Dit protocol beschrijft een reproduceerbare en betrouwbare methode voor de sublimatie gebaseerde voorbereiding van formaline vaste weefsels die bestemd zijn voor imaging Spectrometrie van de massa.
Het gebruik van laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie, Spectrometrie van de massa (MALDI MSI) imaging is snel uitgebreid, aangezien deze techniek een schare van biomoleculen van drugs en lipiden aan N-glycanen analyseert. Hoewel verschillende monster voorbereiding technieken bestaan, blijft opsporen van peptiden van formaldehyde weefsels bewaard een van de moeilijkste uitdagingen voor dit soort massaspectrometrische analyse. Om deze reden hebben we gemaakt en geoptimaliseerd een robuuste methodologie, die de ruimtelijke gegevens die deel uitmaakt van het monster, terwijl het opwekken van het grootste aantal ioniseerbare peptiden behouden blijven. We hebben er ook op gericht om dit te bereiken in een voordelige en eenvoudige manier, zodat er geen potentiële bias of het preparaat fout, die zich voordoen kan wanneer met behulp van instrumentatie geautomatiseerde. Het eindresultaat is een reproduceerbare en goedkope protocol.
Laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie imaging (MALDI MSI) heeft gewerkt als een beeld gebaseerde techniek voor twee decennia1,2, analyseren van een aantal biomoleculen inclusief: lipiden3, peptiden2 ,4, eiwitten2,5, metabolieten6,7, N-glycanen8en synthetische moleculen zoals therapeutische drugs9,10. Het aantal publicaties aan te tonen het nut van deze techniek zijn de afgelopen tien jaar6,11,12,13aanzienlijk toegenomen. Bepaalde moleculen, zoals lipiden, zijn relatief eenvoudig te analyseren via MALDI MSI, zoals zij gemakkelijk te als gevolg van de chemische aard ioniseren en dus weinig voorafgaande voorbereiding3 vereisen. Voor moeilijker doelen zoals peptiden zijn de stappen die nodig zijn om effectief deze moleculen ioniseren echter uitgebreid en over het algemeen ingewikkeld14. Momenteel zijn er weinig publicaties die gericht zijn op adres of aantonen van reproduceerbaarheid in de methodologieën die werkzaam zijn voor te bereiden op weefsel deze unieke visuele techniek15. Om deze reden hebben we samengesteld van opmerkingen en geïmplementeerd optimalisaties in één eenvoudig te implementeren, methodologie die weinig tot geen wijziging, voor de analyse van peptides van een formaldehyde moet kruiselings gekoppelde weefsel bron14.
In dit manuscript, hebben we een gevalideerde, low-cost reproduceerbare methodologie voor de detectie en ruimtelijke toewijzing van peptides, gegenereerd op basis van formaline-vaste bevroren (FFF) en formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) weefselsecties beschreven. Deze methodologie niet vereisen of vertrouwen op een gespecialiseerde instrumentatie-3. Specifiek, ingaan we op de vele aspecten van gespecialiseerde monstervoorbereiding noodzakelijk om te analyseren van peptiden; stappen zoals antigeen ophalen16 en matrix coating. Ons protocol maakt ook gebruik van goedkope apparatuur en reagentia, waardoor deze methode toegankelijk te maken voor een bredere gemeenschap die anders zouden kunnen veroorloven de alternatieve robotic apparaat17.
De redenering achter de ontwikkeling van een handmatige monster voorbereiding methode was tweeledig: ten eerste, het gebruik van een sublimator maakt een coherente en homogene deklaag van kristallen van de matrix die ~ 1 µm in lengte18, iets niet haalbaar met de gemeenschappelijkere spuiten technieken. Ten tweede, de relatief kleine set-up kosten: de totale kosten van de aangepaste apparatuur was <$ 1500 AUD. Wij stellen vast, in termen van kosteneffectiviteit, dat de prijs per monster is veel goedkoper als er geen robotachtige machines betrokken. Het gebruik van sublimatie is gemeld eerder, echter tot de beste van onze kennis, stapsgewijze methodologieën die dit proces beschrijven en proef de voorbereiding hebben niet gemeld noch in de literatuur beschreven.
Dit protocol is bedoeld om te helpen van onderzoekers die beschikken over een MALDI-massaspectrometer en wie zijn bedoeling op het genereren van ruimtelijke informatie met betrekking tot een bio-molecule van belang19. In wezen, is MALDI MSI een vorm van histologische screening die niet afhankelijk is van antilichamen of vlekken2.
Dit protocol werd ontworpen om te maximaliseren van de generatie van ioniseerbare moleculaire soorten terwijl het elimineren van de verplaatsing van de analyten. De belangrijkste factoren betrekken met behulp van hetzelfde overkoepelende principe bij de toepassing van de matrix, het verteren van het monster, of recrystallizing na sublimatie24; namelijk, dat een zelfs afzetting van damp, matrix of anders moet worden gemaakt en onderhouden. Pipetteren oplosmiddel wast voor herkristallisatie en spijs…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs wil erkennen de Sydney Medical School Foundation en de Blues en de Stichting voor financiering deel van dit werk door middel van hun PhD scholarship programma voor onderzoek van de ziekte van Alzheimer en een ARC Discovery subsidie (DP160102063) tot PKW.
Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |