Оптимальная подготовка формалин фиксированной образцы для пептида основан матрицу помогает лазерная десорбция/ионизации масс-спектрометрия визуализации рабочих процессов
Summary
Этот протокол описывает воспроизводимость и надежный метод для подготовки на основе сублимации формалин фиксированной ткани, предназначенные для визуализации масс-спектрометрии.
Abstract
Использование матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации, масс-спектрометрия MALDI imaging (MALDI MSI) быстро расширяется, так как этот метод анализирует множество биомолекулы от наркотиков и липиды для N-гликанов. Хотя существуют различные методы подготовки образца, обнаружения пептиды с формальдегидом сохранить ткани остается одним из самых трудных задач для этого типа масс-спектрометрических анализа. По этой причине мы создали и оптимизированы надежной методологии, которая сохраняет пространственной информации, содержащихся в образце, заручаясь наибольшее количество ionizable пептидов. Также мы стремились добиться этого в экономически эффективным и простым способом, устраняя тем самым потенциальной предвзятости или подготовка ошибка, которая может произойти, когда с помощью автоматизированных инструментария. Конечным результатом является протокол воспроизводимость и недорогой.
Introduction
При содействии матрицы лазерной десорбции/ионизации масс-спектрометрии изображений (MALDI MSI) был нанят в качестве изображения на основе методики для двух десятилетий1,2, анализируя спектр включая биомолекулы: липиды3, пептиды2 ,4, белки2,5, метаболитов6,7, N-гликанов8и синтетические молекулы, такие как лечебных препаратов9,10. Количество публикаций, демонстрируя полезность этого метода значительно выросли за последние десятилетия6,11,12,13. Некоторые молекулы, такие как липиды, являются относительно легко проанализировать через MALDI MSI, как они ионизируют легко из-за их химической природы и таким образом требуют мало предварительной подготовки3. Однако для более сложных целей, как пептиды, шаги, необходимые для эффективного ионизировать эти молекулы являются обширные и вообще сложно14. В настоящее время существует очень мало публикаций, которые направлены на адрес или продемонстрировать повторяемость в методологиях, которые используются для подготовки ткани Этот уникальный визуальный метод15. По этой причине, мы собрали наблюдений и реализовано оптимизаций в единый, легко осуществить, методологии, которые следует требуют практически нет изменений, для анализа пептидов из формальдегида сшитого ткани источника14.
В этой рукописи мы описали проверенных, низкая стоимость, воспроизводимые методологии для обнаружения и пространственного картографирования пептиды, полученные формалин Исправлена замороженные (FFF) и формалин Исправлена парафин врезанных разделов ткани (FFPE). Эта методология не требует и не полагаться на любой специализированный инструментарий3. В частности мы решить многие аспекты специализированных пробоподготовки, необходимых для анализа пептидов; такие шаги, как антиген извлечения16 и покрытие матрицы. Наш протокол также использует недорогое оборудование и реагенты, тем самым делая доступными для более широкого сообщества, которые в противном случае будет не в состоянии позволить себе альтернативного роботизированной аппарат17этой методологии.
Обоснование разработки метода подготовки ручной выборки был два раза: во-первых, использование sublimator создает последовательного и однородное покрытие матрицы кристаллов, которые являются ~ 1 мкм в длину18, что-то недостижимое с более распространенными распыления методы. Во-вторых относительно небольшой набор расходы: Общая стоимость аппарата настраиваемые был <$ 1500 AUD. Мы отмечаем, что с точки зрения эффективности затрат, Цена за образец гораздо дешевле, когда есть без роботов техники. Использование сублимации уже сообщалось ранее, однако, в меру наших знаний, шаг за шагом методологий, которые описывают этот процесс и пробоподготовки, не сообщили ни не описаны в литературе.
Этот протокол предназначен для оказания помощи исследователям, имеют доступ к Малди масс-спектрометром и которые намерены генерации пространственной информации применительно к био молекула интерес19. По сути MALDI MSI является формой гистологическое обследование, не полагаться на антитела или пятна2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол был разработан для получения максимального дохода ionizable молекулярных видов устраняя делокализация аналитов. Ключевые факторы связаны с использованием же основополагающий принцип при применении матрицы, переваривание образца, или recrystallizing после сублимации24</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы признать Сидней фонд медицинской школы и блюз и фонд для финансирования части этой работы через их кандидат Стипендиальной программы для исследования болезни Альцгеймера и обнаружения дуги гранта (DP160102063) для ГИК.
Materials
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
References
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
- Jackson, S. N., et al. MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode. Analytical methods : advancing methods and applications. 6 (14), 5001-5007 (2014).
- O’Rourke, M. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A non-instrument-based method for the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded human spinal cord via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (19), 1836-1840 (2015).
- O’Rourke, M. B., Raymond, B. B. A., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (7), 637-644 (2015).
- Chughtai, K., Heeren, R. M. Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chem Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75 (1), 130-145 (2013).
- Powers, T. W., et al. MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays. PLoS One. 9 (9), 10655 (2014).
- Rompp, A., Spengler, B. Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space. Histochem Cell Biol. 139 (6), 759-783 (2013).
- Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andren, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
- Alexandrov, T. MALDI imaging mass spectrometry: statistical data analysis and current computational challenges. BMC Bioinformatics. 13, 11 (2012).
- Weaver, E. M., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures. Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nat Rev Microbiol. 9 (9), 683-694 (2011).
- O’Rourke, M., Padula, M. The Non-Instrument Based Preparation of Tissue Samples Destined for Imaging Mass Spectrometry (IMS) Analysis. Protocol Exchange. , (2017).
- O’Rourke, M. B., Padula, M. P. A new standard of visual data representation for imaging mass spectrometry. Proteomics Clin Appl. 11 (3-4), (2017).
- O’Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Casadonte, R., Caprioli, R. M. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry. Nat. Protocols. 6 (11), 1695-1709 (2011).
- Ong, T. H., et al. Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea. J Biol Chem. 291 (15), 8109-8120 (2016).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
- . Blood-smear showing Experimental Infection with Herpetomonas. Proc R Soc Med. 18, 55 (1925).
- Gorrie, C. A., et al. Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury. Brain Res. 1337, 8-20 (2010).
- Wu, Q., Comi, T. J., Li, B., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. On-Tissue Derivatization via Electrospray Deposition for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Fatty Acids in Rat Brain Tissues. Anal Chem. 88 (11), 5988-5995 (2016).
- Sturm, R. M., Greer, T., Chen, R., Hensen, B., Li, L. Comparison of NIMS and MALDI platforms for neuropeptide and lipid mass spectrometric imaging in C. borealis brain tissue. Anal Methods. 5 (6), 1623-1628 (2013).
- Kompauer, M., Heiles, S., Spengler, B. Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution. Nat Methods. 14 (1), 90-96 (2017).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).
- Rohner, T. C., Staab, D., Stoeckli, M. MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections. Mech Ageing Dev. 126 (1), 177-185 (2005).
- Li, B., Bhandari, D. R., Rompp, A., Spengler, B. High-resolution MALDI mass spectrometry imaging of gallotannins and monoterpene glucosides in the root of Paeonia lactiflora. Sci Rep. 6, 36074 (2016).
- Spengler, B. Mass spectrometry imaging of biomolecular information. Anal Chem. 87 (1), 64-82 (2015).
- Widlak, P., et al. Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium – application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data. Proteomics. 16 (11-12), 1613-1621 (2016).
