펩타이드 기반 매트릭스 샘플을 고정 하는 포 르 말린의 최적의 준비 지원 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징 워크플로

Summary

이 프로토콜의 포 르 말린 고정 조직을 이미징 질량 분석에 대 한 운명 승화 기반 준비에 대 한 재현 가능 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다.

Abstract

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화를 사용 하 여, 질량 분석 이미징 (MALDI MSI) 급속 하 게 확장 했다, 때문에이 기술은 분석 N-glycans에 약물과 지질에서 생체의 호스트. 다양 한 샘플 준비 기술 존재 감지 포름알데히드 보존 조직에서에서 펩 티 드 대량 spectrometric 분석의이 유형에 대 한 가장 어려운 문제 중 하나 남아 있다. 이러한 이유로, 우리 만든 고 최적화 ionizable 펩 티 드의 가장 큰 수를 도출 하는 동안 샘플에 포함 된 공간 정보를 유지 하는 강력한 방법. 우리는 또한 목적 비용 효과적이 고 간단한 방법으로 이것을 달성 함으로써 계측 자동화를 사용 하 여 때 발생할 수 있는 잠재적인 편견 또는 준비 오류를 제거. 최종 결과 저렴 하 고 재현할 수 프로토콜.

Introduction

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석기 (MALDI MSI) 이미징 대 한 2 년간^1,2, 생체 등의 범위를 분석 이미지 기반 기술로 고용 되었다: 지질³, 펩 티 드^{2 ,4}, 단백질^2,5, 대사^6,7, N-glycans⁸및 치료 약물^9,10같은 합성 분자. 이 기술은의 유틸리티를 시연 하는 간행물의 수는 지난 10 년간^6,11,,1213이상 크게 성장 했다. 지질, 같은 특정 분자는 MALDI MSI를 통해 분석 하는 그들은 그들의 화학 특성으로 인해 쉽게 이온화 하 고 따라서 필요한 작은 사전 준비³상대적으로 쉽습니다. 그러나, 펩 티 드와 같은 더 어려운 목표를 위해 효과적으로이 분자를 이온화 하는 데 필요한 단계는 일반적으로 복잡 하 고 광범위 한¹⁴. 현재 주소로 목표로 또는 재현성이 독특한 비주얼 기법¹⁵조직 준비 하 고용 방법론에서을 설명 하는 거의 게시 있다. 이러한 이유로, 우리는 관찰 컴파일되고 최적화 구현 단일으로 구현 하기 쉬운 방법론은 포름알데히드에서 펩 티 드의 분석에 대 한 더 작은 수정 해야 했더라도 조직 소스¹⁴.

이 원고에서 우리 검색 및 포 르 말린 고정 언된 (FFF) 및 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 섹션에서 생성 된 펩 티 드의 공간 매핑 확인, 저렴 한 비용 재현할 방법론을 설명 했습니다. 이 방법론 필요 또는 어떤 특수 계측³에 의존 하지 않습니다. 특히, 우리; 펩 티 드를 분석 하는 데 필요한 전문된 샘플 준비의 많은 측면을 해결 antigen 검색¹⁶ 등 매트릭스 코팅 단계. 우리의 프로토콜은 또한 저렴 한 장비 및 시 약, 그렇지 않으면 수 없습니다 대체 로봇 기구¹⁷살 하는 더 넓은 지역 사회에 액세스할 수 하이 방법론을 활용 합니다.

수동 샘플 준비 방법 개발 뒤에 추론 했다 두 배: 첫째,는 sublimator 사용 하 여 만듭니다 ~ 1 µ m 길이¹⁸, 뭔가 더 일반적인 분사 unachievable는 매트릭스 결정의 일관성과 균일 코팅 기술입니다. 둘째, 비용의 상대적으로 작은 설정: 사용자 정의 장치의 총 비용은 <$ 1500 AUD. 우리는 비용 효율성 측면에서 샘플 당 가격이 훨씬 저렴 관련 없는 로봇 기계 때 주의. 그러나 승화를 사용 하 여 보고 되었습니다 이전,, 우리의 지식 최선을 다 해 준비 하 고이 과정을 설명 하는 단계별 방법론도 보고 되어 하지 문학에서 설명.

이 프로토콜은 연구자는 MALDI 질량 분석기에 대 한 액세스를가지고 누군지 관심¹⁹의 바이오 분자에 관하여 공간 정보 생성에 도움을 것입니다. 본질적으로, MALDI MSI 조직학을 심사의 항 체에 의존 하지 않는 또는²얼룩입니다.

Protocol

주의: 모든 적용 가능한 안전 주의 사항은 따라야 할 적절 한 개인 보호 장비 (PPE) (예: 실험실 코트, 니트 릴 장갑, 안전 안경, 등)의 사용을 포함 하 여이 절차를 수행할 때 1입니다. 시 약 및 장비 준비 솔루션의 준비 Carnoy의 액체의 500 mL, 혼합 준비 100% 에탄올 (EtOH), 클로 프롬, 및 6에 빙 초 산: 깨끗 한 유리병 쇼트에서에서 3:1 v/v/v 비율…

Representative Results

정확 하 게 따라 하는 경우이 프로토콜 명확 하 게 어떤 찰 상 또는 다른 변형 (그림 1) 없이 조직의 심한 형태를 나타내는 이미지를 생성 합니다. 올바르게 수행된 샘플 준비를 위한 이상적인 유효성 검사 되는 분자를 변경 하 여 다른 물리적 구조 사이 구별 하는 기능 (그림 2) 볼 이다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=…

Discussion

이 프로토콜은 analytes의 delocalization를 제거 하는 동안 ionizable 분자 종의 생성을 극대화 하도록 설계 되었습니다. 매트릭스, 샘플, 소화 또는 승화²⁴; 후 recrystallizing를 적용할 때 동일한 재정의 원리를 사용 하 여 포함 하는 주요 요인 즉, 그의 증기도 증 착 매트릭스 또는 그렇지 않으면, 창조 되 고 유지 필요. Recrystallization와 소화, 균등 하 게 샘플을 아래에 대 한 용 매 세척 pipetting…

Materials

Cryo Microtome	Leica	CM3050	For preparation and section of tissue.
Indium Tin Oxide Microscope slides	Bruker	8237001	For preparation and section of tissue.
Coplin Jars	Sigma Aldrich	S5516	For preparation and section of tissue.
Pressure Cooker	Kambrook	KPR620BSS	For preparation and section of tissue.
Sublimator	Chem Glass	NA	For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made
Sand bath	NA	NA	For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company
Glass Petri Dish	Sigma Aldrich	CLS70165100	For sublimation procedure.
Vacuum Pump	NA	NA	For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer
Cold trap	Chem Glass	CG-4510-02	For sublimation procedure.
Hot Plate	John Morris	EW-15956-32.	For sublimation procedure.
Plastic petri dish	Sigma Aldrich	Z717223	For sublimation procedure.
37 °C incubator	NA	NA	For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old
Blotting paper	Sigma Aldrich	P7796	For sublimation procedure.
Nitrocellulose	Sigma Aldrich	N8395	For washing of slides.
Acetone	Sigma Aldrich	650501	For washing of slides.
Xylene	Sigma Aldrich	214736	For washing of slides.
100% EtOH	Sigma Aldrich	1.02428	For washing of slides.
70% EtOH	Sigma Aldrich	NA	For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol
Chloroform	Sigma Aldrich	C2432	For washing of slides.
Glacial Acetic Acid	Sigma Aldrich	ARK2183	For washing of slides.
Tris HCL pH 8.8	Sigma Aldrich	TRIS-RO	For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8
Milli Q Ultra-Pure Water	Sigma Aldrich	NA	For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system
Ammonium Bircarbonate	Sigma Aldrich	A6141	For proteolytic cleavage.
Trypsin	Sigma Aldrich	T0303	For proteolytic cleavage.
CHCA Matrix	Sigma Aldrich	C2020	For recrystallisation.
Acetonitrile	Sigma Aldrich	1.00029	For recrystallisation.
Trifluoroacetic Acid (TFA)	Sigma Aldrich	302031	For recrystallisation.