Summary

펩타이드 기반 매트릭스 샘플을 고정 하는 포 르 말린의 최적의 준비 지원 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징 워크플로

Published: January 16, 2018
doi:

Summary

이 프로토콜의 포 르 말린 고정 조직을 이미징 질량 분석에 대 한 운명 승화 기반 준비에 대 한 재현 가능 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다.

Abstract

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화를 사용 하 여, 질량 분석 이미징 (MALDI MSI) 급속 하 게 확장 했다, 때문에이 기술은 분석 N-glycans에 약물과 지질에서 생체의 호스트. 다양 한 샘플 준비 기술 존재 감지 포름알데히드 보존 조직에서에서 펩 티 드 대량 spectrometric 분석의이 유형에 대 한 가장 어려운 문제 중 하나 남아 있다. 이러한 이유로, 우리 만든 고 최적화 ionizable 펩 티 드의 가장 큰 수를 도출 하는 동안 샘플에 포함 된 공간 정보를 유지 하는 강력한 방법. 우리는 또한 목적 비용 효과적이 고 간단한 방법으로 이것을 달성 함으로써 계측 자동화를 사용 하 여 때 발생할 수 있는 잠재적인 편견 또는 준비 오류를 제거. 최종 결과 저렴 하 고 재현할 수 프로토콜.

Introduction

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석기 (MALDI MSI) 이미징 대 한 2 년간1,2, 생체 등의 범위를 분석 이미지 기반 기술로 고용 되었다: 지질3, 펩 티 드2 ,4, 단백질2,5, 대사6,7, N-glycans8및 치료 약물9,10같은 합성 분자. 이 기술은의 유틸리티를 시연 하는 간행물의 수는 지난 10 년간6,11,,1213이상 크게 성장 했다. 지질, 같은 특정 분자는 MALDI MSI를 통해 분석 하는 그들은 그들의 화학 특성으로 인해 쉽게 이온화 하 고 따라서 필요한 작은 사전 준비3상대적으로 쉽습니다. 그러나, 펩 티 드와 같은 더 어려운 목표를 위해 효과적으로이 분자를 이온화 하는 데 필요한 단계는 일반적으로 복잡 하 고 광범위 한14. 현재 주소로 목표로 또는 재현성이 독특한 비주얼 기법15조직 준비 하 고용 방법론에서을 설명 하는 거의 게시 있다. 이러한 이유로, 우리는 관찰 컴파일되고 최적화 구현 단일으로 구현 하기 쉬운 방법론은 포름알데히드에서 펩 티 드의 분석에 대 한 더 작은 수정 해야 했더라도 조직 소스14.

이 원고에서 우리 검색 및 포 르 말린 고정 언된 (FFF) 및 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 섹션에서 생성 된 펩 티 드의 공간 매핑 확인, 저렴 한 비용 재현할 방법론을 설명 했습니다. 이 방법론 필요 또는 어떤 특수 계측3에 의존 하지 않습니다. 특히, 우리; 펩 티 드를 분석 하는 데 필요한 전문된 샘플 준비의 많은 측면을 해결 antigen 검색16 등 매트릭스 코팅 단계. 우리의 프로토콜은 또한 저렴 한 장비 및 시 약, 그렇지 않으면 수 없습니다 대체 로봇 기구17살 하는 더 넓은 지역 사회에 액세스할 수 하이 방법론을 활용 합니다.

수동 샘플 준비 방법 개발 뒤에 추론 했다 두 배: 첫째,는 sublimator 사용 하 여 만듭니다 ~ 1 µ m 길이18, 뭔가 더 일반적인 분사 unachievable는 매트릭스 결정의 일관성과 균일 코팅 기술입니다. 둘째, 비용의 상대적으로 작은 설정: 사용자 정의 장치의 총 비용은 <$ 1500 AUD. 우리는 비용 효율성 측면에서 샘플 당 가격이 훨씬 저렴 관련 없는 로봇 기계 때 주의. 그러나 승화를 사용 하 여 보고 되었습니다 이전,, 우리의 지식 최선을 다 해 준비 하 고이 과정을 설명 하는 단계별 방법론도 보고 되어 하지 문학에서 설명.

이 프로토콜은 연구자는 MALDI 질량 분석기에 대 한 액세스를가지고 누군지 관심19의 바이오 분자에 관하여 공간 정보 생성에 도움을 것입니다. 본질적으로, MALDI MSI 조직학을 심사의 항 체에 의존 하지 않는 또는2얼룩입니다.

Protocol

주의: 모든 적용 가능한 안전 주의 사항은 따라야 할 적절 한 개인 보호 장비 (PPE) (예: 실험실 코트, 니트 릴 장갑, 안전 안경, 등)의 사용을 포함 하 여이 절차를 수행할 때 1입니다. 시 약 및 장비 준비 솔루션의 준비 Carnoy의 액체의 500 mL, 혼합 준비 100% 에탄올 (EtOH), 클로 프롬, 및 6에 빙 초 산: 깨끗 한 유리병 쇼트에서에서 3:1 v/v/v 비율…

Representative Results

정확 하 게 따라 하는 경우이 프로토콜 명확 하 게 어떤 찰 상 또는 다른 변형 (그림 1) 없이 조직의 심한 형태를 나타내는 이미지를 생성 합니다. 올바르게 수행된 샘플 준비를 위한 이상적인 유효성 검사 되는 분자를 변경 하 여 다른 물리적 구조 사이 구별 하는 기능 (그림 2) 볼 이다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=…

Discussion

이 프로토콜은 analytes의 delocalization를 제거 하는 동안 ionizable 분자 종의 생성을 극대화 하도록 설계 되었습니다. 매트릭스, 샘플, 소화 또는 승화24; 후 recrystallizing를 적용할 때 동일한 재정의 원리를 사용 하 여 포함 하는 주요 요인 즉, 그의 증기도 증 착 매트릭스 또는 그렇지 않으면, 창조 되 고 유지 필요. Recrystallization와 소화, 균등 하 게 샘플을 아래에 대 한 용 매 세척 pipetting…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 Alzheimer의 질병 연구와 PKW에 게 수 여 한 호 발견 그랜트 (DP160102063)에 대 한 그들의 박사 학위 장학금 프로그램을 통해이 작품의 일부 자금에 대 한 시드니 의료 학교 재단 및 파랑 및 재단을 인정 하 고 싶습니다.

Materials

Cryo Microtome Leica CM3050 For preparation and section of tissue.
Indium Tin Oxide Microscope slides Bruker 8237001 For preparation and section of tissue.
Coplin Jars Sigma Aldrich S5516 For preparation and section of tissue.
Pressure Cooker Kambrook KPR620BSS For preparation and section of tissue.
Sublimator Chem Glass NA For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made 
Sand bath NA NA For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company
Glass Petri Dish Sigma Aldrich CLS70165100 For sublimation procedure.
Vacuum Pump NA NA For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer 
Cold trap Chem Glass CG-4510-02 For sublimation procedure.
Hot Plate John Morris EW-15956-32.  For sublimation procedure.
Plastic petri dish Sigma Aldrich Z717223 For sublimation procedure.
37 °C incubator NA NA For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old 
Blotting paper Sigma Aldrich P7796 For sublimation procedure.
Nitrocellulose  Sigma Aldrich N8395 For washing of slides.
Acetone Sigma Aldrich 650501 For washing of slides.
Xylene Sigma Aldrich 214736 For washing of slides.
100% EtOH Sigma Aldrich 1.02428 For washing of slides.
70% EtOH Sigma Aldrich NA For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol 
Chloroform Sigma Aldrich C2432 For washing of slides.
Glacial Acetic Acid Sigma Aldrich ARK2183 For washing of slides.
Tris HCL pH 8.8 Sigma Aldrich TRIS-RO For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8
Milli Q Ultra-Pure Water Sigma Aldrich NA For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system
Ammonium Bircarbonate Sigma Aldrich A6141 For proteolytic cleavage. 
Trypsin Sigma Aldrich T0303 For proteolytic cleavage. 
CHCA Matrix Sigma Aldrich C2020 For recrystallisation.
Acetonitrile Sigma Aldrich 1.00029 For recrystallisation.
Trifluoroacetic Acid (TFA)  Sigma Aldrich 302031 For recrystallisation.

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O’Rourke, M. B., Padula, M. P., Smith, C., Youssef, P., Cordwell, S., Witting, P., Sutherland, G., Crossett, B. Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows. J. Vis. Exp. (131), e56778, doi:10.3791/56778 (2018).

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