז מסוימים. הגישה במקרים מסוימים מוגבל על ידי ניתוח נתונים של cross-linking נתונים, קרי, גודל מסד הנתונים של מועסק, אשר קובע את הזמן והמרחב נדרש חיפוש. בנוסף, אימות ידני של חוצה קישורים מזוהה לעתים קרובות נדרש, מקטין עוד יותר את הפלט. ספקטרומטר מסה מקורית בעיקר מוגבל על ידי דגימת איכות, למשל, מאגרים, adducts נהגה במהלך טיהור ועל האפשרות להחליף אותם על ידי מאגרי מימית ולא יציבה. עם זאת, מתחמי חלבון מטוהרים עבור ניתוח מבנה בדרך כלל יש את האיכות הנדרש לצורך ניתוח מוצלח עם פרוטוקולים שלנו.

Protocol

1. טיהור של מתחמי חלבון

  1. להכין תרכובת חלבונים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים ממוטבת.
    הערה: הפרוטוקול זה שמוצג כאן עם RvB1/B2 מורכבים מן Chaetomium thermophilum סינתאז פוספט carbamoyl (CPS) מ- Escherichia coli. RvB1/B2 ו- CPS היו טהור כמו שמתואר36,37. כל החלבונים דורש פרוטוקול טיהור בודדים. משתנות בהתאם לפרוטוקול. ללא אמין מאגרי כגון באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) או חומצה 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic (HEPES) צריכים לשמש cross-linking כימי. החלף את המאגר במהלך טיהור במידת האפשר.
    התראה: אל תחיל כל שיטות או ריאגנטים זה להפריע הרכבה מקורית של החלבונים.

2. זיהוי חלבונים מבוססת ספקטרומטר מסה

  1. אלקטרופורזה בג'ל
    הערה: קיימות מערכות ג'ל שונים ומשתמש בכל מעבדה משלו ההתקנה. להתאים את התנאים על פי שיטת ג'ל. ללבוש כפפות, חלוק המעבדה ברחבי הפרוטוקול כפי keratins נמנים מזהמים הנפוצים ביותר באנליזה spectrometric המיסה.
    1. חלות מדגם חלבון µL 20 7.5 µL 4 x דוגמת המאגר, 3 µL 10 x צמצום סוכן (ריכוז סופי 50 מ מ dithiothreitol (DTT)). השתמש 10 מיקרומטר CPS או 2.5 מיקרומטר RvB1/B2. ספין למטה עבור 1 דקות ב- × g והוא מעסיק 16,200 וחום 10 דקות ב- 70 מעלות צלזיוס.
      הערה: כאשר באמצעות מערכת ג'ל שונות להתאים את אמצעי האחסון הדרושים ואת חימום הטמפרטורה.
    2. להכין 4-12% מעבר צבע ג'ל אלקטרופורזה. לדלל את המאגר פועל 20 פעמים עם מים ולמלא את התא אלקטרופורזה. שימוש 2 - חומצה ethanesulfonic (N-מורפולינו) (MES) מאגר חלבונים של משקל מולקולרי קטן יותר (2-200 kDa) ו- 3 - חומצה propanesulfonic (N-מורפולינו) (MOPS) מאגר גדול יותר חלבונים (14-200 kDa). להוסיף 0.5 mL חמצון החדר הפנימי.
      הערה: כאשר באמצעות מערכת ג'ל שונות להכין מאגר הפעלה את הג'ל על פי הפרוטוקולים של היצרן.
    3. לטעון סימן הפרוטאין מתאימים (ויטראז'ים מראש, וללא רבב, שונה מולקולרית מידות) החלל הראשון וטען הדגימות חלבונים לחללים הנותרים.
    4. חלבונים נפרדים עבור 35 דקות (MES) או 50 דקות (MOPS) ב- 200 וולט.
      הערה: להתאים את אלקטרופורזה פעמים ואת מתח למערכות שונות ג'ל.
    5. כתם הלהקות חלבון-להעביר את הג'ל לתוך ג'ל מכתים תיבת ולכסות את הג'ל עם Coomassie על בסיס מים מכתים פתרון. דגירה בין לילה, בטמפרטורת החדר על מטרף ג'ל אופקי.
    6. Destain את הג'ל על-ידי החלפת הפתרון מכתימים עם מים. חזור על שלב זה מספר פעמים (כ 3 - 5 פעמים) עד הרקע ג'ל יופיע ברורה.
  2. בג'ל עיכול
    הערה: כדי למנוע זיהום, השתמש ממיסים כיתה HPLC לאורך כל פרוטוקול מערכת העיכול ועל כל השלבים הבאים (קרי, ניתוח spectrometric המוני). להכין את כל הפתרונות לפני שימוש ומים פילטרט של אמוניום ביקרבונט.
    1. גזור הלהקות חלבון זה הם דמיינו ידי Coomassie כחול כתם של הג'ל באמצעות אזמל. לחתוך בזהירות הלהקות חלבון לחתיכות קטנות של 1 מ מ × 1 מ מ. לשטוף את האזמל עם מים בין להקות חלבונים שונים. רחץ הלהקות ג'ל עם מים ו- acetonitrile (לחצן מצוקה).
    2. להפחית disulphide הנרקמים DTT, alkylate ציסטאין שאריות עם iodoacetamide, וחלבונים תקציר עם טריפסין כפי שתואר לעיל38; בדרך כלל משמש יחס אנזים: חלבון של 20:1 עד 1: 100. השתמש 100 מ מ אמוניום ביקרבונט במהלך פרוטוקול מערכת העיכול.
    3. תמצית פפטידים בשני שלבים.
      1. תחילה דגירה החלקים ג'ל עם אמוניום ביקרבונט, לחצן מצוקה, ולאסוף את תגובת שיקוע פפטיד המכיל. שנית, דגירה החלקים ג'ל עם חומצה פורמית 5% (v/v) ואת לחצן מצוקה. תקופת דגירה של 15 דקות בכל שלב. לשלב את שני supernatants. יבש את פפטידים שחולצו מהתאדות ממיסים את ומפרידה ואקום.
        הערה: פפטידים יבשים ניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
  3. ספקטרומטר מסה מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית
    1. התמוססות של פפטידים יבשים 2% חומצה פורמית ACN/0.1%. התמוססות פפטידים באמבט sonication במשך 2-3 דקות ו ספין למטה ומפרידה ב g x והוא מעסיק 16,200 במשך 30 דקות העברה הדגימות לתוך מבחנות תעשיה.
      הערה: להתאים את עוצמת הקול לפי כמות חלבון. ללהקות Coomassie היטב מוכתם אנו משתמשים 20 µL.
    2. מזריקים µL 5 המדגם למערכת nano-LC-MS/MS באמצעות של תעשיה. לטעון את התערובת פפטיד על הפוך-פאזי סי18 קדם עמודה (סי18 150 µm זהות, 2 ס מ, גודל הנקבוביות 5 מיקרומטר) desalt ולרכז את פפטידים באינטרנט.
    3. השתמש חומצה פורמית 0.1% (v/v) כפי ניידים שלב א' ו- 80% ACN/0.1% (וי/v) חומצה פורמית כמו סלולרי שלב ב' נפרדת של פפטידים על הפוך-פאזי סי18 אנליטי עמודה (סי18 75 µm זהות, 50 ס מ, גודל הנקבוביות 3 מיקרומטר) באמצעות שיפוע של B 4-80% (המכיל חומצה פורמית 0.1%) 300 nL / מינימום מעל 65 דקות.
      הערה: מקור יון nanospray משמש להעביר פפטידים eluted לתוך ספקטרומטר מסה.
    4. להשתמש בתנאי MS (אופייני): לרסס מתח של 1.6 kV; צינור קפילר בטמפרטורה של 250 מעלות צלזיוס; אנרגיית התנגשות המנורמל של 30. מפעילים את ספקטרומטר מסה במצב תלויי-נתונים.
    5. לרכוש ספקטרום MS במנתח המוני (למשל, orbitrap) (מ/z 350−1, 600) עם רזולוציה של 70,000, מטרה בקרת הגברה אוטומטית של 3 x 106. בחר 20 של היונים האינטנסיבי ביותר עבור HCD פיצול-מטרה בקרת הגברה אוטומטית של עונה 1 פרק 105. באופן דינמי תכלול שבחרת בעבר יונים עבור המנועים ס' 30 ביחידים מואשם תשלום לא מזוהה המדינה יונים, כמו גם יונים.
      הערה: כיול פנימי של ספקטרום המוני בוצעה באמצעות האפשרות המונים את המנעול39.
  4. חיפוש במסד הנתונים
    הערה: יש תוכנות שונות זמינים לחיפוש מסד הנתונים. MaxQuant40, למשל, זמין באופן חופשי.
    1. להמיר קבצים .raw .mgf-קבצים באמצעות כלי המרה pXtract (http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html).
    2. לבצע חיפוש במסד הנתונים באמצעות פרמטרי החיפוש טיפוסי: מסד נתונים, swissprot; סובלנות המוני פפטיד, 10 עמודים לדקה; קטע המוני סובלנות, 0.5 Da; אנזים, טריפסין; פצילות לפספס אתרים, 2; שינויים משתנה, carbamidomethylation (ציסטאין) וחמצון (מתיונין).
      הערה: לשנות את הפרמטרים לחיפוש לפי ההגדרות ניסיוני.
    3. בדוק את תוצאת החיפוש של מסד הנתונים. להעריך את הציון חלבון, מספר של פפטידים מזוהה, פפטיד ציונים, והדיוק המונית; הכיסוי רצף מחזירה את הכיסוי חלבון המזוהה.
      הערה: לכל מנוע חיפוש יש אלגוריתם הבקיע בודדים שלה. הערכת פפטיד את שיטת הניקוד על פי איכות טנדם ספקטרום המוני שנצפו. הסימנים העיקריים של קשת טוב צריך להראות סדרת יון (להשלים) כדי לאמת את פפטיד שזוהה. בדרך כלל התוצאה פפטיד הוא מבוסס-הסתברות, כלומר, התוצאה פפטיד הוא מדד עבור מה הסיכוי שרצף פפטיד מזוהה תואם הספקטרום שהושג. התוצאה החלבון נגזרת בדרך כלל ציונים פפטיד ומשמש לדרג חלבון ברשימה של חלבונים שזוהה.

3. ספקטרומטריית של מתחמי חלבון שלם (יליד ספקטרומטר מסה)

  1. הכנת הפולטים מצופה זהב ליוניזציית ספקטרומטריית electrospray
    1. השתמש של פולר micropipette כדי להכין nanoflow פולטי של נימים זכוכית כפי שתואר לעיל25,41. השתמש בורוסיליקט נימים הקוטר הפנימי של 0.78 מ מ.
      הערה: על-ידי שינוי הפרמטרים עבור משיכת מחט, עצה לצורה ולגודל ניתן לשנותם ולאחר מותאמות למדגם. נימים עם עובי קוטר והקיר הפנימי שונה זמינים.
    2. מעיל של נימים זכוכית עם חומרים מוליכי חשמל (למשל, זהב או פלדיום); השימוש coater לרעוד. להוציא יצירת מסך פלזמה זהב נפוץ. בצע הוראות היצרן כדי לקבל איכות טובה ציפוי.
      הערה: הציפוי צריך להיות די מספיק כדי להשיג את תרסיס צבע יציב בעת החלת המתחים נימי נפוצות (ראו להלן).
  2. הכנת הדוגמא עבור ילידי ספקטרומטר מסה
    הערה: מלחים, דטרגנטים, או כמויות גדולות של גליצרול אינם תואמים ספקטרומטריית electrospray יינון. לכן, המאגר טיהור החלפת על ידי חוצץ נדיפים, מימית. 200 מ"מ אמוניום אצטט הוא נפוץ. השתמש בגודל אי-הכללה של עמודות ספין או אולטראפילטרציה התקנים עבור מאגר exchange. במקרים מסוימים, יציבות מורכבים או פעילות עשוי להיות מושפע על ידי מאגר exchange. להעריך את ספקטרום המוני בקפידה וסמנו את הפעילות של המתחם. להוסיף cofactors או תוספים למאגר ניתוח, במידת הצורך.
    1. להשתמש בגודל אי-הכללה של ספין עמודות עבור exchange מאגר מהר. להסיר את מאגר אחסון על-ידי צנטריפוגה ב 1,000 x g וזורקים 4 ° C עבור מינימלית 1 את הזרימה. רחץ שלוש פעמים על-ידי הוספת 500 µL 200 מ"מ אמוניום אצטט, ואחריו צנטריפוגה. לטעון µL 20 המדגם חלבון עמודה ועל צנטריפוגה-1,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
      הערה: ריכוז החלבונים צריכים להיות 1-10 מיקרומטר. ההליך יכול להיות חוזר על עצמו אם לא נדיף רכיבים להפריע עדיין בניתוח.
    2. להתרכז המדגם חלבון ולהחליף את המאגר באותו ניסוי להשתמש במסנני צנטריפוגלי. השתמש קרום סינון של נקבוביות בגודל 50% קטן יותר מהגודל של החלבונים מנותח.
      1. להעביר את הדגימה החלבון לתוך המכשיר סינון ולהוסיף 200 מ"מ אמוניום אצטט. ספין למטה ב 15,000 x g וזורקים את הזרימה. להוסיף 200 מ"מ אמוניום אצטט וחזור על צנטריפוגה. חזור על פעולה זו מספר פעמים. בצע הוראות היצרן עבור מהירות צנטריפוגה. לבצע את צנטריפוגה-4 מעלות צלזיוס.
        התראה: קרום חלבונים נוטים לזרז על הקרום של המכשיר מסנן.
  3. ניתוח spectrometric המוני של מתחמי חלבון ללא פגע
    הערה: ישנם סוגים שונים של ספקטרומטרים המונית של יצרנים שונים שניתן לשנותם ספקטרומטר מסה מקורית, למשל, פאול זמן-של-טיסה (Q-ToF) ספקטרומטרים המונית או ספקטרומטרים המונים orbitrap. הפרוטוקול המתואר להלן בוצעה על מכשיר Q-תוף.
    1. הכנס בעל נימי נים מצופים זהב ולמלא את נימי µL 1-4 מדגם חלבון. פתח את קצה המחט עם פינצטה.
    2. התחבר בעל נימי עם מקור ננו-ספקטרומטריית electrospray, להתאים את מיקום נימי. מיקום קצה נימי ב 0.5-1.5 ס מ כגדולים חרוט. השתמש 80-150 L/h nanoflow גז כדי ליזום את הספריי ולהתאים את זרימת הגז כדי לשמור על תרסיס צבע יציב.
    3. להתאים את הפרמטרים המנגינה-בעמוד של המכשיר Q-תוף. תנאי ההתחלה טיפוסי: מתח נימי, 1.50 kV; קונוס מתח, 80 וולט; אנרגיית RF העדשה 1, 80 וולט; אנרגיית התנגשות, 20 וולט; הצמצם 3, 13.6 נ' לשנות פרמטרים אלה כדי להשיג טוב ספקטרה המוני. להתחיל הרכישה על ידי לחיצה על לחצן "לרכוש" ולשלב סריקות רבות ככל האפשר כדי להשיג קשת המוני טוב.
      הערה: אנו ממליצים על שילוב סריקות לפחות 100.
  4. טנדם ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון ללא פגע
    1. רוכשים את הספקטרום המוני כמתואר לעיל (פרוטוקול סעיף 3.3). לבחור יון קודמן של קומפלקס החלבונים.
    2. שנה מ- MS למצב MS/MS בקובץ ה-רכישה. הגדר את הבחירה MS/MS למבשר מסה.
    3. התחל הרכישה-אנרגיית התנגשות נמוכה. לשלב מספר סריקות (כ-20 סריקות) כדי לוודא מבחר למבשר הנכון מסה. הגברת האנרגיה התנגשות עד החלבונים dissociates. כדי לקבל קשת המוני טוב לשלב סריקות לפחות 500.
      הערה: מתחמי הפשיטו יש לפעמים בעצימות נמוכה. שילוב סריקות רבות ככל האפשר עשויים להגדיל את יחס אות לרעש של רזולוציה.
  5. בפתרון דיסוציאציה של מתחמי חלבון ללא פגע
    הערה: כדי לזכות בתובנה אינטראקציות חלבון בתוך מתחמי חלבונים נוספים, בפתרון דיסוציאציה יכולה להתבצע.
    1. הכנת המדגם חלבון כפי שתואר לעיל (סעיף 3.2). להוסיף ממיסים הדגימה חלבון או שינוי ה-pH מביצועם קומפלקסים שלמים לתוך מתחמי משנה. ממיסים טיפוסי הינם מתנול, אלכוהול איזופרופיל, לחצן מצוקה; לשנות את ה-pH של אמוניום אצטט על ידי התוספת של חומצה אצטית או פתרון אמוניה. רוכשים ספקטרה המוני כמתואר לעיל (סעיפים 3.3 ו- 3.4).
    2. משתנים כמות הממס או את טווח pH ליצירת קומפלקסים תת השונים. בדרך כלל, כמות הממס הוא 5-50% (הריכוז הסופי) והוא טווח pH טיפוסי 4-9. להתחיל עם ריכוז נמוך של הממס (5%) או שינויים קלים ב- pH ולרכוש קשת המוני (ראו סעיף 3.3).
    3. להגדיל את כמות הממס או שינוי ה-pH stepwise עד מתחמי משנה נוצרות בתהליך הפתרון. רוכשים ספקטרה המונית כדי לנתח מתחמי משנה.
  6. לכייל נתונים
    הערה: רכשה ספקטרה המוני מכוילים באופן חיצוני באמצעות פתרון יודיד (CsI) צסיום.
    1. להמיס 100 מ ג CsI במים 1 מ"ל.
    2. רוכשים קשת המונית של CsI. משתנים האנרגיה התנגשות להשיג CsI אשכולות על אותו טווח מ/z כמו החלבונים שנותחו לעיל.
      התראה: CsI ארגונייט שוקע בקצה פולט ובמהירות מזהם קונוס. לרכוש רק כמה סריקות ככל הנדרש כדי לקבל קשת מספקת. הסר פולט המקור בסיום.
    3. להפוך קובץ כיול באמצעות הקשת המוני רכשה קובץ הפניה CsI.
    4. חלות כיול רכשה ספקטרה המוני.
      התראה: כיול של ספקטרה המוני עשוי להיות שינוי קבוע של הנתונים הגולמיים. אם ספקטרה לבצע כיול שאינם נחוצים, ליצור עותק גיבוי של הקובץ.
  7. עיבוד נתונים וניתוח
    הערה: ישנם כלים רבים התוכנה זמינה בחופשיות לניתוח נתונים של ספקטרה המוני מקורי; למשל, Massign42 או UniDec43. להלן הפרוטוקול מתאר ניתוח נתונים ידנית עם העזרה של כלי תוכנה, כמו גם את השימוש Massign לדוגמאות מורכבות. תוכנה זו הוא מתאים היטב הניתוח של ספקטרה המוני מורכבים. בצע את ההוראות המופיעות באינטרנט לשימוש של התוכנית (http://massign.chem.ox.ac.uk/).
    1. עבור ניתוח נתונים, החלקה ספקטרה על-ידי התאמת הפרמטרים המחליק. ספקטרה centroid על-ידי התאמת הפרמטרים. לחשב את ההמונים מורכבים בין שתי הפסגות הסמוכות של החלבונים ' שיא מעטפה באמצעות כלי תוכנה כלי נגינה.
      התראה: החלקת אינטנסיבית מדי עלול לגרום לאובדן נתונים (למשל, אובדן של ליגנדים מאוגד).
    2. לניתוח עם Massign42, להפיק רשימה שיא עבור הספקטרום המוני. Linearize נקודות נתונים של הספקטרום וחלקה. השתמש בכלי תוכנה שונות להקצות מתחמי חלבון, לחשב את הרכב מורכב, או לדמות השיא מורכב מעטפות.

4. כימית cross-linking מצמידים עם ספקטרומטריית

הערה: קיימות אסטרטגיות cross-linking רבים. כאן, אנו מתארים את השימוש Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), אמין-תגובתי מחדש המשמש בדרך כלל ללמוד אינטראקציות חלבון חלבון.

  1. להמיס 1.43 מ"ג BS3 במים µL 100 להכין פתרון מניות 25 מ מ.
    הערה: ריאגנטים אחרים כמו disuccinimidyl suberate (DSS) אינם מסיסים במים, הם בדרך כלל מומס דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד). כמה cross-linkers זמינים גם בצורות כבד עם התווית isotopically. התאגדות של איזוטופים יציבים כבד מייצר שיא זוגות di צולבים-פפטידים ב- MS ספקטרה, אשר מסייע במהלך הערכת הנתונים. בעת שימוש באופן שונה הנקרא cross-linkers, פתרונות מניות של שני משתנים שהוכנו, מעורב 1:1.
    התראה: כדי למנוע דיסוציאציה של מתחמי חלבונים על ידי דימתיל סולפוקסיד, פתרון מניות מרוכז מוכן, מדולל עם מים או מאגר לפני התגובה cross-linking.
  2. להוסיף BS3 החלבונים. השתמש כמויות משתנות של BS3 הנע בין 0.5-5 מ מ כדי לזהות ריכוז אופטימלי מחדש. דגירה של תערובות תגובה 25 ° c עבור h 1 ב thermomixer. השתמש 4-12% מעבר צבע ג'לים ולבצע מרחביות-דף כדי להעריך את תוצאות cross-linking (לקבלת דוגמה, ראה איור 2 ).
    הערה: ריכוז אופטימלי של BS3 הוא הגיע כאשר גבוה יותר משקל מולקולרי חלבון, להקות, אשר אינם גלויים בפקד שאינו מקושר קרוס, מתקבלים במהלך מרחביות-דף יחיד subunits אמנם עדיין גלויים (איור 2).
  3. חזור על התגובה cross-linking עם ריכוז BS3 אופטימלית. דגירה של תערובות תגובה 25 ° c עבור h 1 ב thermomixer.
    הערה: מתחמי חלבונים מסוימים אינם יציבים בטמפרטורת החדר. התגובה cross-linking יכול להתבצע גם על הקרח; עם זאת, וזמן התגובה צריך להיות מותאם.
  4. להרוות את התגובה cross-linking על-ידי הוספת המאגר אמין (למשל, 50-100 מ מ מאגר טריס, pH 7.5, הריכוז הסופי) או לבצע אתנול משקעים כדי להסיר כל ריאגנט cross-linking שיורית.
    1. להוסיף תערובת התגובה להגיע נפח סופי של 200 µL. להוסיף 600 µL קר כקרח אתנול וביו -20 µL 3 מ' סודיום אצטט, pH 5.3 מים או המאגר. לערבב ביסודיות, דגירה ב-20 מעלות צלזיוס במשך שעתיים או לילה.
      הערה: לחלופין, החלבונים יכול להיות זירז ב 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או חנקן נוזלי.
    2. ספין למטה ב g x והוא מעסיק 16,200, 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות הסר בזהירות את תגובת שיקוע.
    3. לשטוף את גלולה עם 1 מ"ל אתנול 80% (v/v) קרה כקרח. ספין למטה ב g x והוא מעסיק 16,200, 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות הסר בזהירות את תגובת שיקוע. יבש בגדר ומפרידה ואקום.
  5. לבצע מרחביות-דף של החלבונים צולבים. לחתוך הלהקות ג'ל ולעכל את החלבון בהג'ל כפי שתואר לעיל (סעיפים 2.1, 2.2).
    הערה: גם ניתן לבצע בפתרון עיכול, עם זאת, זה בדרך כלל דורש צעדים נוספים ההפרדה (למשל, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה של פפטידים מתעכל).
  6. לבצע ספקטרומטר מסה מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית כמתואר לעיל (סעיף 2.3). פפטידים צולבים הם בדרך כלל נמוך שופע, להחיל את הווריאציות הבאים המוני spectrometric ניתוח כדי להגדיל את עומק אנליטית של המדגם צולבים.
    1. להשתמש יותר מעברי צבע במהלך ההפרדה כרומטוגרפיה נוזלית (למשל, 90 דקות במקום 65 דק ', ראה לעיל).
    2. אל תכלול את פפטידים כפליים טעונה HCD פיצול.
      הערה: פפטידים כפליים טעון הם בד כ intra-cross-מקושר פפטידים ("לולאה פפטידים" או "סוג 1" חוצה קישורים).
    3. בעת שימוש באופן שונה עם התווית cross-linking ריאגנטים, להשתמש באפשרות "שיא קוטף" במהלך ניתוח, קרי, פיצול HCD המופעלת על-ידי הנוכחות של שיא זוגות מוגדר השוני ספקטרום המוני המונים.
      הערה: ייתכן אפשרות "שיא קוטף" לא יהיו זמינות בכל ספקטרומטר מסה.
  7. שימוש pLink תוכנה18 לזיהוי של di צולבים-פפטידים. השתמש ממוזער מסדי נתונים עבור זיהוי. פרמטרי החיפוש טיפוסי הינם: כלי נגינה ספקטרה, HCD; אנזים, טריפסין; מקס. פצילות לפספס אתרים, 3; שינויים משתנה, חמצון (מתיונין) ו carbamidomethylation (ציסטאין); מחדש, BS3; אורך פפטיד מינימלית, 4; מקס. פפטיד באורך, 100; מינימלית פפטיד מסה, 400 Da; מקס. פפטיד מסה, 10,000 Da; פרנקלין דלנו רוזוולט, 1%.
    הערה: בעת שימוש באופן שונה הנקרא cross-linkers, העלייה ההמונית הנגרמת על ידי מקשר צריך להיות מוגדר. יש גם תוכנות אחרות הנפוצות עבור זיהוי קישור, למשל, xQuest17, MassMatrix19או XlinkX15.
  8. להעריך את תוצאות החיפוש של מסד הנתונים על פי איכות פיצול ספקטרה. ספקטרום מקובל של חוצה קישורים צריך להראות יון סדרה של שני פפטידים (לפחות 4 יונים סמוכים) ביחס אות לרעש סביר.
    הערה: בעת שימוש באופן שונה עם התווית ריאגנטים cross-linking, שיא זוגות ב- MS ספקטרה יכול לשמש של בקרת איכות נוספים.
  9. אם נדרש, להמחיש את התוצאות cross-linking ברשתות אינטראקציית חלבון באמצעות כלי תוכנה (למשל, XVis, XiNET). שימוש בר חלקות או מעגלי חלקות עבור ויזואליזציה של אינטראקציות חלבון.
    הערה: שני כלי תוכנה זמינים לכול בשרת אינטרנט. בצע הוראות מפורטות על האתרים המתאימים (https://xvis.genzentrum.lmu.de/ ו- http://crosslinkviewer.org/).

Representative Results

ניתוח מבנה של חלבונים ו את מתחמי שהם יוצרים הוא יסוד להבנת תפקידם. ספקטרומטר מסה תורמת במידה ניכרת החקירה מבניים כי זה יכול להיות מיושם כמעט בכל מתחם עניין ללא קשר לגודל או מדגם הטרוגניות. להדגים לנו את הפרוטוקול באמצעות שני מתחמי חלבון מאופיין היטב; ראשית, הטרו-dodecamer RvB1/B2 thermophilum ג ו שנייה, CPS הטרו-octameric מורכבים מ- e. coli.

ראשית, זיהינו את מרכיבי החלבון שני מתחמי. בשביל זה, החלבונים היו מופרדים על ידי עמודים מרחביות (איור 2), ג'ל להקות נחתכו של הג'ל. לאחר עיכול בתוך ג'ל של החלבונים, התערובת פפטיד נותחה על ידי ספקטרומטר מסה מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית, ההמונים פפטיד, פרגמנט היו נתונים לחיפוש מסד הנתונים. בעקבות זרימת עבודה זו, זיהינו כל החלבוניות של שני מתחמי עם ביטחון עצמי גבוה, קרי, מספר גבוה של פפטידים עם ציונים סבירים פפטיד נצפתה מניב רצף גבוה כיסוי עבור כל החלבוניות (טבלה 1 ).

ואז ניתחנו את ללא פגע RvB1/B2 מורכבים באמצעות ספקטרומטר מסה מקורי (איור 3 א). הקשת המוני חשף שני מינים, אחד בכל כ 8,000 מ/z ו זן אחר-כ 11,000-12,000 מ/z. ההמונים מחושב עבור מינים אלה תואמים את הטבעת3 3(RvB2) hexameric (RvB1) (כ 310 kDa) ו dodecameric שתי טבעות (RvB1)6(RvB2)6 (כ- 620 kDa). סדרת הפסגה בשני להראות שתי האוכלוסיות; אלה מקורן תערובת של subunits RvB2 שלו מתויגים ולא מתויגים, מתחמי. מבנה הגביש עבור RvB1/B2 מורכבים בעבר הושג36 , מציג את הסידור של הטבעת הכפול (איור 3B). הספקטרום המוני מקורית ולכן מאשרת את סטויכיומטריה של dodecamer שלמות, יתר על כן מגלה תת קומפלקס יציב. בנוסף, אוכלוסיות הקיימים מזוהים.

כדי לזהות אתרי אינטראקציית חלבון במתחם RvB1/B2, אנחנו מבחינה כימית קישורים צולבים המתחם מטוהרים עם BS3 מחדש. קודם, אנחנו טיטרציה את כמות BS3 במהלך התגובה cross-linking כדי לקבוע ריכוז אופטימלי. BS3 הוא ספציפי אמין covalently קישורים ליזין לצד שרשראות וכן N-טרמיני של חלבונים. התגובה cross-linking בעקבות מרחביות-דף (איור 2 א). המתחם שאינם מקושרים הצלב הראה subunits הן RvB1 והן RvB2. הוספת BS3 לתערובת התגובה גרמה קוולנטיות הצמדה של החלבונים וכתוצאה מכך רצועות חלבון משקל מולקולרי גבוה יותר. הג'ל מרחביות מראה כי כמויות הולכות וגדלות של BS3 להניב כמויות גבוהות יותר של מינים צולבים בזמן שאינם מקושרים הצלב החלבוניות מופחתים. אנחנו לאחר מכן לחתוך את להקות חלבון בג'ל, עקב פרוטוקול הכלול לעיל כדי לזהות אתרי אינטראקציית חלבון. הספקטרום דוגמה של די-פפטיד צולבים מוצג (איור 3C). הספקטרום מציג סדרת y-יון של שני פפטידים המאשרת את אינטראקציית חלבון. בסך הכל, השגנו אינטראקציות חלבון 14, כולל ארבעה חוצה קישורים בין שני חוצה קישורים בין שני עותקים של RvB2 subunits RvB1 ו- RvB2 (טבלה 2). התוצאות של BS3 cross-linking הם דמיינו ברשת אינטראקציה (איור 3D) מציג האינטראקציות התוך מולקולרית, כמו גם אינטראקציות בין subunits שונים. אינטרה-מולקולרית חוצה קישורים מראים כי הן RvB1 והן RvB2 subunits מקפלים דרך כי N - ו C-מסוף תחומים הן בסמיכות. שימו לב, כי האינטראקציות התוך המולקולרי לא יכול להבחין בין האינטראקציות הבין-מולקולריות של יחידת משנה אותו במקרה זה. בנוסף נצפו הבין-מולקולרי חוצה קישורים בין שני subunits. אלה, שני חוצה קישורים הבין-מולקולרי בין RvB1 לבין RvB2 יכול ניתן לאבחן במבנה אימות הגישה cross-linking. חוצה קישורים בין-מולקולריים אחרים נמצאים בלולאות גמיש אשר אינם כלולים למבנה הגבישי. זיהינו גם חוצה קישורים שני ב RvB2 המכיל את רצפי פפטיד זהה. חד משמעית ניתן לסווג אלה חוצה קישורים כמו הבין-מולקולריים כפי שהם חייבים מקורם שני עותקים של החלבון אותו (דמות תלת-ממד). ניסויים cross-linking שלנו לחשוף אתרים אינטראקציית חלבון בתוך המתחם, אלא גם בתוך את החלבוניות לספק תובנות הסידור מבניים שלהם, זה גם יכול להיות מאושרות על ידי המבנה הקיים קריסטל (איור 3B).

המתחם החלבון השני שלמדנו היה CPS. הקשת המוני מקורי (איור 4A) חשף שלושה מתחמי חלבון בין 6,000 ו- 12,000 מ/z. המתחם הגדול של 640 kDa מקביל הטרו-octamer ללא פגע. מתחמי קטן יותר מייצגים שני מתחמי משנה; דימר של קטנים וגדולים CPS subunits (160 kDa), הטרו-tetramer המכיל שני עותקים של כל יחידה משנית (320 kDa). מתחמי משנה אלה לספק תובנות הראשון לתוך מכלול חלבון; כלומר, subunits קטנים וגדולים במגע ישיר (כפי הנגלית הטרו-דימר), tetramer יכול להיות תוצר של הדימרים שני. כדי לקבל מידע נוסף על ההסדר המבני ב- CPS שלמים מורכבים, ביצענו ספקטרומטר מסה טנדם (MS/MS) של הטרו-octamer, הטרו-tetramer. בשני המקרים, יחידת משנה קטנים לזהויות של קודמן רומז כי יחידת משנה קטן ממוקם בפריפריה של ההרכבה (איור 4B). אכן, יחידת משנה קטן הוא היקפי ב- מבנה (איור 4C) קריסטל זמין44.

בוצעה גם כימי cross-linking שימוש מחדש את BS3. באמצעות הגדלת כמויות, ניגודים קוולנטיות subunits CPS היה משופר. לאחר עיכול החלבונים וניתוח של פפטידים כמתואר לעיל, אינטראקציות חלבון רבים בתוך יחידת משנה גדולה של קישור אחד ב יחידת משנה קטנים התקבלו (טבלה 2). בנוסף, בדומה RvB1/B2 מורכבים, מצאנו שני חוצה קישורים הבין-מולקולרי בין שני עותקים של יחידת משנה גדולה CPS. חוצה קישורים אלה מניחים את subunits גדול שני הניצבים זה מול זה על צדם C-מסוף. במחקר הקודם, שילוב ספקטרומטר מסה מבניים דוגמנות חישובית35, זיהינו שלושה נוספים באינטראקציה יחידת משנה גדולה שהיא כנראה מקורן הממשק של שני עותקים של יחידת משנה גדולה אומת על-ידי מבנה הגביש והן מהמודל שהושג (איור 4C ו לטבלה 2). אינטראקציות אלה מאפשרים את הסידור של הליבה CPS מורכבים בהיקף של ארבע subunits גדולים. אולם, נצפו לא חוצה קישורים בין יחידת משנה בין הקטנים של subunits גדול. על-ידי בדיקה של מבנה גבישי זמינים (איור 4C), מתברר כי השטח האינטראקציה בין הגרעין tetrameric של המתחם, המורכב של יחידת משנה גדולה, ו את היקפי subunits קטנה הוא קטן מאוד, מה שיכול להסביר העדר של אינטראקציות בין-יחידה משנית. זה אושר על ידי ילידי ספקטרומטר מסה אשר הראו כי יחידת משנה קטנים בקלות dissociates מ מתחמי שלם ככל הנראה עקב ממשק איגוד קטן. למרות זאת, אינטראקציות חלבון ב- CPS מורכבות משולבות cross-linking כימי, יליד ספקטרומטר מסה אפשר להסיק מסקנה הסידור שלהם מבניים (איור 4D).

יחדיו, השילוב של יליד ספקטרומטר מסה כימי cross-linking יחד עם המוני spectrometric זיהוי של פפטידים צולבים, מאפשרת שיחזור של ההסדר המבני של שני מתחמי דוגמה. בעוד cross-linking הכימי גילה סידור החלבוניות, למשל את האינטראקציות בין RvB1 לבין RvB2 או בתוך תוכו tetrameric של CPS, יליד ספקטרומטר מסה נמסר חלבון stoichiometries של מתחמי ללא פגע, subcomplexes נפוצה. במקרה של CPS, שעבורם אין האינטראקציות הבין-מולקולריות בין subunits שני יכול להיות שנצפו על ידי, cross-כימי linking ספקטרומטר מסה מקורי עולה כי בכל יחידה משנית גדולה אינטראקציה עם יחידת משנה קטן אחד (איור 4D). ספקטרומטר מסה טנדם הציע את מיקומה יחידת משנה קטנים המתחם, ממשק קטן בין שני subunits.

Figure 1
איור 1: זרימת העבודה של יליד ספקטרומטר מסה ו- cross-linking. בשתי הטכניקות לספק תוצאות משלימים. בעוד ספקטרומטר מסה מקורי חושף stoichiometries ומודולים אינטראקציה, cross-linking נותן תובנות האתרים אינטראקציית חלבון בתוך מתחמי. שימו לב כי כימי cross-linking רק חושף אינטראקציות בינארי. (א) בשלב הראשון של יליד ספקטרומטר מסה הוא מאגר exchange למאגר הפכפך ולא מימית באמצעות יחידות סינון או ג'ל סינון בעמודות. ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון שלם ואז מגלה סטויכיומטריה שלהם. בניסויים ספקטרומטר מסה טנדם, ציוד היקפי subunits הם חלופה מועדפת. (B) עבור, cross-כימי linking מודגרת החלבונים עם ריאגנט cross-linking. החלבונים צולבים מתעכלים ואז לתוך פפטידים אשר לאחר מכן מנותחים באמצעות ספקטרומטר מסה מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: מרחביות-עמוד קישורים צולבים RvB1/B2 (א) ו- CPS (ב) מתחמי. (א) 2.5 מיקרומטר RvB1/B2 היו טעונים לכל ליין ג'ל. הריכוז של BS3 היו מגוונים. Non-קרוס-מקושרים RvB1/B2 מציג את שני החלבוניות כ 50 kDa. תוספת של BS3 גרם להצמדת קוולנטיות החלבוניות וכתוצאה מכך רצועות חלבון משקל מולקולרי גבוה יותר. כמות המינים צולבים מתגברת עם ריכוז גבוה של BS3. תנאים אופטימליים cross-linking הם מסומנים (אדום). (B) 10 מיקרומטר CPS היו טעון לכל ליין ג'ל. גדול (90 kDa) וקטנים (40 kDa) CPS subunits מתקבלים. תוספת של BS3 גרם להצמדת קוולנטיות החלבוניות וכתוצאה מכך רצועות חלבון משקל מולקולרי גבוה יותר. תנאים אופטימליים cross-linking הם מסומנים (אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: יליד ספקטרומטר מסה ו- cross-linking הכימית של RvB1/B2 מורכבים. (א) הספקטרום המוני מקורי חושף שני מינים של RvB1/B2; שלמה dodecamer (קרי, (RvB1)6(RvB2)6) כ 11,000 עד 12,000 מ/z ו- hexameric הטבעת (RvB1)3(RvB2)3 כ 8,000 מ/z. בשני המינים מציגות שתי האוכלוסיות הנובע RvB2 שלו מתויגים ולא מתויגים. הספקטרום שונתה35. (B) הקריסטל מבנה של RvB1/B2 מוצג (מזהה PDB 4WVY). לסירוגין RvB1 ו RvB2 subunits בצורת שתי טבעות hexameric. (ג) פיצול הספקטרום של די-פפטיד צולבים. N-הסופית של RvB1 היה צולבים עם K23 של RvB1. y-יון סדרת התקבלו עבור שני פפטידים (אדום, כחול-ציאן). (ד) protein אינטרה בין אינטראקציות שהושג במתחם RvB1/B2. Intra-cross-קישורים מוצגים באדום, inter-cross-links מוצגים בכחול. הוסף מראה שני חוצה קישורים הבין-מולקולרי בין subunits RvB1, RvB2, אשר יכול, ניתן לאבחן במבנה קריסטל (ירוק, הוספה). אינטראקציות שמקורן שני עותקים RvB2 מוצגים כקווים מנוקדים כחולים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: יליד ספקטרומטר מסה ו- cross-linking כימי של CPS. (א) הספקטרום המוני מקורית של CPS מראה שלושה מתחמי. הטרו-דיימר (160 kDa), הטרו-tetramer (320 kDa), הטרו-octamer (640 kDa). הספקטרום שונתה35. (B) טנדם ספקטרומטר מסה tetrameric ו- octameric CPS מורכבים חשף הדיסוציאציה של יחידת משנה קטנה CPS. (ג) הקריסטל מבנה של CPS מוצג (מזהה PDB 1BXR). Subunits גדול יוצרים גרעין tetrameric, subunits קטנים הממוקמים בפריפריה של המתחם. הבין-מולקולרי חוצה קישורים בין שני עותקים של יחידת משנה גדולה מוצגים (ירוק). (ד) אינטראקציות של subunits CPS קטנים וגדולים. ספקטרומטר מסה מקורי חשף subcomplexes ומציעה ממיקום היקפיים יחידת משנה קטנים. חוצה קישורים כימי מצביעים על הסדרי tetrameric הליבה של CPS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טבלה 1: תוצאות חיפוש במסד הנתונים. החלבונים אותרו באמצעות ספקטרומטר מסה מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית וחיפוש במסד הנתונים. השמות חלבון, ההצטרפות מספר, ואת תיאור, כמו גם חלבון מסה ניתנת. התוצאה חלבון מספר התצפיות ספקטרה לכל חלבון, מספר רצפי פפטיד שנצפה מפורטים. פפטידים חמש עם הציונים הגבוה של פפטידים הקמע מפורטים עבור כל יחידת משנה של חלבונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

בטבלה 2: חוצה קישורים שנצפתה RvB1/B2 ו- CPS. מקבלים את subunits את מתחמי, משקעי צולבים. סוג קישור (אינטרה - או הבין-מולקולרי) התגלה רצפים פפטיד חופפים או המחקר הקודם של35. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

פרוטוקולים ניתנים עבור מסה ספקטרומטר מבוססי ניתוח מבנה של מתחמי יחידה משנית רב חלבון. שתי הטכניקות, שמתואר הפרוטוקול, בעיקר לספק תוצאות משלימים, מותאמים במיוחד כדי לקבל תובנות לגבי הסידורים מבניים בתוך חלבון (-ליגנד) מתחמי אשר קשה ללמוד על ידי טכניקות מבניים שגרתיות. ספקטרומטר מסה יליד מספק תובנות חלבון stoichiometries, כמו גם אינטראקציות חלבון על-ידי ניתוח subcomplexes ומודולים אינטראקציה יציב. Cross-linking, מצד שני, התשואות מידע באתרי קשר ישיר. בהתאם מחדש פעם, גמישות מסוימת יכולים או צריכים להיכלל הניתוח.

הפרוטוקולים שסופקו הם באופן כללי קל לביצוע, לא גוזלת זמן. פרוטוקול כולה יכולה להתבצע תוך שבוע, ניתן להחיל על מתחמי כמעט כל חלבון, אמנם, סכום מסוים של החלבונים הדרושים לניתוח מוצלח. הכנת הדוגמא היא פשוטה, לא דורשת במפורש חלבון מטוהרים מתחמי. עם זאת, אחד מכשול נפוץ הוא זיהום של המדגם במהלך הכנת הדוגמא לזיהוי חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה. אלה מציג ברוב המקרים כוללים keratins אשר מקורן אבק, העור או השיער. לכן, טיפול נוסף כגון לובש כפפות, חלוקים, filtrating מאגרי מימית, ושימוש טוהר גבוהה ממיסים יש לנקוט במהלך הכנת הדוגמא לזיהוי חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה. לחלבונים מזהמים אחרים כגון מלווים בדרך כלל הציג במהלך טיהור חלבון, למשל, כאשר באמצעות תגי קירבה. במקרים אלה, טיהור חלבון צריך להיות שיפור, למשל על ידי הגדלת כביסה צעדים. בכל מקרה, חלבון מציג במדגם בקלות מזוהים במהלך החיפוש מסד נתונים על-ידי השמטת את המסנן טקסונומיה (קרי, חיפוש נגד חלבונים של כל המינים). אם רק כמה פפטידים שנצפו (קרי, כיסוי חלבון נמוכה יכול להשיג), אף-על-פי מדגם מספיק זמין, שיהיה צורך להשתמש proteinase שונים במהלך תהליך העיכול. באופן כללי טריפסין מניב מספר מספיק של פפטידים; עם זאת, במקרים מסוימים כגון קרום חלבונים או קרום תחומים של חלבונים, מספר האתרים פצילות tryptic מצטמצם, אנזימים אחרים מיקוד חומצות אמינו הם בחירה טובה יותר.

מבחינת המכשור, נגינה שונה במיוחד נדרש יליד ספקטרומטר מסה אשר שומרת על אינטראקציות אי-קוולנטיות במהלך העברת לשלב-הגז. מספר סוגי כלי הוכנסו, כולל מכשירים Q-תוף ו- orbitrap. בעוד ששונה Q-תוף ספקטרומטרים המוני זמינים מסחרית עבור ילידי ספקטרומטר מסה מאז מספר שנים, האחרון רק לאחרונה הוכנסו ודורשים ברוב המקרים השינוי מיוחדים45. עם זאת, היישום של כלים ברזולוציה גבוהה מותר ללמוד קשירה של ליגנדים מרובים ו46,שלהם כימות47 , הוא מבטיח עבור יישומים עתידיים.

כדי לזהות di צולבים-פפטידים באמצעות ספקטרומטר מסה מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית, ניתן ליישם נהלי עם כמה שינויים. עם זאת, החיפוש מסד נתונים הוא הגורם המגביל כפי תוכנות מיוחדות רק לעתים רחוקות יכול להתמודד עם מסדי נתונים גדולים, והוא מופחת מסדי נתונים המכיל את החלבוניות של מתחמי נדרשים. מחקרים שנעשו לאחרונה בשימוש cross-linkers מסה ספקטרומטר-cleavable מיקוד אינטראקציות חלבון ב התא כולו lysates48,49. שימוש cross-linkers כימיים, זה קטע בניסויים ספקטרומטר מסה טנדם בעיקר התשואות ליניארי פפטידים (שונה על-ידי מחדש), אשר יכול להיות מזוהה על ידי פיצול נוסף ומפחיתה את מסד הנתונים חיפוש של פפטידים ליניארי, וזה חיפוש חיפוש חישובית מרחב וזמן. עם זאת, לביצוע הניסויים, מנתח המונית של מלכודת יונים או ספקטרומטר מסה היברידית עם מלכודת יונים נדרש. באופן כללי, כמו שווא-תוצאות חיוביות גם נושא חשוב, ספקטרה המונית של פפטידים צולבים לעיתים קרובות אומתו באופן ידני על פי איכות שלהם ספקטרה פרגמנט אשר מרחיב את זמן ניתוח נתונים והצרפתית. פיתוח מערכות הניקוד חזקה שניתן להחיל ללא עוד צעדים אימות ולכן הם יישומים אפשריים בעתיד. דרך אחת לשפר את ניתוח נתונים וכדי להקטין את מספר חיובי השווא היה כניסתה של חישובי שיעור גילוי שקר ויישומם cross-linking ערכות נתונים50.

באופן כללי, מהטכניקות שתוארו כאן יכול בכשלי בטכניקות ספקטרומטר מסה נוספת (למשל, תיוג קוולנטיות) כדי להגדיל את הפלט של הניתוח. שינויים ושיפורים אחרים של הפרוטוקולים ניתן ליישם בקלות. ככזה cross-linking השוואתי34 פורמת הסתגלותי שינויים בהרכבה חלבון. התפתחויות נוספות ספקטרומטריית יליד כיום לאפשר הניתוח של קרום חלבונים51,52 והאינטראקציה שלהם עם שומנים28,52,53,54 . פיתוחים חדשים של ספקטרומטרים המוני ברזולוציה גבוהה עבור ילידי ספקטרומטר מסה הרחיבו את היישום, איגוד ליגנד, למשל, איגוד של ליפידים קרום חלבונים, כעת ניתן לכלול ניתוח45, 46. בשילוב עם גישות דוגמנות חישובית, טכניקות אלה יכולים לספק מודלים מבניים של שינוי רזולוציה55. אם אין מבנים קריסטל זמינים עבור subunits ללא פגע מורכבות או יחיד, ספקטרומטר מסה יכול לספק תובנות הראשון אינטראקציות חלבון ואת הטופולוגיה של המתחם לא ידוע. בהתאם של טכניקות השתמשו התוצאות המתקבלות, מודלים ברזולוציה נמוכה של המתחם לא ידוע ניתן להשיג56,57,58. אם קריסטל מבנים או הומולוגיה דגמים זמינים, המידע המבני שהתקבל ספקטרומטר מסה יכולות להניב אפילו קרובה לשפת אם מודלים59.

לעומת טכניקות מבניים אחרים, ספקטרומטר מסה יש היתרון כי היא דורשת כמויות מדגם נמוך, הוא יכול להתמודד עם דגימות הטרוגנית, החלים על חלבון קומפלקסים של גודל ללא הגבלה. בנוסף, ספקטרומטר מסה מאפשר החקירה של חלבון דינמי מערכות. אוכלוסיות שונות של חלבון או החלבונים הקיימות בפתרון בדרך כלל מנותחים יחד, לכן, שלא כמו עם טכניקות מבניות אחרות הדורשות מבחר של אוכלוסיות מסוימות, שכל הייצורים החיים נשמרים במהלך ניתוח והם למהירים בניסוי אחד. גישות cross-linking כמותית היו הציג לאחרונה34,60,61 , מבטיחים עבור יישומים עתידיים המתאר שינויים הסתגלותי בתנאים שונים.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים עמיתינו לדיונים מועיל. אנו מודים גם Ilme Schlichting, Hopfner קרל-פיטר לאספקת חלבון תסביכים. אנו להכיר מימון ממשרד הפדרלי עבור חינוך ומחקר (BMBF, זיק התוכנית, 03Z22HN22), את אירופה אזורי פיתוח קרנות (EFRE, ז/2016/04/78115), את MLU האלה-ויטנברג C.S., מימון טרסט (109854/658 Z/15/Z) כדי אקולוגיה

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents, Consumables
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma Aldrich H4034 buffer
Acetic acid Sigma Aldrich 695092 pH
Acetonitrile Optima LC/MS Fisher Chemicals A955-1 solvent
Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO) Millipore i.e. UFC500396 buffer exchange, concentration
Ammonium acetate solution Sigma Aldrich A2706 native MS
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 9830 in-gel digestion
Ammonium solution Sigma Aldrich 9859 pH
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0) Thermo Scientific 21590 cross-linker
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4) Thermo Scientific 21595 cross-linker
Caesium iodide Sigma Aldrich 203033 calibration
Calcium chloride Sigma Aldrich C5670 in-gel digestion
Capillaries (1.0 OD × 0.78 ID × 100 L mm) Harvard Apparatus 30-0038 native MS
Disuccinimidyl suberate (DSS) Thermo Scientific 21655 cross-linker
DL-Dithiothreitol Sigma Aldrich D5545 in-gel digestion
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D8418 solvent
Ethanol Fisher Chemicals BP2818 solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Instant Blue Coomassie staining solution expedeon ISB1L staining solution for gel electrophoresis
Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well) life technologies NP0323BOX gel electrophoresis
Iodoacetamide Sigma Aldrich I1149 In-gel digestion
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Micro BioSpin 6 columns BioRad 732-6222 buffer exchange
NuPAGE Antioxidant invitrogen NP0005 running buffer, gel electrophoresis
NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ×) invitrogen NP0007 sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis
NuPAGE MES SDS Running buffer life technologies NP0001 gel electrophoresis
NuPAGE MOPS SDS Running buffer life technologies NP0001 gel electrophoresis
NuPAGE Sample Reducing Agent (10 ×) invitrogen NP0004 reducing Agent for gel electrophoresis
PBS - phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 buffer
SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker invitrogen LC5925 prestained Protein Marker for gel electrophoresis
Sodium acetate Sigma Aldrich S2889 ethanol precipitation
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma Aldrich 252859 buffer
Trypsin Sigma Aldrich TRYPSEQ-RO (11418475001) in-gel digestion
Vivaspin centrifugal devices (different MWCO) Sartorius i.e. VS0101 buffer exchange, concentration
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
Name Company Catalog Number Comments
Instruments
Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge Thermo Scientific 75002425
Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000 Sutter Instruments P-1000
Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell Invitrogen EI0001
Gold Coater Quorum Q150R S Quorum Technologies Ltd. Q150RS
Horizontal gel shaker Rotamax 120 T Heidolph Instruments 544-41200-00
Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade Waters (Micromass) -
reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size) Thermo Scientific 164570
reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size) Thermo Scientific 164213
scalpel Fisher Scientifc 10463989
SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge Thermo Scientific SPD121DP-230
Thermomixer C Eppendorf 5382000015
Tweezers AA Sigma Aldrich Z680184-1EA
Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath VWR 142-0084
UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source) Thermo Scientific 0726030+
Name Company Catalog Number Comments
Software, Software Tools, Database search
Mascot www.matrixscience.com
Massign http://massign.chem.ox.ac.uk
MassLynx Micromass
MassMatrix Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)
MaxQuant Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)
pLink Yang, B. Nat Methods 9 (2012)
pXtract conversion tool http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html
UniDec Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)
XCalibur Thermo Scientific
XiNET http://crosslinkviewer.org
XLinkX Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)
xQuest Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)
Xvis https://xvis.genzentrum.lmu.de

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, I. D. Timeline: the march of structural biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 377-381 (2002).
  2. Liko, I., Allison, T. M., Hopper, J. T., Robinson, C. V. Mass spectrometry guided structural biology. Curr Opin Struct Biol. 40, 136-144 (2016).
  3. Robinson, C. V. From molecular chaperones to membrane motors: through the lens of a mass spectrometrist. Biochem Soc Trans. 45 (1), 251-260 (2017).
  4. Lossl, P., van de Waterbeemd, M., Heck, A. J. The diverse and expanding role of mass spectrometry in structural and molecular biology. EMBO J. 35 (24), 2634-2657 (2016).
  5. Wang, L., Chance, M. R. Protein Footprinting Comes of Age: Mass Spectrometry for Biophysical Structure Assessment. Mol Cell Proteomics. 16 (5), 706-716 (2017).
  6. Steen, H., Mann, M. The ABC's (and XYZ's) of peptide sequencing. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (9), 699-711 (2004).
  7. Olsen, J. V., Mann, M. Status of large-scale analysis of post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3444-3452 (2013).
  8. Schmidt, C., Robinson, C. V. Dynamic protein ligand interactions--insights from MS. FEBS J. 281 (8), 1950-1964 (2014).
  9. Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: what is it and what can it tell us? Anal Bioanal Chem. 397 (3), 967-972 (2010).
  10. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Sci. 2 (4), 522-531 (1993).
  11. Leitner, A., Lindner, W. Current chemical tagging strategies for proteome analysis by mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 813 (1-2), 1-26 (2004).
  12. Leitner, A., Lindner, W. Chemistry meets proteomics: the use of chemical tagging reactions for MS-based proteomics. Proteomics. 6 (20), 5418-5434 (2006).
  13. Kiselar, J. G., Chance, M. R. Future directions of structural mass spectrometry using hydroxyl radical footprinting. J Mass Spectrom. 45 (12), 1373-1382 (2010).
  14. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chem Rev. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  15. Liu, F., Heck, A. J. Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry. Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).
  16. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
  17. Rinner, O., et al. Identification of cross-linked peptides from large sequence databases. Nat Methods. 5 (4), 315-318 (2008).
  18. Yang, B., et al. Identification of cross-linked peptides from complex samples. Nat Methods. 9 (9), 904-906 (2012).
  19. Xu, H., Hsu, P. H., Zhang, L., Tsai, M. D., Freitas, M. A. Database search algorithm for identification of intact cross-links in proteins and peptides using tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 9 (7), 3384-3393 (2010).
  20. Leitner, A., Faini, M., Stengel, F., Aebersold, R. Crosslinking and Mass Spectrometry: An Integrated Technology to Understand the Structure and Function of Molecular Machines. Trends Biochem Sci. 41 (1), 20-32 (2016).
  21. Heck, A. J. Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology. Nat Methods. 5 (11), 927-933 (2008).
  22. Sharon, M., Robinson, C. V. The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes. Annu Rev Biochem. 76, 167-193 (2007).
  23. Goth, M., Pagel, K. Ion mobility-mass spectrometry as a tool to investigate protein-ligand interactions. Anal Bioanal Chem. , (2017).
  24. Uetrecht, C., Rose, R. J., van Duijn, E., Lorenzen, K., Heck, A. J. Ion mobility mass spectrometry of proteins and protein assemblies. Chem Soc Rev. 39 (5), 1633-1655 (2010).
  25. Hernandez, H., Robinson, C. V. Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry. Nat Protoc. 2 (3), 715-726 (2007).
  26. Sobott, F., Hernandez, H., McCammon, M. G., Tito, M. A., Robinson, C. V. A tandem mass spectrometer for improved transmission and analysis of large macromolecular assemblies. Anal Chem. 74 (6), 1402-1407 (2002).
  27. Rostom, A. A., et al. Detection and selective dissociation of intact ribosomes in a mass spectrometer. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5185-5190 (2000).
  28. Zhou, M., et al. Mass spectrometry of intact V-type ATPases reveals bound lipids and the effects of nucleotide binding. Science. 334 (6054), 380-385 (2011).
  29. Uetrecht, C., et al. High-resolution mass spectrometry of viral assemblies: molecular composition and stability of dimorphic hepatitis B virus capsids. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9216-9220 (2008).
  30. Morgner, N., et al. Hsp70 forms antiparallel dimers stabilized by post-translational modifications to position clients for transfer to Hsp90. Cell Rep. 11 (5), 759-769 (2015).
  31. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. The joining of the Hsp90 and Hsp70 chaperone cycles yields transient interactions and stable intermediates: insights from mass spectrometry. Oncotarget. 6 (21), 18276-18281 (2015).
  32. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Mohammed, S., Robinson, C. V. Acetylation and phosphorylation control both local and global stability of the chloroplast F1 ATP synthase. Sci Rep. 7, 44068 (2017).
  33. Schmidt, C., et al. Comparative cross-linking and mass spectrometry of an intact F-type ATPase suggest a role for phosphorylation. Nat Commun. 4, 1985 (2013).
  34. Schmidt, C., Robinson, C. V. A comparative cross-linking strategy to probe conformational changes in protein complexes. Nat Protoc. 9 (9), 2224-2236 (2014).
  35. Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Anal Chem. 89 (3), 1459-1468 (2017).
  36. Lakomek, K., Stoehr, G., Tosi, A., Schmailzl, M., Hopfner, K. P. Structural basis for dodecameric assembly states and conformational plasticity of the full-length AAA+ ATPases Rvb1 · Rvb2. Structure. 23 (3), 483-495 (2015).
  37. Mareya, S. M., Raushel, F. M. A molecular wedge for triggering the amidotransferase activity of carbamoyl phosphate synthetase. Biochemistry. 33 (10), 2945-2950 (1994).
  38. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68 (5), 850-858 (1996).
  39. Olsen, J. V., et al. Parts per million mass accuracy on an Orbitrap mass spectrometer via lock mass injection into a C-trap. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 2010-2021 (2005).
  40. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  41. Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. J Vis Exp. (40), (2010).
  42. Morgner, N., Robinson, C. V. Massign: an assignment strategy for maximizing information from the mass spectra of heterogeneous protein assemblies. Anal Chem. 84 (6), 2939-2948 (2012).
  43. Marty, M. T., et al. Bayesian deconvolution of mass and ion mobility spectra: from binary interactions to polydisperse ensembles. Anal Chem. 87 (8), 4370-4376 (2015).
  44. Thoden, J. B., Wesenberg, G., Raushel, F. M., Holden, H. M. Carbamoyl phosphate synthetase: closure of the B-domain as a result of nucleotide binding. Biochemistry. 38 (8), 2347-2357 (1999).
  45. Rose, R. J., Damoc, E., Denisov, E., Makarov, A., Heck, A. J. High-sensitivity Orbitrap mass analysis of intact macromolecular assemblies. Nat Methods. 9 (11), 1084-1086 (2012).
  46. Gault, J., et al. High-resolution mass spectrometry of small molecules bound to membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 333-336 (2016).
  47. Mehmood, S., et al. Mass spectrometry captures off-target drug binding and provides mechanistic insights into the human metalloprotease ZMPSTE24. Nat Chem. 8 (12), 1152-1158 (2016).
  48. Kaake, R. M., et al. A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).
  49. Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry. Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).
  50. Walzthoeni, T., et al. False discovery rate estimation for cross-linked peptides identified by mass spectrometry. Nat Methods. 9 (9), 901-903 (2012).
  51. Barrera, N. P., Di Bartolo, N., Booth, P. J., Robinson, C. V. Micelles protect membrane complexes from solution to vacuum. Science. 321 (5886), 243-246 (2008).
  52. Barrera, N. P., et al. Mass spectrometry of membrane transporters reveals subunit stoichiometry and interactions. Nat Methods. 6 (8), 585-587 (2009).
  53. Laganowsky, A., et al. Membrane proteins bind lipids selectively to modulate their structure and function. Nature. 510 (7503), 172-175 (2014).
  54. Marcoux, J., et al. Mass spectrometry reveals synergistic effects of nucleotides, lipids, and drugs binding to a multidrug resistance efflux pump. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9704-9709 (2013).
  55. Politis, A., Schmidt, C. Structural characterisation of medically relevant protein assemblies by integrating mass spectrometry with computational modelling. J Proteomics. , (2017).
  56. Hall, Z., Politis, A., Robinson, C. V. Structural modeling of heteromeric protein complexes from disassembly pathways and ion mobility-mass spectrometry. Structure. 20 (9), 1596-1609 (2012).
  57. Pukala, T. L., et al. Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements. Structure. 17 (9), 1235-1243 (2009).
  58. Politis, A., et al. Topological models of heteromeric protein assemblies from mass spectrometry: application to the yeast eIF3:eIF5 complex. Chem Biol. 22 (1), 117-128 (2015).
  59. Politis, A., et al. A mass spectrometry-based hybrid method for structural modeling of protein complexes. Nat Methods. 11 (4), 403-406 (2014).
  60. Fischer, L., Chen, Z. A., Rappsilber, J. Quantitative cross-linking/mass spectrometry using isotope-labelled cross-linkers. J Proteomics. 88, 120-128 (2013).
  61. Yu, C., et al. Developing a Multiplexed Quantitative Cross-Linking Mass Spectrometry Platform for Comparative Structural Analysis of Protein Complexes. Anal Chem. 88 (20), 10301-10308 (2016).

Tags

ביוכימיה גיליון 129 ספקטרומטריית cross-linking יליד ספקטרומטר מסה מתחמי חלבון אינטראקציות חלבון חלבון סטויכיומטריה רשת חלבון ניתוח נתונים
שילוב cross-linking כימי ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון שלם ללמוד את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון להרכבות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haupt, C., Hofmann, T., Wittig, S.,… More

Haupt, C., Hofmann, T., Wittig, S., Kostmann, S., Politis, A., Schmidt, C. Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies. J. Vis. Exp. (129), e56747, doi:10.3791/56747 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter