Summary
このプロトコルでは、ホルマリン固定組織イメージング質量分析向けの昇華ベース準備の再現性と信頼性の高い方法について説明します。
Abstract
マトリックス支援レーザー脱離イオン化の使用は、質量分析法 (MALDI MSI) をイメージングが急速に広がり、この手法を分析し薬と脂質から N 型糖鎖分子のホスト。様々 な試料前処理技術がありますが、このタイプの質量分析の最も困難な課題の 1 つのままホルムアルデヒド保存組織由来ペプチドの検出です。このため、作成し、イオン化可能なペプチドの最大数を誘発しながら、サンプルに含まれる空間情報を保持する強力な手法を最適化します。めざしていますコスト効果的でシンプルな方法でこれを達成するために自動計測を使用して場合に発生することができます潜在的なバイアスまたは準備エラーがなくなります。最終的な結果は、再現性と安価なプロトコルです。
Introduction
マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法 (MALDI MSI) をイメージングは、二十年1、2、生体分子を含む各種の分析のイメージ ベース技術として採用されている: 脂質3、ペプチド2 ,4タンパク質2、5、代謝物6、7N 型糖鎖8、および合成分子治療薬9,10など。この手法の有用性を示す出版物の数は、最後の 10 年間6,11,12,13以上大幅成長しています。脂質などの特定の分子の化学的性質は容易にイオン化し、こうして必要とする少し前の準備3MALDI MSI を介して分析する比較的簡単です。ペプチドなどより困難な目標は、効果的にこれらの分子をイオン化するために必要な手順が、広範かつ一般に複雑な14。現在、アドレスすることを目指して、このユニークな視覚技術15の組織を準備に採用されている方法論における再現性を示す非常に少数の出版物があります。この理由のため観測をコンパイルや最適化を実装、単一に簡単に実装できる、方法論、ホルムアルデヒドからペプチドの解析のためには少しの変更が必要な架橋組織ソース14。
本稿では、検出とホルマリン固定凍結 (FFF) とホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) ティッシュ セクションから生成されたペプチドの空間マッピングの検証、低コストの再現の方法論を説明しました。この方法論を必要としないか、または任意の特殊な計測3に依存。具体的には、ペプチド; を分析に必要な特殊なサンプル準備の多くの側面に取り組む抗原検索16マトリクス コーティングなどの手順。私達のプロトコルには、安価な装置と試薬、本来なら代替ロボット装置17をできられない人より広いコミュニティにアクセス可能なこの方法がそれにまた利用します。
マニュアル サンプル調製法の開発の後ろの推論は 2 倍だった: 第一に、装置の使用は 〜 1 μ m 長さ18より一般的なスプレーで何かは不可能では、マトリックス結晶の一貫性と均一なコーティングを作成しますテクニック。第二に、コストを比較的小さく設定: カスタム装置の総コストは <$ 1500 豪ドル我々 は、費用対効果の面でに注意、ロボット機械の関与がない場合、サンプルあたりの価格ははるかに安い。昇華の使用報告されている以前は、しかし、我々 の知識を最大限に試料調製をこのプロセスを説明するステップバイ ステップの方法論がない報告も、文献に記載されています。
このプロトコルは、MALDI の質量分析計へのアクセスがあるし、興味19の生体分子に関連する空間情報の生成に専念している研究者を支援するものです。要するに、MALDI MSI は審査組織の形は抗体に依存しないまたは2の汚れを。
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Protocol
注意: 適切な個人用保護具 (PPE) (例えば白衣、ニトリル手袋、安全メガネ等)の使用を含む、この手順を実行するときにすべての適用可能な安全注意が従う必要があります。
1. 試薬・機器の準備
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溶液の調製
- カルノワの液 500 mL を準備するミックス 6 氷酢酸、クロロホルム、100% エタノール (エタノール): きれいなガラス ショット ボトルで v/v/v 比率は 3:1。
- 液体ニトロセルロース (NC) をするためには、40 mg/mL の最終的な集中のための穏やかな攪拌できちんとしたアセトン (西部にしみが付くことでよく使われる) NC 膜を溶解します。
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コーティング NC スライドの準備
- 使用血液の準備のため使用されるものと同様の手法が病理20 NC を準備するため汚れはコーティング スライドです。
- 導電性インジウムの錫の酸化物 (ITO) 顕微鏡のスライドの 1 つの端に液体の NC の 40 μ L をピペットします。通常のガラス顕微鏡スライドを使用して、表面張力の下でノースカロライナをも薄膜を作成するスライドにドラッグします。
- 20 s し、室温で必要になるまで室温で乾燥する NC を許可します。これらの条件下でサンプルのストレージは組織維持され、ほこりの無料提供に明確なできます。
注: このメソッドの準備としてよりもっとよく知られている「薄膜」は、NC の粘度と表面張力にスライドに自己レベルの欠如に依存する均一なコーティングになります。唯一ケア、スライドの準備は早すぎる移動ではないとき取られるべき完全な報道ではなく、NC の縞模様が作成されます。
注意: 液体 NC は非常に迅速に乾燥、ソリューションを適切に普及している前に乾燥を避けるためにすぐに働くことが不可欠です。注意は、高エネルギー化合物であるそれとして液体状態で NC を処理し、放火爆発を防ぐために点火の元に連絡する必要がありますいないときにもすべき。NC も乾燥と皮膚や手袋をはめた手で長時間の接触に入って来ること冷たい火傷を引き起こすことが吸熱転移を経る。たびに、関連するすべてのリスクを最小限に抑える少量が準備されるべき (< 1 つの mL をお勧めします)。一度乾燥し、室温で安定しています。ただし、NC は大量に存在する場合は爆発的な残ることができます。
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カスタム ベーパーチャンバーの作成
- 標準プラスチック シャーレ (94 mm 径で 3 mm 厚) の半分下に合うように十分な大きさのはさみのペアで厚めのあぶらとり紙の部分をカットします。
- センター、紙、ペトリ皿 (補足図 1) 内での位置が維持されるよう十分な余剰を残して顕微鏡スライドと同じサイズの長方形のストリップを残して、紙をカットします。
2. ティッシュ セクションの準備
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FFPE 組織21。
- NC に標準的なベンチ マウントされたミクロトームとフロート マウントで 12 μ m の厚みでそれはプレコート伊藤スライド セクション目的組織ブロックを選択します。
- 新鮮なキシレン、2 分間残留パラフィンを削除するスライドを水没し、操作 2 回を繰り返します。
注: パラフィン ブロックは特に広汎性または組織が比較的小さいパラフィン ブロックと比較して、サンプルがキシレンで洗濯前に大半を離れて溶融する 60 ° C では加熱することができます。 - 傾斜溶剤シリーズのスライドを水没によって deparaffinized のサンプルを洗う: 70 %v/v エタノール/水、100% エタノール、カルノワの流体、100% エタノール、超純水、100% エタノール。各浸水の期間必要があります 30 秒、2 分を持続する必要がありますカルノワの流体を除く。
注意: カルノワの流体とキシレン必要があります保存および吸入した場合非常に有毒な発煙のフード使用します。
-
ホルマリン固定凍結 (FFF) 組織
注: サンプルする必要があります既に凍結する、適切なサンプルの種類に応じて。- 20 分22のミクロトームの動作温度で組織ブロックを平衡します。
注: 平衡温度は組織の種類によって異なります。 - 12 μ m と雪解けのマウントにミクロトームを使用して組織に事前に用意された NC セクション コーティング伊藤セクションにスライドさせます。
- 暗闇の中でベンチに真空デシケータにスライドを格納します。
注: これらの条件の下で数週間のためのサンプルを格納できます。 - 前述した FFPE 組織 (2.1.3) の傾斜溶剤シリーズのサンプルを洗います。
注: 必要はありませんキシレン deparaffinisation ステップのサンプルが埋め込まれていないようです。
- 20 分22のミクロトームの動作温度で組織ブロックを平衡します。
3. メチレン架橋加水分解
- 上部に 20 ミリ モル トリス-HCl (pH 8.8) で満ちているプラスチック製のスライド ボックスにスライドのサンプル (FFF または FFPE) を読み込みます。シール ボックスとボックス下部に触れることができるように、水の 500 mL を含む水のお風呂にそれを置きます。70 kPa の圧力を達成することができる圧力鍋で 120 ° C で 15 分間それを熱します。
- スライドを取り外して冷ます、15 分間常温乾燥させます。
4. 組織消化
- 加水分解し、一度ティッシュ セクションの端に液の 10 μ L 分注による超純水のトリプシン溶液 (1 mg/mL) の 10 μ L のサンプルをコートし、同じピペット チップを使用して、表面の下で組織の表面全体に液滴をドラッグ緊張。
注: 組織のエッジの枠を超えて酵素の拡散上にピペット チップ組織表面を傷つけない。 - 常温乾燥するサンプルを許可します。
- 一度乾燥し、スライド (補足図 2) のどちらかの端にオートクレーブ テープで構築済みの蒸気室 (組織下向き) の上部にあるサンプルをマウントします。
- 600 μ L が均等にウェット指が表示されるまで、100% アセトニ トリルと 50 mM 重炭酸アンモニウム ペトリ皿の底の部分にあぶらとり紙指に慎重の 1:1 v/v ミックスを含む溶液をピペットします。
- 紙指およびサンプル スライドを確保、半分が完全に、整列下部に蒸気室の上半分を置き、パラフィン フィルムの赤道周辺の商工会議所のシールします。
- 完全な消化力を許可する 37 ° C の定温器のサンプルを一晩おきます。
5. マトリックス昇華によるコーティング
- かつて消化、5 桁の微量分析バランスのサンプル スライドの重量を量る。
- 昇華装置の冷却の指の上にスライドをマウントし、蒸気室 (補足図 3) のとおり同じように銅テープで固定します。
注: スライドは冷却指で均等に連絡を確保するため、銅テープの層は水平な面に冷却の指の下に配置されます。これは行列も沈着につながるスライドは均等に冷却されることを保証します。 - 商工会議所とマトリックス結晶の薄膜を作成する均等に広がりの下部にガラス シャーレに 300 mg の α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 (CHCA) マトリックスを配置します。
- 技術を組み立て、馬蹄形クランプで 2 つの半分を固定します。220 ° C でレトルト スタンドに接続されている金属製のリングに置くことで予熱、砂浴上組み立てユニット 15-20 cm を中断します。
- 真空源に商工会議所を接続し、真空を従事、5 分 ~ 25 mTorr に安定させることができます。
- パック氷の上に指を冷却し、50 mL の水を追加します。続行する前にさらに 5 分のために解決する装置を許可します。
- 砂、チャンバーの底に完全に接触を確保、砂の表面に商工会議所を下げ、0.22 mg/cm2の理想的なコーティングを作成する 45 分のためにそれを残す
注意: ガラス室の致命的な障害で避難中、装置への損傷として高真空でガラスを処理結果ことができる場合は、注意をすべき。 - 45 分後に金属製のリングを上げることによって砂浴からチャンバーを削除し、商工会議所をぶちまけます。
注: 商工会議所がベントされて、一度スライドする必要があります削除する空気中の水分が凍結指およびサンプル スライドを凝縮して開始されます非常に迅速に。 - スライドを削除し、目的のコーティングが達成されていることを確認するそれの重量を量る。
注: 場合が不足してコーティングを達成すると、プロセスを繰り返して昇華スライドの必要な塗膜厚さを達成するまで。
6. 再結晶
- ・昇華し、一度説明以前 (組織下向き) として構築済みの蒸気室の上部にあるサンプルのスライドをマウントします。
- 溶液の均一なコーティングをしてシャーレの底の部分であぶらとり紙の上に慎重に水に酸「100% アセトニ トリルと 0.1% v/v トリフルオロ酢酸の 1:1 (v/v) ミックス 600 μ L をピペットします。
- 商工会議所を組み立てる、完全に合わせ、1 h の 37 ° C の定温器のまま紙タブや顕微鏡スライドを確保します。
注意: は、商工会議所をシールしないでください。
注: 再結晶、一度行列の通常黄色の色合いが白に変更より少なく光沢がある、および表示も非常に。これはその結晶が正しく実行されたことを示します。 - サンプルは、分析の準備が整いました。
7 計装
- デジタル イメージを作成するフラットベッドスキャナーのスライドをスキャンします。
- 質量分析計にサンプルをロードし、適切なソフトウェア プラットフォームを使用して分析します。
- 750 3,500 Da、望ましい結果に適用されているスポットの解像度の質量範囲で肯定的なイオン リフレクトロン モードのサンプルを分析します。ほとんどの場合、20-50 μ m のラスターの幅が十分では 10 μ m、しかしわずかに使用される15。
注意: MALDI UV レーザー電離放射線の源は、直接表示すべき。レーザー計測器は、操作の前にシールド内で含まれていることを確認します。
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Representative Results
場合、このプロトコルは総傷やその他の変形 (図 1) なし組織形態を明確に表すイメージを生成します。正しく実行されたサンプルの準備のための理想的な検証はされている分子を変更することによって別の物理的な構造を区別する能力 (図 2)。
サンプルは正しく準備されているかを判断する良いガイドは非局在化またはマトリックス集計の有無をチェックするには身体組織の境界を超えて拡張ペプチド署名は、分子はサンプル準備中に移動している完璧なインジケーターです。・ オルークとパドゥーラの詳細で説明されて (2017)15。
作り出されたペプチド スペクトルは選ばれた質量範囲1,23にも分散されている個別の分子の高い豊かさを含める必要があります (これは主依存サンプルです、しかし、それは 50 を超えることも珍しくないです。FFPE 組織から離散ペプチド署名) (図 3)18。
図 1: FFF 人間の脳組織の正しく準備されたサンプル。この加工組織標本は、50 μ m でイメージされているし、良いマクロ構造と白質 (WM) と灰白質 (GM) の明確な違いを示しています。正常に準備されたサンプルは、異なる組織の場所の明確な差別化が表示されます。ここでは、(質量電荷比、M/Z によって表される) ペプチドのアップレギュレーションの明確な領域があるパネル C. のリターン続いて A. 分化が一層パネル B の定義済み図形の不在によって明示されるパネルの WM 地域で 1085同じティッシュ セクションを 3 つの異なる分子の分布を試金し、いくつかは一律に示す分散、その他は個別の物理的な場所に限定されている、我々 は試料が正しく実行されていることを見ることができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: FFF 人間の脳組織の正しく準備セクション。この標本は、50 μ m でイメージされているが、非局在化の大規模なレベルを示しています。パネル 1、2、3 本の分子のパターンは、図 1とは異なり、生物学的領域または表示される分子の豊かさの違いの間の明確な定義はありません明確に示しています。画像を選択して表示、分子に関係なく、同じなので、それがされて非局在正しく準備されているためいえます。これは、脳の組織は、この結果は論理、生物学的意味を行いません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: で表示されるイメージのグローバル質量スペクトル図 1。スペクトルには同様存在いくつかの高質量ペプチド ピークの質量範囲の下端のペプチド署名の豊富が含まれます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1: 蒸気室に使用あぶらとり紙を断裁スケマティック。厚めのあぶらとり紙は、94 の mm の直径の円形にカットされます。長方形のタブは標準的なガラス顕微鏡スライドのサイズに対応するカットも。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 2: ベーパーチャンバーのアセンブリ模式図。この回路図では、サンプル スライド、あぶらとり紙、粘着テープがお互いにどのように対応しているかの特定のノートと蒸気室が組み立てられる方法を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 3: 昇華商工会議所総会概略:この図は、再現可能な昇華できるようにサンプル スライド、装置、および暖房器具を配置する方法を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、検体の非局在化を排除しながらイオン化可能な分子種の生成を最大化するために設計されました。重要な要因を含む行列、サンプルを消化したり昇華24; 後再結晶を適用するとき、同じ基本原則を使用してすなわち、蒸気も沈着マトリックスまたはそれ以外の場合、作成および管理する必要があります。再結晶と均等にサンプルの下に、消化の溶剤洗浄をピペッティングどこよりもより多くの溶剤蒸気を受け取る個々 の領域を防ぎます。これは目に見える結露の形成を予防する重要な全体的にサンプルが均等に消化され、再結晶したことの保障し同様、表面の分子の非局在化を阻害します。それは、あまりにも少ない比較的低強度と種の多様性が表示されます行列のも沈着を達成するために不可欠です、あまりにも強度と25種の多様性を低下させる、サンプルからイオンを抑制します。行列も沈着を達成するために中断された顕微鏡スライドのフット プリントの真下でも、薄い均一なサイズのマトリックス結晶層が置かれることを確認します。レイヤーが凹凸や薄すぎるのか、行列の昇華もゆっくり進むが不均一な26になります。溶媒の手動でのアプリケーションの問題し、酵素がユーザーの個々 の経験になります。再現性のある結果を確保するために「実践」のいくつかのレベルが必要し、いくつかの初期の偶発的な不適切な準備があります。しかし、最終的なイメージの「良い」のサンプルの特性に応じて確実に注意かどうか我々 が提供している、偽の生物学的結論につながるれません正しく準備されたサンプル。
ホルムアルデヒド (FFPE または FFF) で保存されます組織サンプルを効果的に消化するためには、トリプシン蒸着16前に可能な限りメチレン架橋の多くを削除する不可欠です。これは簡単に圧力鍋でのサンプルを加熱することによって実現 > 実際にサンプルを切り離すこともできます機械的に気泡を発生させることがなく、短い持続期間のための 100 ° C。組織が簡単に失われますので、これを戦うためにこのような方法で扱われる場合 NC スライドを採用します。必須ではサンプルの熱、圧力、および有機溶媒にさらされたときの物理的な整合性を確認それは。サンプルの消化し、その活性化をできない状態にある酵素を適用して、乾燥、つまり超純粋な水で中断することによって実現されます。蒸気室次再結晶、十分に遭遇して蛋白質のバックボーンがドリフトする結果として得られるペプチドを許可するように十分な「うるおい」を切断する酵素のローカライズされた動きを許可するように湿度の高い環境を提供することと同じ原理大幅にから彼らの最初の場所の26。スライドに直接ピペッティングしても、残留架橋の影響と水の大きい蛋白質の一般的な不溶性のため、任意の表面 analytes は発想しません。
この方法論のペプチドへの応用に注力は、そのままな蛋白質、脂質、代謝物の分析のためのワークフローに簡単に適用できます。いくつかの手順が削除または拡張; する必要があります。そのまま蛋白質のイメージングを必要はありません任意の蛋白質分解開裂ステップがサンプルの断面の基本的なワークフローとマトリックス昇華、再結晶、および分析に続いて取付はほぼすべてのサンプル タイプに適用できます。このプロトコルの開発とその信頼性と豊富な実証調査で堅牢性を確保するために我々 の意図は、安価な機器を使用し、ワイドに従う義務があるほとんど、あるいはまったく変更を必要とするメソッドを作成するには計測器および生化学的なスキルの度合いとコミュニティ。我々 は、これはそれ以外の場合非常に複雑なまたは高価として、この手法を却下しているだろう所への調査の新しい道を開くことを願っています。ペプチド MSI の最初の決定的な試料作製法を提供するいると確信しております。執筆の時に、ほとんどの方法論されて主にインストルメンテーション ベース、ロボット スプレーの使いやすさを特に重視してベースの方法論27,28,29。されてあります信頼性の高いメチレン加水分解の方法論を正しい手順と使用する装置として予想の方法で少しが。
結論としては、FFPE と FFF の組織への上記の方法論の応用は MSI のペプチドの解析の有効性で大きな自信になりますと考えています。
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Disclosures
利害の対立や商業的な関心を開示する著者があります。
Acknowledgments
著者は、アルツハイマー病研究及びパークウェイに与えられるアーク探索補助金 (DP160102063) のための博士課程奨学金プログラムを通じてこの仕事の一部を資金調達のためシドニー医療学校財団とブルースと基礎を確認したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
References
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